CN1918288A - 表达sars免疫原的载体、含所述载体或其表达产物的组合物、制备和使用方法和实验 - Google Patents

Abstract

本发明论述了SARS(严重急性呼吸道综合症病毒，一种冠状病毒)免疫原、抗原或表位；编码所述免疫原、抗原或表位的核酸分子；含所述核酸分子的载体，例如病毒载体(如杆状病毒载体)、DNA载体(如DNA质粒载体，例如在哺乳动物细胞中表达核酸分子的DNA质粒)；所述免疫原、抗原或表位和载体例如用作活性组分免疫原性、免疫性或疫苗组合物的用途或用于生产抗体如单克隆抗体的用途；以及制备和使用所述免疫原、抗原或表位、载体、抗体的方法，包括激发免疫性或免疫原性或疫苗应答的方法以及实验或诊断试剂盒或诊断方法，还论述了质粒或载体中序列的无缝融合，例如前导序列编码序列和蛋白、表位或免疫原或抗原编码序列的无缝融合。

Description

表达SARS免疫原的载体、含所述载体 或其表达产物的组合物、制备和使用方法和实验

相关申请/通过引用的结合

本申请要求2003年6月20日提交的美国临时申请序号60/480,118和2004年3月19日提交的美国临时申请序号60/554,742的优先权。以上的每个申请，连同其中提及的每个文件以及在其中提及的文件中引用或提及的每个文件一起，都在此通过引用结合到本文中。另外，在本文中提及的每个文件(“申请提及的文件”)和在每个申请提及的文件中提及或引用的每个文件，以及在本文中或在本文提及的文件中或在本文提及的文件中提及的文件中提到的任何产品的任何制造商技术规范、数据表、性状、产品文献、说明书等，都在此通过引用结合到本文中。没有通过引用结合到本文中的文件承认为本发明的先有技术，但通过引用结合到本文中的文件可用于实施本发明。

发明领域

本发明涉及SARS(严重急性呼吸道综合症病毒，一种冠状病毒)免疫原、抗原或表位；编码所述免疫原、抗原或表位的核酸分子；含所述核酸分子的载体，例如病毒载体(如杆状病毒载体)、DNA载体(如DNA质粒载体，例如在哺乳动物细胞中表达核酸分子的DNA质粒)；所述免疫原、抗原或表位和载体例如用作活性组分免疫原性、免疫性或疫苗组合物的用途或用于生产抗体如单克隆抗体的用途；制备和使用所述免疫原、抗原或表位、载体、抗体的方法，包括激发免疫原性或免疫性或疫苗应答的方法，以及实验或诊断试剂盒或诊断方法。本发明还包括在质粒或载体中的序列无缝融合，例如前导序列编码序列和蛋白、表位或免疫原或抗原编码序列的无缝融合。

发明背景

SARS或严重急性呼吸道综合症是一种呼吸道疾病。主要症状包括发烧、干咳、头痛、呼吸短促和呼吸困难。许多被感染患者发展为引起下呼吸道感染的病毒性肺炎。SARS是高度传染性的，通过咳嗽或打喷嚏产生的飞沫或通过其它方法如粪便污染传播。WHO估计SARS的致死率约占全部病例的10-15％。至2003年5月28日为止，全世界确诊8,240例SARS，745人死亡(来源：世界卫生组织)。在老年人中，具体地说是那些60岁或60岁以上的患者，致死率为43％。(Stohr，2003)。目前，对SARS没有特异性疗法，迄今为止也没有可靠的诊断试验。

最近，Koch的SARS冠状病毒与SARS疾病相关的假定得到证实(Fouchier，Kuiken et al.2003)。Fouchier等描述了得自实验性感染的猕猴的证据，SARS相关病毒(SCV)实际上是疾病的病因。较早前，其它研究小组已经描述了由病患宿主分离SCV并在宿主细胞中培养SCV(Drosten，Gunther et al.2003；Ksiazek，Erdman et al.2003)。

冠状病毒感染各种家畜、家禽和宠物。冠状病毒是球形包膜病毒，直径在160-180nm之间，含正链RNA基因组。鉴于其约30,000个碱基的基因组，其被认为是已知最大的RNA病毒。同流感病毒一样，它们能够与冠状病毒家族的其它成员遗传重组。冠状病毒以引起常见感冒而声名狼籍。

冠状病毒形态学示于图10，示意图示于图11。

由冠状病毒引起的SARS已成为了一个难题。证据如下：SARS已被证明在VERO(非洲绿猴肾)细胞中生长，并存在于哺乳动物物种中，例如果子狸和貉，这种因素表明病毒在不确定的将来仍将保持活性，并可增强毒力。

SARS免疫原、抗原和表位；编码所述免疫原、抗原或表位的核酸分子；含所述核酸分子的载体；所述免疫原、抗原或表位和载体例如用作活性组分免疫原性、免疫性或疫苗组合物的用途或用于生产抗体如单克隆抗体的用途；制备和使用所述免疫原、抗原或表位、载体、抗体的方法，包括激发免疫性或免疫原性或疫苗应答的方法以及实验或诊断试剂盒或诊断方法，应当对处理SARS有效。

发明目的/概述

本发明的一个目的可为使用例如杆状病毒表达载体系统克隆和表达、纯化、放大、表征和生产冠状病毒(如SARS)、蛋白(如S-蛋白，例如SARS S-蛋白)；有利地，蛋白，如SARS S蛋白，可用于免疫原性、免疫性或疫苗组合物，或用于产生可用于试剂盒、检查、方法或实验(例如诊断性实验)的单克隆抗体。S蛋白可为全长或截短或融合蛋白。并且，本发明的另一个目的可为提供无缝连接的核酸分子。而且，本发明提供联合组合物，例如含和/或表达一种或多种SARS抗原、表位或免疫原以及另一种病原体(例如流感病毒，如流感病毒HA和/或NA)一种或多种抗原、表位或免疫原的组合物。本发明进一步设想了含和/或表达一个以上分离株的一种或多种SARS抗原、表位或免疫原的组合物，例如至少两个分离株，如3个或更多个分离株，有利地为3个分离株。在这一点上，由于流感疫苗在联合组合物中含和/或表达一种或多种HA和/或NA抗原、表位或免疫原(例如不同毒株的3种HA和/或NA抗原、表位或免疫原，如WHO选定的那些)，有利地，组合物也含有和/或表达一种或多种HA和/或NA抗原、表位或免疫原；再进一步，组合物可有利地含有和/或表达一个以上分离株的SARS蛋白，例如至少两个分离株，如3个或更多个分离株，例如3个分离株。关于SARS抗原、表位或免疫原，尽管本发明设想了S、S1、S2、M、N和E或其部分中的任一种或全部，但S如全长S被认为是有利的。

在本说明书中要指出的是，术语“包含”等可具有美国专利法赋予它们的含义；例如其可指“包括”等。术语如“基本由组成”具有美国专利法赋予它们的含义，例如其允许包含另外的不损害本发明的新特征或基本特征的成分或步骤，即其排除了有损本发明的新特征或基本特征的其它未列举成分或步骤，并排除了先有技术的成分或步骤，所述先有技术例如为本文提及或通过引用结合到本文中的本领域文件，尤其是该文件的目标实际上是确定实施方案可取得专利的，例如相比于先有技术(例如本文提及的或通过引用结合到本文中的文件)为新的、非显而易见的、创造性的。再者，术语“由组成”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。

本发明的其它方面描述于或显见于(并在本发明范围内)以下的公开内容。

附图简述

以下详述以举例方式给出，但无意限制本发明于所描述的任何具体实施方案，其可连同通过引用结合到本文中的附图一起来理解，其中：

图1A、1B显示了SARS S蛋白的氨基酸序列以及SARS S蛋白的编码核苷酸序列，并标出了用于克隆的限制性位点和引物(另参阅图7)；

图2A、2B显示了SARS S ORF的编码核苷酸序列，ATG、AGT和TAA以粗体表示；

图3显示了SARS E蛋白的编码核苷酸序列；

图4显示了SARS E蛋白的氨基酸序列；

图5显示了SARS M蛋白的编码核苷酸序列；

图6显示了SARS M蛋白的氨基酸序列；

图6A显示了SARS N蛋白的编码核酸序列；

图6B显示了SARS N蛋白的氨基酸序列；

图7显示了用于克隆SARS S ORF的引物(也参阅图1)；

图8显示了SARS S ORF的限制性图谱；

图9显示了制备杆状病毒(BEVS或BV)表达载体的流程策略；

图10显示了冠状病毒颗粒；

图11显示了SARS冠状病毒的图示；

图12A、B、C和D显示了S蛋白生产工艺的概述图。

图13A-F显示了序列比对。

图14为三种产生的构建物的图示。

图15是凝胶图象。

图16是凝胶图象。

图17是凝胶图象。

图18是蛋白质印迹图象。

图19是蛋白质印迹图象。

图20是蛋白质印迹图象。

图21是两个蛋白质印迹的图象。

图22是两个蛋白质印迹的图象。

图23是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图24是凝胶图象。

图25是凝胶图象。

图26是凝胶图象。

图27是凝胶图象。

图28是凝胶图象。

图29是凝胶图象。

图30是凝胶图象。

图31是凝胶图象。

图32是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图33是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图34是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图35是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图36是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图37是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图38是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图39是蛋白质印迹图象。

图40是蛋白质印迹图象。

图41是蛋白质印迹图象。

图42是蛋白质印迹图象。

图43是蛋白质印迹图象。

图44是凝胶图象。

图45是蛋白质印迹图象。

图46是蛋白质印迹图象。

图47是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图48是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图49是凝胶图象。

图50是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图51是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图52是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图53是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图54是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图55是凝胶图象。

图56是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图57是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图58是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图59是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图60是条形图。

图61是条形图。

图62是凝胶图象。

图63是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图64是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图65是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图66是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图67是凝胶和蛋白质印迹的图象。

图68是两个凝胶的图象。

图69是两个凝胶的图象。

图70是凝胶图象。

图71是条形图。

图72是折线图。

图73是条形图。

图74是折线图。

图75是条形图。

图76是折线图。

发明详述

如上所述，本发明涉及SARS(严重急性呼吸道综合症病毒，一种冠状病毒)免疫原、抗原或表位；编码所述免疫原、抗原或表位的核酸分子；含所述核酸分子的载体，例如病毒载体(如杆状病毒载体)、DNA载体(如DNA质粒载体，例如在哺乳动物细胞中表达核酸分子的DNA质粒)；所述免疫原、抗原或表位和载体例如用作活性组分免疫原性、免疫性或疫苗组合物的用途或用于生产抗体如单克隆抗体的用途；制备和使用所述免疫原、抗原或表位、载体、抗体的方法，包括激发免疫原性、免疫性或疫苗应答的方法以及实验或诊断试剂盒或诊断方法。

图1A、1B、2A、2B、3-6B提供了SARS免疫原、抗原或表位的编码核酸序列及这种免疫原、抗原或表位的氨基酸序列。图7和8提供了克隆SARS S ORF的引物以及SARS S ORF的限制性图谱。图10和11提供了有关SARS冠状病毒的信息。图9提供了可含有一种或多种SARS免疫原、抗原或表位的编码核酸分子的BEVS表达载体的制备示意图，图12提供了蛋白纯化策略，例如关于SARS S的纯化策略；图13提供了序列比对。因此，说明书通过图提供了本发明涉及的内容，欢迎读者将图和本文的论述结合在一起进行考虑。

申请人由CDC(Dr Erdman，Acting Chief，Respiratory Virus Section，CDCNCID/DVRD/REVB)收到了处于Trizol LS试剂中的#3代SARSCoV 3200300841。该病毒由经蚀斑测定具有4个对数滴度的培养物批次809940制备。将该培养物的裂解物加入到TRIzol试剂中，申请人收到了1ml。申请人使用该裂解物分离RNA并生产cDNA。然后使用cDNA制备重组表达载体，例如病毒表达载体、DNA质粒表达载体，有利地为杆状病毒表达载体，通过用杆状病毒转移质粒和杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)亲代载体共转染昆虫细胞进行基因构建。在该过程中，通过同源重组将基因转移至杆状病毒基因组中，以使S蛋白处于高度表达的AcNPV多角体蛋白启动子控制之下。通过蚀斑测定鉴别重组病毒，并对重组病毒进行分离和纯化。以保持正确S蛋白氨基酸序列的方式进行克隆。可表达具有杆状病毒信号肽的蛋白(参见例如美国专利6,245,532号，以及涉及在重组杆状病毒中表达的一般方法)。

通过感染无血清昆虫细胞(参见例如美国专利6,103,526号)，并收获含高滴度感染性杆状病毒的上清液培养基，制备重组AcNPV-S-蛋白杆状病毒库。参见例如关于细胞高密度培养的装置和方法的PCT公开WO 00/46354，包括用例如杆状病毒的重组病毒感染的细胞。

通过SDS-PAGE/考马斯蓝染色和蛋白质印迹分析来分析重组S蛋白的表达。

测定病毒原液的滴度，使用该病毒原液生产10L细胞沉淀。该沉淀可用于纯化。

全长S-蛋白可由昆虫细胞分泌，并附着至细胞膜表面。使用温和变性条件溶解S蛋白。然后使用柱层析纯化蛋白，以去除污染蛋白和核酸。

N-末端测序证实其为真正的全长抗原。另外，S蛋白的生物活性可基于其凝集小鼠红细胞的能力进行评价。如上所述，通过几次低感染复数的传代由单个病毒蚀斑繁殖重组病毒，产生大量的接种物，以等份将其储存在液氮中作为工作病毒库(WVB)。检查WVB是否无细菌、真菌和其它外来物，包括污染的野生型或其它重组杆状病毒。通过DNA印迹分析纯化杆状病毒DNA的插入片段或通过蛋白质印迹分析感染昆虫细胞中生产的重组蛋白来确定身份。

关于截短的S蛋白，申请人的截短形式S蛋白可没有S蛋白的胞质和跨膜部分，例如包含或基本由或由S1或S2区组成。申请人的构建物包括编码S蛋白的构建物，其含有his-tag，以利于纯化研究。似乎S蛋白以三聚体表达。而且，可按照本发明表达M和/或N和/或E蛋白或其部分。

鉴定实验包括SDS-PAGE、蛋白质印迹分析、氨基酸分析和N-端测序。这些实验确认真正的全长抗原。无菌实验可按照21 CFR610.12进行。纯度实验可按照21 CFR 610.13进行，该实验检测S蛋白抗原的纯度，并检测热源性物质的存在。使用蛋白的标准化学实验检测半成品中存在的S蛋白抗原的量，并用该量计算最终容器装填所需的稀释度。

S蛋白是冠状病毒疫苗的候选抗原，因为其诱导病毒中和(VN)抗体。S蛋白(刺突糖蛋白，一种表面蛋白)似乎是SARS的主抗原，对通过ACE2受体结合的感染很关键。另外，还描述了血凝素-酯酶(HE)蛋白刺激VN和HE抑制性抗体的产生(Saif 1993)，但该蛋白在SCV中不存在。此外，还描述了M蛋白在补体存在下诱导中和病毒的抗体(Saif 1993)。病毒体的抗原特异性可通过中和实验(S和HE)或补体结合实验(M)确定。诱导的保护性免疫为和补体无关的中和抗体形式。

将含传染性胃肠炎病毒(TGEV)各种片段的S蛋白全长编码基因在杆状病毒载体中克隆和表达。用重组病毒感染的细胞免疫小猪，结果表明，S蛋白的氨基末端半部分包含全部4个主要抗原位点(A、B、C和D)，诱导VN抗体滴度(Tuboly，Nagy et al.1994)。可使用杆状病毒表达载体生产人冠状病毒HCoV-229E的可溶性截短S蛋白，并可鉴别和定位在全长基因N-端547个氨基酸中刺突糖蛋白的受体结合域(Bonavia，Zelus et al.2003)。

在猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的情况下，用在痘苗病毒载体中克隆和表达的S蛋白接种与抗体介导的病毒感染增强相关(Vennema，de Groot et al.1990；Vennema，de Groot et al.1990；Klepfer，Reed et al.1995)。另外，在用灭活或活FIP病毒对猫进行抗FIV免疫后也报告了相似的现象(Scott 1987)。据报道，S蛋白的特异性抗原位点与这种抗体依赖性增强有关(Corapi，Darteil et al.1995)。

但是，Paoletti在美国专利5,858,373号中报告了减毒载体如NYVAC、ALVAC表达FIPV抗原如S、S1、S2、S3、M、N、M+N的用途。因此，相信所谓的病毒感染增强的结果可归因于先前研究中使用的载体特性，或者可能是猫特有的。因此，本发明设想了的减毒或非复制型载体(在哺乳动物细胞中)，例如DNA质粒、MVA、ALVAC、NYVAC或使用哺乳动物启动子如CMV启动子或SV40启动子的杆状病毒，以在体内表达一种或多种SARS蛋白(例如S和/或S1和/或S2和/或E和/或M和/或N)。可参考本文中提及的文件来构建和使用这种载体。但一般来说，Paoletti 373专利中的教导可用于构建和使用痘病毒，例如MVA ALVAC和NYVAC SARS载体；可依靠Audonnet的美国专利6,228,846和6,159,477中有关DNA质粒的教导，可使用它们构建和使用包含和体内表达SARS蛋白的DNA质粒。一般而言，用于疫苗或免疫组合物的质粒可包含抗原编码DNA(例如SARS S、S1、S2、E、M、N或其组合)，其有效连接至控制宿主细胞(例如哺乳动物细胞)表达或表达和分泌抗原的调节序列；例如，从上游到下游，启动子DNA，例如哺乳动物病毒启动子(例如CMV启动子，如hCMV或mCMV启动子，如立即早期启动子，或SV40启动子，参见本文提及或结合到本文中的有关可用启动子的文件)；用于分泌的真核前导肽DNA(例如用于组织纤溶酶原激活物的前导肽DNA，参见本文提及或结合到本文中的有关可用前导肽的文件)；抗原DNA(SARS S和/或S1和/或S2和/或E和/或M)；以及终止子编码DNA(例如牛生长激素编码基因的3′UTR转录终止子或bGH聚腺苷酸，参见本文提及或结合到本文中的文件)。组合物可包含不止一种质粒和载体，由此每种载体都包含和表达不同的SARS蛋白或抗原或表位。还要提到Wasmoen的美国专利5,849,303号和Dale的美国专利5,811,104号，其内容可能有用。可能有与属于组1的冠状病毒相反的未裂解SARS S-蛋白，使得全长S在由质粒、载体或重组病毒制备物表达时或在亚单位制剂中可能比S1和S2更有利。

而且，本发明设想了包含或基本由或由一种或多种分离的SARS抗原、免疫原或表位(例如S、S1、S2、E、M、N中的一种或多种，如N1、其组合、S或S1和/或S+E和/或M和/或N，如N1)组成的组合物，例如免疫原性、免疫性或疫苗组合物。

甚至更进一步，本发明设想了含SARS蛋白和/或表达SARS蛋白的载体和/或表达SARS蛋白的质粒的组合物，这些SARS蛋白来自不止一个分离株，例如来自两个或两个以上的分离株，例如来自三个不同的分离株。有利地，组合物含三个不同分离株的S蛋白或其部分(例如S1或S2)，或者含表达三个不同分离株的S蛋白或其部分的载体或质粒。应当选择分离株，以使针对组合物的免疫应答最大化。

本发明设想了各种给予途径形式的组合物。给予的有效剂量和途径由已知因素确定，例如患者或受试者的年龄、性别、体重，或者通过已知的且不需要不当实验的其它筛选方法来确定。每种活性成分(抗原、免疫原或表位)的剂量可为本文提及或通过引用结合的文件中的剂量，和/或可在1微克或几微克至数百微克或数千微克的范围内，例如1μg至1mg。重组体或载体可以合适的量给予，以获得对应于本文和/或本文提及的文件中所述剂量的体内表达。例如，病毒悬浮液的合适范围可根据经验确定。本发明的病毒载体或重组体可以每剂(例如约2ml)约至少10³pfu的量给予受试者或患者或者感染或转染入细胞中，更优选约10⁴pfu至约10¹⁰pfu，例如约10⁵pfu至约10⁹pfu，例如约10⁶pfu至约10⁸pfu。再者，如果不止一种基因产物由不止一种重组体表达，则每种重组体都可以这些量给予；或者可以使重组体的总和含这些量的方式联合给予每种重组体。在用于本发明的质粒组合物中，剂量可如本文提及的文件或如本文所述。例如，质粒组合物中每种质粒DNA的合适量可为1μg至2mg，优选为50μg至1mg。技术人员可参考本文提及的有关DNA质粒载体的文件来确定本发明DNA质粒载体组合物的其它合适剂量，而不需要不当试验。但是，可通过例如血清抗体滴定(例如ELISA)和/或血清中和实验分析和/或在实验动物中进行接种攻击评价的方法，确定激发出适宜免疫应答的组合物剂量、其中组分的浓度和给予组合物的时机。由技术人员的知识、本说明书和本文提及的文件，这种确定不需要不当实验。再者，依次给予的时间(本说明书设想依次给予本发明的组合物，如其中相同和不同的组合物例如以初免-加强方案依次给予；例如可给予载体，此后给予分离的蛋白组合物，或相反)同样可用由本说明书和本领域知识能确定的方法来确定，无需不当实验。实际上，关于亚单位制剂，有利地是给予两剂，每剂平均约50μg SARS蛋白。

另外，本发明设想了联合或混合的组合物；即含其它病原体(例如流感病毒)的抗原或表位或免疫原(如流感病毒HA、NA或M2或其部分)的组合物，和/或含表达其它病原体(例如流感病毒)的其它抗原或表位或免疫原(如流感病毒HA或NA或M2)的载体或质粒或重组体的组合物。有利的组合物可含一种或多种SARS蛋白，例如S蛋白或其部分，例如如上所述的来自不同分离株(例如三个不同分离株)的S1、S2或其表位，以及流感病毒HA和/或NA或其表位部分，例如一个或多个毒株(例如三个毒株)的流感病毒HA或其部分和/或一个或多个毒株(例如三个毒株)的流感病毒NA或其部分(例如WHO每年选择的用于年度三价流感疫苗的流感病毒株)。这种联合组合物中HA和NA的量可为本文提及的文件中的量，以及可用流感疫苗制剂中的量。同样，载体或质粒或重组病毒组合物可体内表达这种SARS和流感病毒蛋白。SARS和流感病毒可以此方式配制在一致制剂中，尤其是在SARS可和流感一样要求进行年度给予或免疫或疫苗接种时。当然，本发明组合物可包含单独的或进一步与其它病原体的其它抗原、表位或免疫原(例如本文讨论的流感病毒HA和/或NA和/或M2)组合的全部SARS M、S、N和E(例如来自不同分离株，如3或4个不同分离株)，和/或体内表达所述SARS和/或其它抗原、表位或免疫原(例如得自1、2、3、4或更多个不同分离株的流感病毒HA和/或NA和/或M2)的载体、质粒和/或重组病毒。而且，在本发明疫苗中可使用蛋白体，包括通过Jones et al.(Jones，Allard et al.2003)描述的方法。

这种联合组合物可以抗流感制剂使用的形式(例如通过注射、鼻内(粘膜)等)给予、以本文描述的用于本文组合物的形式给予，以及以本文提及的和通过引用结合到本文中的文件中的形式给予。

另外或或者，存在于组合物中和/或由本发明组合物中的载体表达的其它抗原、表位或免疫原可来自肺炎，例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，如PspA、PspC或抗肺炎制剂中通常使用的23种抗原或表位中的任一种；参见例如美国专利No.6,500,613、6,232,116、6,231,870、6,042,838、6,027,734、6,004,802、5,997,882、5,980,909、5,965,400、5,965,141、5,955,089、5,871,943、5,856,170、5,804,193、5,753,463、5,476,929和其中提及的文件。肺炎球菌抗原、表位或免疫原可如本文提及的或通过引用结合到本文中的文件所述或在已知制剂中的形式存在或表达；并且，这种联合组合物可以抗肺炎制剂使用的形式(例如通过注射、鼻内(粘膜)、口服等)给予、以本文描述的用于本文组合物的形式给予，以及以本文提及的和通过引用结合到本文中的文件中的形式给予。本发明的组合物可用于胃肠外或粘膜给予，优选通过皮内或肌内途径给予。当使用粘膜给予时，可使用口、鼻或眼途径给予。本发明还设想了局部给予；参见例如Tang的美国专利No.6,348,540和美国专利申请No.20030045492，以及美国专利No.5,910,306和5,980,898，可参考其中关于局部给予载体或质粒组合物的内容，以及其中关于含免疫原、抗原或表位的组合物的内容。

在这种组合物中，免疫原、抗原或表位或载体或质粒可为与合适载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)和/或佐剂的混合物。组合物还可以被冻干或冷冻。组合物可包含辅助物质，例如pH缓冲液、佐剂、防腐剂、用于粘膜途径的聚合物赋形剂等，由给予途径和需要剂型而定。可参考通过引用结合到本文中的标准教科书如“REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCE”(Gennaro1985)、“HAND BOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS”(Rowe，Sheskey et al.2003)制备合适的制剂，无需不当实验。合适的剂量还可基于本文的内容和本文提及的文件而定。

佐剂是增强对免疫原的免疫应答的物质。

昆虫细胞或其组分可为佐剂；参见例如美国专利No.6,224,882。因此，尽管期望90％或90％以上的纯度，例如95％或95％以上的纯度，但也可以使用含昆虫细胞或其组分的“自身佐剂性”组合物。

佐剂可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷如Quil A、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。具体地说，乳剂可基于以下物质：轻质液体石蜡油(欧洲药典规格)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特别是异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；含线性烷基的酸酯或醇酯，更具体地说是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂联用形成乳浊液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，具体地说为可选地被乙氧基化的山梨聚糖酯、二缩甘露醇酯(例如甘露醇酐油酸酯)、甘油酯、聚甘油酯、丙二醇酯以及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯；以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，具体地说是Pluronic^RTM产品，尤其是L121(Hunter.1995)。例如，可以使用在(Powell，Newman et al.1995)的第147页上描述的SPT乳浊液以及该书第183页上描述的乳浊液MF59。例如，以下述方式制备含佐剂的组合物：利用乳化叶轮式混合器，将含免疫原的67％v/v水相乳化在2.3％w/v甘露醇酐油酸酯、2.6％w/v11 EO(环氧乙烷)乙氧基化的油酸和28.1％v/v轻质液体石蜡油(欧洲药典规格)中。制备乳浊液的替代方法包括：将5％w/v角鲨烷、2.5％w/v Pluronic^RTM L121、20 EO乙氧基化的0.2％w/v油酸酯和山梨醇酐酯、92.3％v/v含免疫原的水相的混合物通过高压匀浆器乳化。

还可以用合成聚合物(例如乳酸和乙醇酸的均聚物和共聚物，其已用于生产包囊化免疫原的微球体(Eldridge，Staas et al.1991)，例如生物可降解微球体)和细胞因子配制，所述细胞因子例如为IL-2和IL-12(参见例如美国专利No.5,334,379)、GMCSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；一般参见美国专利No.5,602,007、4,999,291和5,641,663，尤其也参见Clark and Grant(Clark and Kamen 1987；Grantand Heel 1992)。某些佐剂可以和免疫原和/或表位一起在体内表达；例如细胞因子GMCSF。

佐剂的其它实例为选自以下的化合物：丙烯酸或异丁烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或异丁烯酸的交联聚合物，尤其是与糖或多元醇的多烯醚交联。已知这些化合物的名称为Carbomer(Pharmeuropa 1996)。本领域技术人员还可参考美国专利No.2,909,462(通过引用结合到本文中)，该专利描述了这种与多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，其中多羟基化化合物具有3个羟基，优选不超过8个羟基，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选的基团为包含2-4个碳原子的不饱和脂肪族基团，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯化不饱和基团。不饱和基团自身可包含其它取代基，例如甲基。以名称Carbopol出售的产品(BF Goodrich，Ohio，USA)特别合适。其与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。在它们当中，可值得一提的是Carbopol 974P、934P和971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，优选共聚物EMA(Monsanto)，其为马来酸酐和乙烯的线性或交联(例如与二乙烯基醚交联)共聚物。可参考文献(Regelson，Kuhar etal.1960)，其通过引用结合到本文中。这些聚合物溶解在水中产生酸性溶液，将溶液中和，优选中和为生理pH，以便获得掺入到免疫原性、免疫性或疫苗组合物自身中的佐剂溶液。然后，聚合物中的羧基部分地为COO^-形式。优选地，本发明的佐剂溶液，尤其是Carbomer，在蒸馏水中制备，优选在NaCl存在下制备，获得的溶液为酸性pH。将该母液同时分部加入至需要量(以获得所需的终浓度)或其基本部分的含NaCl水(优选生理盐水(NaCl 9g/l))中进行稀释，优选用NaOH同时或随后进行中和(pH 7.3-7.4)。该生理pH的溶液在其与疫苗(尤其是可以冻干、液体或冷冻形式储存的疫苗)混合时使用。最终疫苗组合物中的聚合物浓度可为0.01％至2％w/v，例如为0.06-1％w/v，如0.1-0.6％w/v。分几步

DNA或DNA质粒制剂可与阳离子脂质一起配制，或配制在阳离子脂质中；关于阳离子脂质以及佐剂，还要提及Loosmore的美国专利申请2003/0104008。

另外，如前所述，昆虫细胞及其组分可为佐剂；参见例如美国专利No.6,224,882。因此，尽管期望90％或90％以上的纯度，例如95％或95％以上的纯度，但也可以使用含昆虫细胞或其组分的“自身佐剂性”组合物。

根据本说明书和本领域的知识，技术人员可选择合适的佐剂，如果有需要，技术人员可选择用于本发明的免疫原性、免疫性或疫苗组合物的佐剂量，无需不当实验。

本发明还设想了口服或粘膜给予的SARS蛋白或表位，或包含和/或表达SARS蛋白或表位的载体，或包含SARS蛋白或其表达载体的组合物(或单独或还包含或表达其它抗原的抗原、表位或免疫原)。这种组合物可如美国专利No.6,500,613、6,232,116、6,231,870、6,042,838、6,027,734、6,004,802以及其中提及的文件所述配制。一般来说，口服给予的组合物可含调味剂，例如药学可接受的调味剂，或者可在食物或饵中，例如如果其用于野外或动物或儿童。粘膜给予优选鼻内实施，例如给予嗅粘膜；因此组合物可通过气溶胶给予，例如经喷雾器给予。鼻内给予还可以为宿主提供抗肺部感染的保护，以及为宿主提供抗由肺部感染开始的感染的保护。但是，粘膜给予还可包括呼吸道粘膜、齿龈粘膜或牙槽粘膜。因此，可经舌或舌下给予，或给予至口腔或呼吸道；但优选鼻内给予。本发明的组合物，尤其是用于鼻内给予的组合物，可便利地以缓冲至选定pH的等渗水溶液、悬浮液或粘性组合物形式提供。粘性组合物可为凝胶、洗剂、软膏、乳剂等形式，通常含有足量的增稠剂，以使粘度为约2,500至6,500cps，但可使用甚至高达10,000cps粘度的更粘稠组合物。粘性组合物的粘度优选为2,500至5,000cps，因为高于该范围组合物更难以给予。液体喷雾剂和滴剂一般比凝胶和其它粘性组合物更易于制备。另外，它们可稍微更便利地给予，尤其是在多剂情况下。另一方面，可在合适的粘度范围内配制粘性组合物，以提供更长的粘膜(如鼻粘膜)接触时间。可使用药学可接受的增稠剂将组合物粘度保持在选择的水平。优选甲基纤维素，因为其容易获得且经济，并易于配伍。其它合适增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、Carbomer等。优选的增稠剂浓度由选择的物质所定。重要之处在于使用量可达到选定粘度。粘性组合物一般通过加入所述增稠剂由溶液制备。在本发明范围内的组合物可含有湿润剂，以抑制粘膜干燥，并防止刺激。可使用任何各种药学可接受的湿润剂，包括例如山梨醇、丙二醇或甘油。同增稠剂一样，浓度随选择的物质而变，尽管这些物质存在与否或其浓度不是本发明的基本特征。可使用药学可接受的表面活性剂增强粘膜吸收，尤其是鼻粘膜的吸收。通常对组合物有用的表面活性剂包括山梨醇酐脂肪酸偏酯的聚氧乙烯衍生物，如Tween 80、Polyoxyl 40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯和辛苯昔醇。通常的浓度为总重的1％至10％。可使用药学可接受的防腐剂增加组合物的贮藏期限。苄醇可能合适，但还可使用各种防腐剂，包括例如对羟基苯甲酸酯类、硫柳汞、氯丁醇或苯扎氯铵。防腐剂的合适浓度为总重的0.02％至2％，但其可根据选择的物质而有明显变化。含免疫原性组合物的疫苗可制备为吸入剂、喷雾剂等(例如鼻喷雾剂、气溶胶喷雾剂或喷雾器等)，例如可制备为液体溶液或乳浊液等。气溶胶喷雾制剂可处于具有合适喷射剂(如烃喷射剂)的压力容器中。喷雾分配器可定量分配或分配具有特定颗粒或液滴大小的剂量。喷雾分配器可商购，例如由Valois of America，Inc.，Connecticut购买。鼻喷雾分配器通常由柔韧性材料如塑料制作，可在挤压作用下产生喷雾来分配。抗炎药如“Vanceril”可商购，以口或鼻气溶胶形式粘膜给予；抗炎药“Vancerase”可商购，以喷雾分配器鼻内给予；感冒药如“Dristan”可商购，以鼻喷雾(挤压)分配器给予(以使读者了解气溶胶、喷雾器和挤压分配器是已知并可获得的)；甚至是抗流感疫苗也可以鼻内给予形式提供，例如通过气溶胶或烟雾器(MedImume生产)给予，本发明的组合物可以类似方式分配。

关于本发明涉及的截短SARS蛋白或SARS蛋白表位，人们可根据本文公开的内容和本领域的知识，无需不当实验，以及另外提供的以下方面：一般来说如下产生免疫应答：仅在蛋白被切割为较小肽并在位于另一种细胞表面上称为“主要组织相容性复合物”(MHC)的复合物中被提呈时T细胞才识别蛋白，确定合适的截短SARS蛋白或表位。有两类MHC复合物，I类和II类，每类都由许多不同的等位基因组成。不同患者具有不同类型的MHC复合物等位基因，他们被说成是具有“不同的HLA型”。

MHC I类复合物实际上存在于几乎每种细胞中，并提呈细胞内部产生的蛋白的肽。因此，MHC I类复合物用于杀死已被病毒感染的细胞或由于癌基因表达而变成癌型的细胞。在其表面上具有称为CD4的蛋白的T细胞结合MHC I类细胞，并分泌淋巴因子。淋巴因子刺激应答；细胞到达并杀死病毒感染的细胞。

MHC II类复合物仅存在于抗原提呈细胞上，用于提呈已被抗原提呈细胞内吞的循环病原体的肽。具有称为CD8的蛋白的T细胞结合MHC II类细胞，并通过裂解性颗粒的胞吐作用杀死细胞。

确定蛋白是否含刺激T细胞应答的目的表位的一些指导原则包括：肽长度—肽应当至少为8或9个氨基酸长，以适于MHC I类复合物，以及至少为13-25个氨基酸长，以适于MHC II类复合物。该长度为肽结合MHC复合物的最小值。优选肽比这些长度更长，因为细胞可切断表达的肽。肽应当含合适的锚定基序，以使其能够以足够高的特异性结合各种I类和II类分子以产生免疫应答(Engelhard1994；Bocchia，Wentworth et al.1995)。这可通过比较目的蛋白序列和公开的与MHC分子结合的肽结构进行，无需不当实验。T细胞受体识别的蛋白表位为酶降解蛋白分子产生的肽，其与MHC I类或II类分子结合被提呈至细胞表面。

而且，技术人员可通过对比蛋白序列和列于蛋白数据库的序列确定目的表位。基本上没有或没有同源性的蛋白区域是该蛋白表位的较好选择，因此可用于疫苗或免疫组合物中。应避免与广泛存在于活细胞中的序列具有较大同源性的区域。因此，对于SARS的S、S1、S2、E、N和M来说，技术人员可对比这些蛋白和其它冠状病毒的相似蛋白，并使用SARS蛋白中不相似的区域作为表位区域。在这一点上，作为实施例，附图13显示了比对情况。

再进一步，另一种方法是仅生产或表达部分目的蛋白，生产针对这部分目的蛋白的单克隆抗体，然后确定这些抗体是否抑制蛋白来源病原体的体外生长。技术人员可使用本说明书和本领域提出的其它指引生产或表达部分目的蛋白，用于分析其抗体是否抑制体外生长。

例如，技术人员可通过以下方法生产部分目的蛋白：选择8-9或13-25个氨基酸长度的蛋白部分、选择亲水区、根据抗原(全长)-抗体复合物的X-射线数据选择显示结合的部分、选择与其它蛋白的序列不同的区域、选择潜在的HLA锚定结合基序，或这些方法或本领域已知的其它方法的任意组合。

抗体识别的表位在蛋白表面上表达。为确定最可能刺激抗体应答的蛋白区域，本领域技术人员优选可使用上述的通用方法或本领域已知的其它作图方法进行表位作图。

因此，无需不当实验来确定SARS蛋白表位。

全长SARS蛋白或截短的部分SARS蛋白如表位可表达为融合蛋白。通常融合配偶体(与表位或截短的或全长SARS蛋白融合的融合蛋白部分)增强分泌和/或免疫原性。正如所述，杆状病毒信号序列可与SARS蛋白融合来增强分泌。还描述了几种方法用于化学或酶促切割融合蛋白，这些方法提供了获得所需肽的有效策略(参见例如美国专利No.6,143,872、6,451,769)。常用的融合系统为具有IgG亲和性并已用于产生短肽抗体的葡萄球菌A蛋白融合系统和合成ZZ变异体、谷胱甘肽S转移酶融合系统、β-半乳糖苷酶融合系统和trpE融合系统。这些系统中有几个可作为含载体、纯化组分和详细说明书的试剂盒形式商购。简而言之，获得短限定表位的方法包括合成对应的具有合适末端的寡脱氧核苷酸，以利于在融合配偶体的翻译框内导入目的表达载体中。人们可使用与SARS蛋白或其截短部分或其表位融合的脂化布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)OspA来增强免疫原性。同样，T-细胞表位可与SARS蛋白或其截短部分或其表位融合，以增强免疫原性。融合蛋白可具有全部或部分SARS蛋白(如S或S1或S2或S蛋白的表位区域，或M或E或其部分)和全部或部分流感病毒血凝素或神经氨酸酶，或M2或其表位部分，作为融合配偶体，或者可具有在美国专利No.5,858,369或本文提及的其它专利中列举的融合配偶体。

本发明的组合物可激发免疫性、免疫原性或保护性免疫应答。免疫原性(或免疫性)组合物激发局部或全身的免疫应答。疫苗组合物激发局部或全身的保护性反应。术语“免疫组合物”和“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”(因为前两个术语可为保护性组合物)。免疫应答可用于获得抗体，包括单克隆抗体。单克隆抗体为杂交瘤细胞产生的免疫球蛋白。单克隆抗体与单个抗原决定蔟反应，提供比常规的血清源抗体更强的特异性。而且，筛选大量的单克隆抗体使得有可能选择出具有所需特异性、抗体亲抗原性和同种型的单个抗体。杂交瘤细胞系提供了化学性质相同的抗体的稳定廉价来源，这种抗体的制备可容易地被标准化。生产单克隆抗体的方法对本领域普通技术人员来说是众所周知的，例如通过引用结合到本文中的美国专利No.4,196,265。单克隆抗体的用途是已知的。一种这种用途是用于诊断方法，例如通过引用结合到本文中的美国专利No.4,376,110。单克隆抗体还用于通过免疫吸附层析回收物料，例如通过引用结合到本文中的(Milstein 1980)。抗SARS蛋白如S、S1或S2的单克隆抗体可在试剂盒、检查、方法和实验中用于诊断或用于测定样品(例如血清或体液或分泌物或排泄物)中是否存在SARS或其病原体。

可使用杂交瘤技术(Kohler and Milstein 1975；Kohler，Howe et al.1976；Kohler and Milstein 1976；Hammerling 1981)制备单克隆抗体。一般来说，这种方法包括用SARS抗原、表位或免疫原，例如SARSM、N、E、S，如S蛋白，或更优选地用表达所述抗原、表位或免疫原的细胞，免疫接种动物(优选小鼠)。适宜的细胞由于其结合抗SARS蛋白抗体的能力而可以被识别。这种细胞可在任何合适的组织培养基中培养；但是，优选在补加10％胎牛血清(在约56℃灭活)并补加约10μg/l非必需氨基酸、约1,000U/ml青霉素和约100μg/ml链霉素的Earle改良型Eagle培养基中培养细胞。提取这些小鼠的脾细胞，并将其与合适的骨髓瘤细胞系融合。任何合适的骨髓瘤细胞系都可以用于本发明；但优选使用可得自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Manassas，Va)的亲代骨髓瘤细胞系(SP2O)。融合后，将获得的杂交瘤细胞选择性地保持在HAT培养基中，然后通过Wands和同事(Wands and Zurawski 1981)所述的有限稀释克隆。接着对通过这种选择获得的杂交瘤细胞进行测定，以鉴别分泌能结合目的抗原的抗体的克隆。

或者，可通过使用抗独特型抗体，以两步法生产能够结合SARS抗原、表位或免疫原(例如SARS S蛋白)的其它抗体。这种方法利用了以下事实：抗体自身为抗原，因此有可能获得结合二抗的抗体。按照该方法，使用蛋白-特异性抗体免疫动物，优选为小鼠。然后使用这种动物的脾细胞生产杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞，以鉴别生产抗体的克隆，其中所述抗体结合蛋白-特异性抗体的能力可被蛋白抗原阻断。这种抗体包含特异性抗体的抗独特型抗体，可用于免疫动物，以再诱导蛋白-特异性抗体形成。

要认识到，本发明抗体的Fab、F(ab′)₂和其它片段可以本发明抗体的方式使用。

因此，本发明涉及测定样品中是否存在SARS的方法，其包括使样品和SARS蛋白(例如SARS S、S1、S2、E、N或M，有利地为S、S1和S2，更有利地为S)的特异性单克隆抗体接触，并检测是否存在与单克隆抗体的结合。为检测结合，可标记单克隆抗体。

在实施本发明时，全长S蛋白被认为是有优势的，因为其诱导VN抗体，而且要指出的是，可使用截短形式的S蛋白，因为其具有相似的能力。杆状病毒表达载体系统(BEVS)利于生产S蛋白(Tuboly，Nagy et al.1994；Bonavia，Zelus et al.2003)。

杆状病毒可作为高效的真核表达载体用来在培养的昆虫细胞中生产重组蛋白(Summers and Smith 1987)。杆状病毒是杆状病毒科家族中的DNA病毒，宿主范围狭窄，主要限于昆虫的鳞翅目种(蝴蝶和蛾)。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)是杆状病毒的原型毒株，在易感的培养昆虫细胞中有效复制。AcNPV具有约130,000个碱基对的双链闭环DNA基因组，其宿主范围、分子生物学和遗传学已充分表征。

杆状病毒在感染细胞核中形成大蛋白晶体包涵体。被称作多角体蛋白的单个多肽占这些包涵体蛋白量的约95％。多角体蛋白基因在AcNPV病毒基因组中以单拷贝存在。因为多角体蛋白基因对于培养细胞中的病毒复制不是必需的，所以可容易地将其修饰以表达外源基因(Smith 1983)。通过同源重组杆状病毒基因组DNA和含目的基因序列的嵌合质粒构建表达外源基因的重组杆状病毒。可利用重组病毒的不同蚀斑形态学对其进行检测；含多角体蛋白基因的病毒产生的蚀斑外观浑浊，而多角体蛋白基因被外源基因取代的重组病毒产生的蚀斑澄清。

图9显示了构建表达外源蛋白的重组杆状病毒的一般流程。使用标准克隆技术将外源基因编码序列插入到被称为杆状病毒转移质粒的质粒中。转移质粒在多克隆位点上游含有多角体蛋白启动子，其以天然位于AcNPV中的多角体蛋白基因座侧翼的序列为界。转移质粒与杆状病毒基因组DNA共转染，该杆状病毒基因组DNA已用酶线性化，去除了多角体蛋白基因，并去除了多角体蛋白基因座下游的部分必须基因，使得该基因组DNA无感染性。

转移质粒含通过线性化基因组DNA而除去的部分必须基因；因此，转移质粒和线性化基因组DNA之间的同源重组拯救了病毒。重组病毒相对非重组病毒的回收效率接近100％。该处理产生的蚀斑几乎同质，免除了多轮蚀斑纯化的需要。因为线性化前的初始杆状病毒基因组DNA含多角体蛋白基因，所以非重组病毒蚀斑(浑浊)可与重组病毒蚀斑(澄清蚀斑)区分开来。

杆状病毒表达载体系统(BEVS)提供了一种极好的方法，用于以各种理由开发理想的亚单位疫苗、免疫原性或免疫组合物。生产杆状病毒表达的重组蛋白接近8周。这在大流行威胁时特别关键。杆状病毒是安全的，因为其宿主范围狭窄，限于一些分类学相关的昆虫物种。还没有发现杆状病毒在哺乳动物细胞中复制(Hartig，Chapmanet al.1989；Hartig，Cardon et al.1991)。另外，已知几乎没有生物能够在昆虫细胞和哺乳动物细胞两者中复制，这降低了在由昆虫细胞培养物纯化的蛋白批量制备疫苗时污染外来物的可能性。最后，因为杆状病毒感染的昆虫是非叮咬型的，所以人类一般对昆虫细胞蛋白预先不存在免疫性，而这种免疫性可引起对疫苗制剂中痕量昆虫细胞蛋白的变态反应。

杆状病毒表达的蛋白实际上似乎在所有情况下都被正确地折叠和加工，甚至在蛋白相当大时也如此。这与在原核生物和低等真核生物系统中表达的蛋白不同。另外，昆虫细胞能够进行许多存在于哺乳动物细胞中的翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、酰化和酰胺化。昆虫细胞中的糖基化似乎使用和哺乳动物细胞所使用机制相似的机制，即各自修饰具体蛋白的相同残基。尽管加入到昆虫细胞蛋白中的糖部分看起来远没有哺乳动物细胞表达的其对应物复杂，但昆虫细胞表达的糖蛋白和哺乳动物细胞表达的糖蛋白的免疫原性似乎是相同的。最后，杆状病毒表达的蛋白通常可自组装成天然蛋白一般采取的高级结构。

BEVS系统的一个元件是极高活性的多角体蛋白启动子，其驱动下游插入的外源蛋白表达。(尽管对于哺乳动物细胞中的表达，该启动子可用哺乳动物病毒启动子取代，例如SV40启动子或CMV启动子，例如CMV-EI，如hCMV-EI或mCMV-EI；也参见有关截短的CMV启动子的美国专利No.6,156,567)。使用杆状病毒表达载体所报告的最高水平为总细胞蛋白的25-50％，相当于每升昆虫细胞11克蛋白。但是，BEVS系统中的外源蛋白产量通常为10-500mg/l。在对比不同真核表达系统时，BEVS系统在总蛋白产量上通常好于其它表达系统。尽管一般在哺乳动物细胞中表达的蛋白预计可在哺乳动物系统中更真实地但不是绝对地生产，但在这些系统中的表达水平通常远低于在杆状病毒系统中的表达水平。因此，可用BEVS系统以显著较低的成本生产蛋白，同时保持真实结构的关键元件。

在特别有优势的实施方案中，使用在识别的限制位点远处切割的限制酶制备载体，例如生产重组病毒的转移载体，如重组痘病毒或杆状病毒；该技术是通用的载体制备方法，该技术的通用性被认为是本发明的另一方面。例如，以同源重组技术制备载体如质粒。该载体可包含处于要生产的重组病毒中的外源核酸分子，该载体通常用于转染也用合适病毒感染或转染的细胞，使得在细胞中发生重组或交换事件，以生产含外源核酸分子的病毒。本发明设想了制备具有限制性位点的载体，例如质粒；用在限制位点远处切割的酶以此切割方式(酶在远处切割)切割载体，由此将限制性位点由载体中切除，而载体具有独特的粘性末端；在分开的反应中，进行聚合酶链反应或其它扩增反应，由此使限制位点成为反应扩增产物的一部分；用远处切割限制酶(II型)消化扩增产物，由此使扩增产物具有独特的粘性末端；连接具有独特粘性末端的载体和具有独特粘性末端的扩增产物。以此方式可避免外来的间插核酸分子。例如，该技术可将编码前导序列的核酸分子(例如前述杆状病毒前导序列的编码序列)连接至编码抗原、表位或免疫原(例如SARS S、S1、S2、E、M、N、其组合或其表位)的核酸分子。相信这种远处切割酶以此方式的用途迄今为止还没有被公开或提出。这种酶被称为SapI，可由市场上购买。在SARS S蛋白编码序列的情况下，申请人同时使用了PCR扩增和针对特定问题的独特的、非显而易见的解决方法。例如，对于SARS S，使用SapI II型限制酶是有效的。这使得可以将需要的序列克隆入选择的载体(例如可由Protein Sciences Corporation获得的pPSC12，一种杆状病毒转移载体)，而不加入单个核苷酸。大多数克隆策略包括加入限制性位点，产生的核苷酸将组成所需序列5′和3′端的限制性位点。SapI的使用避免了这一点。另外，所需的SARS SDNA序列在其中包含两个天然SapI限制位点。因此，为了在最末端使用SapI，将DNA序列分成小片段，其或者含有SapI位点(在中间)，或者不含SapI位点(接近末端)，将后者组装成完整的所需序列。因此，对SARS S蛋白使用这种“无缝”方法是非常有创造力的。

以下以说明方式给出的实施例进一步描述了本发明，由这些实施例可更好地理解本发明及其具有的许多优势。

实施例

实施例1：将SARS S蛋白编码序列克隆入杆状病毒转移质粒

申请人由Dr Erdman，Acting Chief，Respiratory Virus Section，CDC/NCID/DVRD/REVB获得了处于Trizol LS试剂中的#3代SARSCoV 3200300841。该病毒由在蚀斑测定中具有4log₁₀滴度的培养批次809940制备。将该培养物的裂解物加入TRIzol试剂中，并收到1ml。按照CDC提供的TRIzol说明书，由得自CDC的裂解物分离RNA。使用该RNA制备物，使用Titan试剂盒(Roche)，按照生产商的说明生产cDNA。S基因的序列得自Genbank登录号AY274119，核苷酸21493-25259。因为S基因很大且存在某些内部限制性位点，所以申请人决定分三个部分克隆S蛋白。使用引物2179和2167将前端直接克隆入杆状病毒转移载体pPSC12(可由Protein SciencesCorporation获得)中(前端：核苷酸40-750)；参见图1和7。中后部分(核苷酸750-3768)使用引物2168和2171克隆到大肠杆菌pUC18载体中；参见图1和7。具体地说，使用引物O-2179和O-2167 PCR扩增S ORF的5′部分，并将其克隆入pPSC12中，获得构建物D3215。使用引物O-2168和O-2171 PCR扩增S ORF的较长的3′部分(中后部分)，并将其克隆入pUC18中，获得D3157。在测序证实其一致性后，使用ORF中的PstI限制位点和多接头中的KpnI位点，将D3157中的S ORF的中后部分亚克隆入D3215中前端部分的后面，产生D3217。另外，将完整的S基因克隆入杆状病毒转移载体。关于此三步克隆策略，此后将各个部分组装，形成完整的S ORF。S-ORF的限制性图谱示于图8，用于克隆目的的引物列于图7。将根据限制酶图谱修正的各个克隆提交进行序列分析，鉴别出克隆D3215含正确的S-ORF 5′端。鉴别出克隆D3157具有正确的S-ORF中后部分序列。

组装前端部分和中后部分：用KpnI和PstI消化克隆D3215，用作载体。另外用KpnI和PstI消化克隆3157，用作插入片段。用具有已确定的正确DNA序列的全长克隆生产其中S蛋白的胞质和跨膜部分已缺失的截短形式。跨膜结构域位于ORF的3′末端。在一个构建物中，使用定点诱变使跨膜和胞质结构域精确缺失。通过缺失S-ORF的BglI 3′端生产其它的截短构建物。另外，使用该克隆生产his-标记型S蛋白，以利于纯化开发。

已经表明，其它冠状病毒S蛋白的免疫原性表位和受体结合域含在前600个氨基酸中，其全部由两个截短构建物编码。两个截短构建物都是分泌型的，可以以比非分泌型全长S蛋白高的水平表达。截短分子可正确折叠。

获得的嵌合质粒由以下部分组成：多角体蛋白启动子，其后的ATG起始信号、61kDa信号序列以及完整或截短的S蛋白编码序列、多腺苷酸化位点和侧翼的杆状病毒序列。

获得的克隆D3216和D3217提交进行序列分析。两个序列都被证实具有正确的完整S蛋白编码序列。选择克隆D3217进行进一步的加工(进行细胞培养和定点诱变产生缺失构建物，示于图14)。

使用定点诱变在PSC12中产生SΔ跨膜和胞质(SΔTM & cyto)构建物和再截短型的S蛋白(SΔBack)。SΔBack的两个分离株和SΔTM&cyto克隆的一个分离株提交进行序列分析。

已经完成了全部三种SARS构建物的克隆和测序。为利于S蛋白的纯化，使用定点诱变构建pPSC12载体，以允许His6标记插入片段。

还将S变体的全部三种构建物(全长，ΔTM/cyto和ΔBack)克隆入pBAD/His B载体(大肠杆菌表达载体)，用于在大肠杆菌中表达这些蛋白的N-端His6标记形式。使用纯化的标记蛋白产生抗SARS S蛋白的多克隆抗体。

选择阿拉伯糖启动子系统，因为据报道其在未诱导时几乎没有泄漏。这是很重要的，因为SARS S蛋白具有潜在的毒性。该载体的另一个优势在于SARS S基因融合在His6标记和肠激酶切割位点下游，便于以后去除标记。鉴别含全部三种形式的克隆，通过测序证实它们的一致性。

实施例2：蛋白表达

在过去的15年中，用于产生、分离和放大重组杆状病毒的技术已在Protein Sciences Corporation得到改进，并已用于生产超过1,000种重组病毒；参见例如本文提及的授予Protein Sciences Corporation的专利。混合线性化亲代苜蓿银纹夜蛾(Augotgraphica califorhica)核型多角体病毒疫苗(AcNPV)DNA和含S蛋白编码基因的转移质粒，用氯化钙共沉淀，如所述转染Sf9昆虫细胞(Summers and Smith，1987)。由其蚀斑形态学鉴别重组病毒，蚀斑纯化某几个，并使用其感染T-烧瓶中的5ml Sf9细胞培养物。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹筛选表达重组蛋白的感染细胞。在无血清expresSF+细胞(可在得自Protein Sciences Corporation的无血清培养基中生长的昆虫细胞)中放大第1代重组病毒，所有后续的放大和生产都在这种无血清细胞系中进行。

使用两种方法中的一种开发用于纯化的细胞培养物：省略蚀斑纯化的快捷法；或包括蚀斑纯化的标准法。使用快捷法，用含全长S基因的转移载体D3217生产P3病毒母液。一般认为该P3母液的昆虫细胞被完全感染(基于显微镜观察和SDS-PAGE而定，参见图16)。另使用标准方法由D3217生产单独的P2。P2分析显示出清晰的P10杆状病毒-蛋白带，表明细胞被完全感染(图15)。

实施例3：发酵：使用培养基规模发酵进行一系列表达时程

使用这些发酵物的SDS凝胶和蛋白质印迹确定使S蛋白以最高量生产的收获时间。在感染的极晚期，细胞裂解可导致细胞和病毒蛋白酶累积。这可导致易感蛋白的蛋白水解性降解。另外，感染复数(MOI)可影响表达动力学。一般来说，使用最小的MOI有利于避免产生缺陷型和突变型杆状病毒。考虑所有这些因素确定最佳感染和收获条件。

使用50ml旋转器于28℃进行优化实验，以测试两个不同的MOI(1和3)，并评价最优收获时间(由48-120hpi)。如图17所示，考马斯蓝凝胶结果提示感染是良好的，这可由P10和较低的条带证实(见泳道2-9)。制备两个蛋白质印迹，并运至香港与急性期和恢复期血清温育。对于48hpi样品，蛋白质印迹(图18，恢复期血清)未显示出任何接近188KD的条带，但是，其在28KD附近显示出典型的条带。泳道4和8(分别为72和120hpi样品)在约160KD处显示出两条微弱条带，另外还在62KD上方和28KD处显示有另外的条带。这些较低分子量的条带似乎不是特异性的，因为它们还存在于阴性对照泳道中(见图19印迹的泳道15)。用72hpi收获的10L样品和溶解沉淀的样品获得相似的结果(见泳道11和12)。对第一个印迹使用恢复期血清，这些样品也是阳性的，见图20。似乎与急性期血清反应的蛋白代表非特异性信号，见图19印迹的泳道15。

使用正规程序，用病毒母液(纯化的病毒)重组体D3217.1a全长S蛋白再进行发酵(感染后72小时(bpi)收获)。该发酵物的沉淀用于进一步的纯化研究。

使用病毒p10条带的存在与否作为良好感染的指示剂，将两种缺失构建物D3227(＝SARS S ΔBack)和D3252(＝SARS S ΔTM/cyto)的纯化重组病毒放大至P1、P2和P3。在亮抑酶肽(1μg/ml)存在下进行两个0.5L发酵，并于72hpi收获。

将his标记的截短S蛋白D3519(ΔTM/cyto)和his标记的截短S蛋白D3527(Δback)均放大至P2，并且如果我们决定用这些his标记的缺失构建物继续进行，将在以后将其放大至P3。

构建物D3252(S蛋白的截短克隆，ΔTM/cyto)显示出可期待的表达结果，并且是分泌型的，因此于28℃进行10L发酵。在48hpi加入亮抑酶肽。于72hpi收获发酵物(见图45)。

在表明DNA序列确实正确后，将测序的构建克隆C-端his-标记的S蛋白(全长)D3540放大至P3。使用该P3感染10L发酵罐，于28℃温育，并于72hpi收获。细胞的生存率为50％，在收获时观察到完全感染的形态学特征。保存沉淀和上清液两者用于纯化。在48hpi时以2μg/ml将蛋白酶抑制剂和亮抑酶肽加入到感染的培养物中(见图46)。

对构建物D3252(S蛋白的截短克隆，ΔTM/cyto)进行45L发酵。48hpi加入亮抑酶肽，72hpi收获生物反应器。

用含全长S的重组杆状病毒和含M基因的杆状病毒共感染500ml培养物。用含全长S的重组杆状病毒和含E基因的杆状病毒共感染另一个500ml培养物。用含全长S的重组杆状病毒、含M基因的杆状病毒和含E基因的杆状病毒共感染第三个500ml培养物。

转染构建的克隆C-端 his-标记的S蛋白(全长)D3445、S蛋白(ΔTM/cyto)D3456、D3457和D3461以及截短的S蛋白(ΔBack)D3468、D3477和D3481，在收到到序列分析结果后将全部纯化的重组病毒放大。

为了避免形成凝集的表达蛋白，在用全长S蛋白D3217.1a的纯化病毒母液感染昆虫细胞培养物后，降低发酵温度至室温(约23℃)。在整个发酵总时间内观察感染的进展和感染细胞的存活率。感染后96小时，显微镜观察证实细胞被感染；但是感染不完全(存活率检测为约90％)。收获2L并储存，以用于纯化研究。在第7天结束时(168hpi)，收获培养物，该发酵物的沉淀用于进一步的纯化。培养物的感染程度和存活率没有比96hpi收获时进展太多。结果示于图21(分别使用IMG-541和542 SARS刺突蛋白抗体)。由此断定全长S蛋白确实要在23℃生产。根据纯化结果选择最优的收获时间和温度。

将正确测序的构建克隆C-端his-标记的S蛋白(全长)D3540、S蛋白(ΔTM/cyto)D3519和截短的S蛋白(Δback)D3527全部转染。将两种截短的构建物和全长S蛋白、his标记的构建物D3540的纯化重组病毒放大至P1。

使用抗体IMG-541和542对于72hpi后收获并处于28℃的两种缺失构建物D3227.1a(SARS S ΔRack)和D3252.2a(SARS ΔTM/cyto)的P3主病毒库进行蛋白质印迹(见图22的泳道7、8、9和10，分别为印迹#100703_d6和#100703_d7)。对每个克隆进行0.5L发酵，该发酵物的上清液用于进一步的纯化研究。泳道3-6包含在各种条件下制备的全长S蛋白病毒母液(D3217.1a)样品。两种缺失构建物都显示表达。在两种情况下蛋白似乎都部分分泌。

在于28℃、各种时间进行的10L和2L发酵中，使用全部全长S蛋白杆状病毒构建物(D3217.1a)样品。检查凝胶/印迹#101003_d3的结果(图23)。由此断定各个时间点的表达水平似乎相当，120hpi的表达似乎最好。

用ΔTM D3252.2A进行进一步的时程研究。实验在2L发酵罐中进行，起始细胞密度为2.5×10⁶细胞/ml，存活率为98％用MOI为1.0的重组病毒感染细胞培养物。48hpi加入蛋白酶抑制剂(亮抑酶肽)。在不同的时间点48、54、60和72hpi取样。取出样品的存活率示于图63的表。对所有样品进行SDS-PAGE和蛋白质印迹，结果也示于图63。

确定整个发酵过程中降解产物的存在情况。需要更定量的方法来确定最佳的收获时间应该是多少。目前的测试表明，于感染后60小时收获培养物可能更佳。

实施例4：纯化：图12A-E中提供的流程图显示了纯化开发方法

SARS全长S蛋白

S蛋白生产工艺的流程概述：

上游处理。一旦由较大规模(0.5-10L)发酵获得细胞沉淀或培养物上清液就开始该工作。因为S蛋白含跨膜结构域，所以预期全长蛋白与细胞结合。即S蛋白形成颗粒。漂洗细胞沉淀，以去除不需要的污染物，使用温和变性条件溶解S蛋白。截短的S蛋白是分泌型的，因此在其纯化工艺中省略沉淀漂洗和溶解步骤。然后使用切向流过滤同时去除大和小的污染物。

初始柱层析。该步骤的目的是去除DNA和部分纯化可溶性S蛋白。这可通过使蛋白结合CM柱或使蛋白流通DEAE柱实现。申请人在该步中有利地利用了S蛋白的相对低pI(理论pI＝5.56)，例如当使用中性pH的缓冲液时蛋白可能结合DEAE。理想地，重组S蛋白存在于与工艺下一步相容的缓冲液中。

纯化。S蛋白含跨膜结构域，基于此特征，用疏水作用柱层析进行纯化。S蛋白是大蛋白(130-140kDa)，因此可使用大小排阻层析获得95％以上的纯度。最后，S蛋白含许多糖基化位点，因此也可使用扁豆凝集素获得显著纯化(95％或95+％)。

在杆状病毒表达载体系统(BEVS)中SARS S蛋白是分泌型的。可溶性分泌型S蛋白的分子量为140,000，利用这一点使用有效去除100,000以下和300,000以上的所有蛋白的双重过滤系统。在进行任何层析前杂蛋白得到了75％的纯化。

最终层析步骤。如果在前一柱上获得需要的纯度水平所必需的洗脱缓冲液与制剂和/或胃肠外用途不相容，则使用最终精制柱。该步骤去除任何不需要的试剂，并将蛋白转移至适于试剂配制的中性缓冲盐溶液中。

S蛋白的pI为5.56，所以在中性pH使用阴离子交换柱结合和洗脱S蛋白。最终的精制疏水作用柱利用了S蛋白的高度疏水性C端，使用其达到最终纯度。

将S蛋白透析入PBS中，其最终纯度大于95％。重要地是，高纯的S蛋白保持了其免疫原性，因此保持了其可周性。

用扁豆凝集素柱纯化：

使用阴性对照沉淀(得自不同重组杆状病毒的发酵物)同时进行纯化。基于pI和疏水C端，预期在中性pH和1％变性剂条件下，蛋白可被提取并结合至阴离子交换柱。图24中的凝胶代表了这种用20mMPO4 pH 7.0溶液和1％Tergitol初步提取1L 72 hpi沉淀并上25ml Q柱。

合并0.3、0.5和1M的洗脱液，将其上10ml扁豆凝集素柱。由于有18个推定的糖基化位点，所以预期S蛋白结合。另外，在Q柱洗脱后，还将Q柱的液流(ft)上相同的LL柱。该柱用0.5M甲基吡喃糖苷的20mM PO4溶液洗脱(图25)。分别用Amicon Centricon旋转式浓缩器将洗脱级分5、6、7和10、11、12由6ml浓缩至200μl(图26)。

在阴性对照样品中没有观察到这些较高分子量的蛋白条带，因此认为其包含全长S蛋白。用人抗SARS血清探测包含泳道2显示产物的印迹。但是，该蛋白似乎不是S蛋白，因为其不与恢复期血清反应(见图20)。

由此决定，为纯化蛋白，利用蛋白的大小和人们认为蛋白被重度糖基化的特征。另外，改变溶解策略。设想加入BME和0.5M NaCl降低离子作用和打破半胱氨酸之间的聚集。此外，使用BME应增加S蛋白的溶解度，同时使用Millipore的TFF(切向流过滤)降低载荷在第一个柱上的总蛋白。

将2L 72 HPI的细胞沉淀溶解在2L 20mM PO4 pH 7.0、1％Tergitol、0.5M NaCl和0.1％B-ME中。对其电动匀浆(Polytrone)并旋转。使用100kDa截留分子量的TFF滤器减少2L上清液，并使用无Tergitol的相同缓冲液渗滤，以便减少变性剂聚集。将最终的400ml回流液加样至用20mM PO4 pH 7.0、0.5M NaCl平衡的40ml LL柱。用相同的缓冲液和1M甲基吡喃糖苷洗脱柱(图27)。

合并LL组分，并浓缩至6ml，加样至500ml S200 SEC。用PBS(20mM PO4 pH 7.4、0.15M NaCl)平衡柱，将6ml组分上样。

印迹该凝胶，并使用还原条件用香港的抗SARS血清测试(图28)。在该印迹上包含溶解的沉淀(泳道13)和初始沉淀的再提取物(泳道14)，以便确定使用这些条件是否可溶解S蛋白。还包括阴性对照，以确定杆状病毒感染的昆虫细胞的背景程度(泳道15)。柱用和前述20mM PO4+1M NaCl不同的PBS冲洗。

蛋白质印迹的泳道8、9和10(图19)显示在和恢复期血清反应时于预期的大小出现阳性信号。尽管蛋白不和急性期血清反应，但似乎使用上述的条件溶解了蛋白。

该产物的纯度估计为20％，主要杂质和S蛋白由扁豆凝集素柱上同时洗脱下来。尝试用还原条件和高离子强度下的大小排阻层析分离这两种蛋白，但是未实现分离。S蛋白和主要杂质表现如同聚集物。

最初使用上游纯化方法(使用1％Tergitol溶解物料，接着从LL柱洗脱)以一定规模纯化目的蛋白，并生产足量的物料用于阴离子、阳离子和hic(疏水作用柱)层析。在不同pH使用各种柱层析方法或许可以显现出将S蛋白由其凝集配偶体中分离出来的方法。图29显示了1L细胞沉淀的处理程序。

还用8M尿素再提取Tergitol所提取物料的细胞沉淀，以潜在地增加回收率，因为在Tergitol提取后还存在部分S蛋白。

将沉淀溶解在50mM Tris pH 8.5、8M尿素中。在所有物料溶解后，将提取物稀释4X至尿素终浓度为2M。将该物料加至LL柱(见图30)。在再提取沉淀时，洗脱级分中的62kDa杂质条带似乎较不占优势。值得指出的是，凝集素也由该柱上洗脱下来(见21kDa蛋白条带)。

使用各种得自Bondos and Bicknell(Bondos and Bicknell 2003)的添加物打破S蛋白和62kDa杂质之间的聚集，相信该杂质是主要杆状病毒包膜蛋白gp64。测试每类的代表性物质。将以下每种组分加入到LL合并物中：0.2M MgSO₄、0.1M CaCl₂、0.1M MgCl₂、1％甘氨酸和1M蔗糖，并使用Millipore的100kDa截留分子量的Centricon柱浓缩至最小体积。回流液(保留在膜上)和滤过液都进行SDS-PAGE。滤过液中存在62kDa蛋白用于确定可能的抗凝集作用。阴性对照(无添加物)示于图31的泳道4和5。与阴性对照相比，所有的添加物都显示出一些抗凝集作用，甘氨酸最好。因此，在随后的研究中将0.1M甘氨酸掺入到缓冲液中。

如图47所示，全长S蛋白与gp64共存。用CDC和IMG-542抗体显示出强烈应答。

进行另一个尝试：使用50mM DTT和6M尿素破坏凝集。以Centricon浓缩以上的组分2，并渗滤到含6M尿素的缓冲液中。填装Sephacryl S-500高分辨率柱并上样(图48的凝胶和印迹)。图48显示2种分子之间的凝集仍然是完整的，即使在高尿素和DTT浓度下也是如此。

还使用了用1％ Triton-X-100溶解细胞沉淀的替代性纯化方法。随后将溶解的物料上Ni-柱。然后将纯度约70％的洗脱物上扁豆凝集素柱，洗脱物的纯度超过90％。估计收率约为2mg/l。作为对扁豆凝集素柱的替代，我们目前正在测试DEAE IEX柱，其已在ΔTM S蛋白纯化中显示出前景。图49显示了全长his-标记S蛋白的凝胶。

最近可由Imgenex获得两种肽抗体。产生的542抗体抗氨基酸288-303，产生的541抗体抗氨基酸9-35。使用香港的恢复期血清印迹为阳性的SEC级分17(S17)用于测试这些血清。将S17进行电泳并以还原和非还原形式印迹(图32和35)。非还原性SDS-PAGE没有显示出62kDa杂质的痕迹。542抗体与非还原性S17的反应即便有也很微弱。

使用蛋白样品(5864C)进行进一步的分析，来对比抗体IMG541、IMG542和CDC的应答，该蛋白样品如下制备：在没有BME的情况下使用1％Tergitol溶解沉淀，接着进行扁豆凝集素层析，在柱洗脱前进行严格的柱冲洗。随后将该物料结合至羟磷灰石并洗脱。使用非还原性缓冲液和常规样品加载缓冲液加载样品。制备3个印迹，每个印迹都与抗体温育。结果示于图41-44。

非糖基化SARS全长S蛋白的预计分子量约为139kDa。糖基化全长S蛋白的预计分子量预期在160kDa左右。使用在人中产生的抗SARS的CDC抗体呈现出的条带没有一个位于上述分子量范围内。最丰量的条带代表gp64杆状病毒蛋白，其在非还原条件下跑至180kDa附近，在还原条件下跑至60kDa附近。IMG抗体541非常强烈地与gp64蛋白交叉反应，因此不用于进一步的蛋白质印迹分析。

将两个蛋白样品提交至耶鲁大学的Keck Facility进行N-端分析。提交最初发现与香港的抗血清免疫反应且后来与Imgenex抗体反应的S17蛋白样品(见图34凝胶/印迹090303_d2中的泳道6和11)。当在非还原条件下分析时，两个特征条带消失，形成了一个新的高分子量条带(见图34)，这提示S蛋白由两个通过二硫键连接的片段组成。第二个提交进行N-端分析的样品在还原性PAGE凝胶上主要由60kDa条带组成(见图34的凝胶/印迹090303_d2中的泳道13)，其与Imgenex抗体(IMG-542)无免疫反应。怀疑该蛋白种类是还结合扁豆凝集素树脂的杆状病毒或昆虫细胞来源的共迁移杂质。该样品还包含与抗体高度反应的小凝胶条带。使用扁豆凝集素层析使S蛋白及其降解产物和所提出的60kDa杂质完全分离是不可能的。两个样品都以丙酮漂洗的沉淀物提交，期待分析可产生主要影响因素的结果。

在发现于还原条件下全长S蛋白分解为60kDa和150kDa两个不同大小的片段后，进行实验来鉴别如果将β-ME排除在工艺之外会发生什么。

将于23℃进行发酵并于168HPI收获的2L发酵物溶解在20mMPO4和1％ Tergitol中。样品电动匀浆(Polytrone)2分钟，并以4500转离心30分钟。使用TFF以100kDa截留分子量滤器浓缩上清液，并用20mM PO4缓冲液渗滤。将350ml终体积加样至预平衡的40mlLL柱，并用10mM PO4、50％乙二醇和0.5M甲基吡喃糖苷洗脱(见图35)。

与使用还原条件提取的LL柱相比产量增加。较高分子量形式的180kDa条带还与541抗体反应。

将组分4-14由120ml浓缩至6ml，并加样至600ml S200 SEC柱(见图36)。

全长S蛋白存在于第一个离开SEC柱的峰中。洗脱的蛋白为较低分子量的产物。其中有一些似乎在印迹中有活性，可能代表S降解产物。出现在所加样品中的60-62kDa处(泳道3、4)另一主带洗脱在离主峰的15个试管中。再者，其可能代表S降解产物和相同分子量的病毒蛋白的混合物。值得指出的是，印迹的泳道4中的条带强度比泳道3增加；显然浓缩导致活性62kDa蛋白增加。

重复进行的实验具有完全相同的结果。合并主S组分，并以还原和非还原形式分析(图37)。省略提取中的β-ME时的最终处理收率似乎较高。

SARSΔTM S蛋白纯化

部分纯化的SARSΔTM S蛋白的N-端测序

如下制备ΔTM S蛋白样品。将10L发酵物(102103，72hpi，28℃)的1L上清液直接加载至pH 7.4的扁豆凝集素柱。由扁豆凝集素柱上洗脱下ΔTM S蛋白，然后流通pH 7.4的阳离子交换柱(CM)。将CM流通液经pH 7.4的DEAE阴离子交换柱进行处理。ΔTM S与柱结合，用最高至250mM NaCl的线性20CV梯度于中段洗脱下来。Q级分中的约150kD条带与CDC抗体和IMG-542抗体反应(见图50的凝胶/印迹中的泳道9-13)。将Q级分#12(见图50的凝胶/印迹中的泳道9)转移至PVDF膜进行N-端分析。

N-端测序允许如下的实验性比对：X1-D-L-D-R-X2-X3-T-X4-D，其中X1可能为S，X2可能为沉默残基(例如Cys或糖基化/磷酸化的S/T)或L，X3可能为T，而X4可能为F。更强烈信号的比对以及更不确定的比对，与PSC几丁质酶信号序列(SDLDRCTTFDDV)后被切除的成熟S蛋白的预期N-端符合。

由发酵上清液(D3252.2a，72hpi，28℃)纯化ΔTM S蛋白

将上清液直接加载至20mM Tris/0.5M NaCl pH 7.7平衡的扁豆凝集素柱(1L/40ml柱)。使用0.5M NaCl去除非特异性结合的杂质。在用相同的缓冲液洗至基线后，用20mM Tris pH 7.5将柱洗至较低电导率，然后用1M N-甲基-α-D吡喃甘露糖苷的20mM Tris pH 7.5溶液洗脱柱。一些S蛋白流通柱子(见图51的凝胶/印迹中的泳道3)。对同样的1L物料使用相同柱子并在相似条件下处理没有观察到流通。影响样品流通的因素可能包括：TEK最初没有进行NaCl冲洗，或者可能由于重复使用了该具体柱。至少一半的物料结合，并洗脱至6-25ml组分中(见图51的凝胶/印迹中的泳道6-10)。合并组分并经阴离子交换Q柱处理。

将合并的扁豆凝集素洗脱液上样于用20mM Tris pH 7.5平衡的30ml Q柱，并用50mM、75mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、500mM NaCl分步洗脱。物料结合至柱，流通液或冲洗液中没有ΔTM/S蛋白的证据(见图52的凝胶/印迹中的泳道2-4)。用75mM NaCl(泳道8-9)和100mM NaCl(泳道10-11)去除了S的降解产物。用150mM NaCl洗脱下大量ΔTM S蛋白(见图52中凝胶的泳道12-14)。其它的ΔTM S蛋白和较低分子量的蛋白用500mM NaCl洗脱下来(见图53中凝胶的泳道9和11)。合并150mM NaCl的洗脱液(见图53凝胶的泳道13)，并透析入10mM磷酸钠pH 7.4中。将物料与另外操作轮次的产物合并。使用小Q柱尝试浓缩稀释的蛋白样品，接着使用大小排阻层析去除较低分子量的杂质。BCA实验的估计收率为0.5mg/L。如果避免了扁豆凝集素柱的流通损失，预期收率约为1mg/L。

在替代性的纯化流程中，由10L发酵物纯化ΔTM S蛋白。该工艺的流程概述示于图12C。获得的纯化蛋白示于图54。获得的产物用于小鼠免疫原性研究。

已经由45L发酵物进行ΔATM S蛋白的纯化。简单地说，离心物料，调节上清液的pH至pH 8，然后再离心(该步去除了非蛋白物质和某些蛋白杂质)。随后，将物料浓缩8倍，然后储存于-20℃。然后将3L浓缩物加样至750mL阳离子(UnosphereS)柱。ΔTM S蛋白流通该柱(FT)。将FT上样至250mL阴离子(Q)柱，并使用150mM NaCl洗脱。DEAE柱过小，因为约65％的物料流通该柱。

由45L发酵物纯化的蛋白总量约为10mg。产物在浓缩后显示降解，并含有高水平内毒素。使用Liu et al.(Liu，Tobias et al.1997)描述的基于TX-114相分离和离子交换层析的技术去除内毒素，但这产生大量损失。

TFF浓缩步骤导致大量损失，因此在随后的10L纯化中省略了该步骤。由于该工艺变化，蛋白不再结合Q柱。改变的工艺的流程概述示于图12D。

使用pH为8.0的1M Tris将收获的ΔTM的pH调节至7.4。然后以4500rpm离心上清液30分钟。随后将上清液加样至与500ml Q柱相连的500ml S-柱。大部分ΔTM蛋白出乎意料地流通两个柱。

将流通液加样至50ml LL柱。LL洗脱级分看起来令人满意，将其以Stirred Cell浓缩至100ml。在浓缩过程中出现了沉淀问题，将100ml产物透析至PBS中。

该10L发酵物的FT的产物收率约为10-12mg。终产物中的内毒素含量高。使用Triton-X处理去除内毒素。

以100mM NaCl洗脱并经LL处理的确实结合Q柱的2-3mgΔTM也含高内毒素。

收获后制备的ΔTM，并使用pH为8.0的1M Tris将pH调节至7.4。然后以4500rpm离心上清液30分钟。随后将上清液加样至与500ml DEAE柱相连的500ml S-柱。大部分ΔTM蛋白再一次流通两个柱。

将流通液加样至50ml LL柱。LL洗脱级分看起来令人满意，将其透析至PBS中，然后以Strirred Cell浓缩至100ml。

FT的产物收率现在为15-20mg，在DEAE柱的100mM或150mM洗脱液中不存在ΔTM。内毒素含量仍然很高，但低于先前的纯化步骤。使用该物料配制用于小鼠免疫原性研究的产物(参见实施例10)。

工艺优化

使用最初的3L浓缩物进一步优化以上工艺。正如所料，部分ΔTMS蛋白不结合Q柱。因此，将该流通液(称为1和2)经更大的Q柱使用相似洗脱条件(fplc 5888)处理，然后将洗脱液在又使用相似洗脱条件(fplc 5889)的LL上进一步处理。合并含ΔTM S蛋白的级分，浓缩并经SEC柱(fplc 5890)处理。结果示于以下的图55：

组分31-35的纯度约为70-80％。

随后，使用相同的Q柱(fplc 5891，但现在柱洗脱改用分步洗脱：0.15M NaCl至50mM NaCl、100mM NaCl，然后为150mM NaCl(每体积摩尔浓度一倍柱体积)处理流通液3。结果示于图56。

100mM洗脱级分不与Sars抗体反应，而150mM级分确实与抗体反应(在图56中，注意印迹和凝胶是颠倒的)。

然后合并150mM组分，并加样至相同的LL(fplc 5892)。现在将洗脱液由0.5M糖变为0.1M(级分1-5)、0.2M(级分6-10)、0.3M(级分11-15)、0.4M(级分16-20)、0.5M(级分21-24)糖，每体积摩尔浓度使用两倍柱体积。结果示于图57。

级分10-24与Sars抗体反应，而级分1-9不反应(011404_d5印迹)。合并级分12-24，使用Amicon系统浓缩并透析至8ml体积。该物料的凝胶/印迹示于图58。该物料的纯度高于90％，凝胶中所有可见条带都与Sars抗体反应，提示可去除工艺中的SEC步骤。

通过将有或没有pH调节的过滤步骤引入到纯化中，继续进行优化研究。通过0.2μm滤器过滤2L新鲜上清液。不调节pH，将上清液加样至相连的UNO-S和DEAE柱。将5907的流通液加样至50ml新LL柱。和过去的实验一样洗脱LL。合并级分，并过液透析至PBS中过夜。然后通过Stirred Cell将物料浓缩至30ml物料含有的片段比用于小鼠研究的多，因为合并液中包含一些副产物级分。见图64。抗体识别所有条带。加载0.5μg蛋白获得70％的完整蛋白，剩余部分含片段。

该纯化产生的总蛋白浓度为271μg/ml，每升收率约为4mg。物料的内毒素水平为80EU/ml。

研究显示，引入过滤步骤和使用新鲜树脂改善了内毒素含量。省略pH调节和浓缩步骤获得了更好的整体处理收率。

重复进行实验，第二轮实验获得的物料就完整部分对片段比率而言与小鼠研究中使用的相同(结果示于图65)。第二轮实验的蛋白浓度为494μg/ml，每升收率约为3.5mg/L。在该样品中观测到低内毒素水平。两次实验的结果相似，表明结果是可重复的。

按照预想的对未调节pH的上清液进行第三轮实验。纯度和收率结果与前两轮实验大致相同。最终收率值难以和该合并液拆分后上Q Sepharose柱层析相比较。所获物料的凝胶和印迹示于图66。浓缩前物料的内毒素值低于40，浓缩物的内毒素值低于320。这些结果表明，Q柱似乎为Stirred Cell浓缩的替代方法。

为制订大规模生产工艺并确定需要的柱尺寸，通过使用减小的柱尺寸改变纯化技术，进行进一步的优化研究。将UNO S和DEAE柱由500ml按比例减小至100ml。LL柱由50ml减小至7.5ml，并使用5ml Q Sepharose柱替代Stirred Cell浓缩。所获物料的凝胶和印迹示于图67。结果表明，减小柱尺寸是切实可行的，同时保持了终产物的纯度。结果显示，使用Q Sepharose柱替代Stirred Cell浓缩似乎片段更少。代表该工艺的流程图示于图12E。

进一步的分析包括用1L最初浓缩物重复该改良的工艺。方法包括使用较大的S/Q柱使用分步洗脱(100mM/150mM洗脱液)。洗脱液加样至使用各种(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5M)糖洗脱的LL。

提取研究

进行实验改进对昆虫细胞中S蛋白的提取。先前的实验表明，0.1％ Tergitol去除了显著水平的杂蛋白，留下与细胞沉淀结合的S蛋白。另外，添加剂如甜菜碱和甘油可增加0.1-1.0％ Tergitol的提取效率。使用于23℃生长、168hpi收获的发酵培养物(批号#100303)进行一系列的提取实验。首先用20mM Tris、0.1％ Tergitol pH 8.47漂洗沉淀，然后将其等分。离心等分部分，合并0.1％ Tergitol上清液。在有和没有添加物(10％甘油、0.4M甜菜碱、0.5M NaCl)的情况下，用1.0％ Tergitol再提取获得的等分部分/沉淀。根据凝胶和印迹(见图38)，使用0.1％ Tergitol的最初漂洗步骤完成了沉淀的全部蛋白提取(泳道1，188SN1)。该结果可归因于该新发酵的不同条件(较低温度，晚收获)。在使用较低量的变性剂时，细胞沉淀重量对重悬浮体积(50X)的高比率也可能提升提取效率。

实施例5：实验研究

已描述了S蛋白具有血细胞凝集活性(Schultze，Gross et al.1991)。Protein Sciences开发了一种用于其流感程序的血细胞凝集实验，申请人修改了该方法，以检测S蛋白的生物活性，因为适宜的生物活性预示着正确折叠。

先前已经描述了不同冠状病毒的S蛋白可通过病毒上的S蛋白与细胞表面上的唾液酸相互作用而凝集红细胞。凝集实验基本上如Rosen(Rosen 1968)所述进行。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗新鲜小鸡RBC，并以0.5％溶液悬浮在PBS中。将50μl漂洗的RBC加入到U型底96孔微量滴定板的每个孔中。样品在PBS中连续稀释，并将50μl的每种稀释液加入到每个孔中。覆盖滴定板，并于室温温育30分钟，然后计数凝集的细胞。1HA单位定义为50％细胞凝集的稀释度。同时使用小鸡和小鼠红细胞进行实验。

实施例6：生产

制备工作病毒库(WVB)。用于S蛋白生产的病毒接种物来源于单独的工作病毒库(WVB)。如上所述，以低感染复数通过几次传代使单个病毒蚀斑的重组病毒增殖，产生大量的接种物，以等份储存于液氮中作为WVB。

测试工作病毒库是否没有细菌、真菌和其它外来物，包括污染野生型或其它重组杆状病毒。以DNA印迹分析纯化的杆状病毒DNA的插入片段和以蛋白质印迹分析在感染的昆虫细胞中产生的重组蛋白，证实一致性。为保持用于蛋白生产的重组杆状病毒的遗传稳定性，通过解冻1等份并以低感染复数(等于或低于1蚀斑形成单位(pfu)/细胞)使其增殖限定的代数，制备工作病毒库(WVB)。

为了制备MVB，用低MOI(通常为0.1)感染培养物，并于72hpi收获培养物。冷冻WVB P3，并储存在生产区域，用于以后的工艺研究和生产应用。FL S蛋白(D3217.1a)的印迹出乎意料地显示在上清液中存在全长S蛋白(图39)。

因为在病毒库的上清液中存在全长S蛋白，所以进行另外的2L发酵。在72hpi的发酵总时间内，监测和测定感染的进展、感染细胞的存活率、FL S-蛋白D3217.1a的蛋白表达以及生产蛋白的稳定性(因为不止1次加入较高浓度的亮抑酶肽)。发酵在2L生物反应器中进行。感染后24小时，以2μg/ml的浓度(＝先前使用浓度的2倍)将亮抑酶肽加入到培养物中。在48hpi时，取样，检测存活率(82％)，收获0.5L，沉淀和上清液都储存于-20℃，用于纯化。在48hpi时再加入2μg/ml的蛋白酶抑制剂亮抑酶肽。感染后70小时(70hpi)，收获培养物。收获时的细胞存活率为55％。显微镜观察证实细胞被完全感染。图40描述了表达进展。

检查工作病毒库

通过滴度和无菌性实验检查WVB。连续检查用于发酵的细胞系的无菌性。另外，在感染和收获时检查发酵液和粗样(或者为感染细胞，或者为废培养基，分别用于胞内和分泌的蛋白)的无菌性。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹分析纯化工艺各个步骤的生产中间样和半成品样品，以确保回收工艺如所预期的进行。

终产物批检

对每批抗原半成品进行检查，包括总蛋白实验、按照21 C.F.R.§610.12中描述的方法和其中列出的USP章节进行的鉴定实验。

             半成品蛋白的放行实验和技术要求

实验	方法	可接受的标准
			半成品无菌性	CFR 610.12	未观察到生长
支原体	指示细胞/DNA菌株	未检测到支原体
			病毒	共培养，3种细胞类型	未检测到病毒
一致性	SDS-PAGE	130kDa分子量
				蛋白质印迹	对特异性抗血清阳性
纯度	光密度扫描分析	＞90％，有利地＞95％
			内毒素	鲎变形细胞溶解物实验	小于10EU/ml
蛋白浓度	改良Lowry法(BCA；Pierce)	实验和报告
			蛋白活性	凝集反应实验	观察到活性

实施例7：质量控制

使用研究方案进行实验，以确定浓缩和未浓缩的物料在两个不同温度(-20℃和2-8℃)稳定性。迄今为止的研究结果表明，浓缩物料于-20℃储存时似乎更稳定。未浓缩物料似乎类似，与储存温度无关。

进行进一步的稳定性研究，以确定SARS ΔTM培养物上清液的最佳储存时间。SARS ΔTM培养物上清液样品以TFF浓缩物或未浓缩物储存于4℃或-20℃。收获培养物并测试样品。数据目前尚处于光密度计评价中。

使用相同抗体(IMG 542)处理所有印迹。定性地说，可以断定未浓缩的SARS ΔTM培养物上清液在4℃或-20℃稳定储存最多两个月(见图68)。图68显示了未浓缩的SARS ΔTM培养物上清液储存于4℃和-20℃的时间点。还对储存于4℃和-20℃的未浓缩SARS ΔTM培养物上清液进行了蛋白质印迹。定量地说，与T＝0的样品相比，在两个月储存期内未检测到降解或条带信号的变化。观察到储存两个月以上的蛋白条带强度下降。

浓缩的SARS ΔTM培养物上清液于4℃最高稳定1周(见图69)，但在第一个测试时间点在印迹上的约100kD处出现了额外的条带(见图69中的条带)。但是，应当指出的是，在研究过程中，储存于4℃的浓缩培养物上清液被污染了。有可能是污染物导致于4℃快速降解。图69显示了浓缩SARS ΔTM培养物上清液储存于4℃的时间点。还对储存于4℃的浓缩SARS ΔATM培养物上清液进行了蛋白质印迹。定量地说，当浓缩的培养物上清液于4℃储存达1周时，其中的蛋白相当稳定，例外之处是出现了额外的约100kD条带。超过该时间蛋白几乎完全降解。

浓缩的SARS ΔTM培养物上清液于-20℃最高稳定两个月(见图70)。图70显示了浓缩SARS ΔTM培养物上清液储存于-20℃的时间点。还对储存于-20℃的浓缩的SARS ΔTM培养物上清液进行了蛋白质印迹。定量地说，与T＝0的样品相比，在两个月储存期内未检测到降解或条带信号的变化。约100kD的条带可能已经开始出现，或可能由于转移不一致而在印迹上发生变化。

实施例8：生产SARS S蛋白的多克隆血清

使用细菌表达系统pBAD/His(Invitrogen)和大肠杆菌菌株LMG194生产ΔTM S蛋白。提取细胞沉淀中的靶蛋白，并经Ni-螯合柱纯化。报告了显著水平的蛋白降解。另外，在使用Centriprep浓缩器浓缩终产物时出现显著损失。

多克隆抗体服务包括购买1只用于抗体生产的无特定病原体兔(动物编号#V610)。进行预先免疫放血。迄今已经进行了两次免疫接种，在PSC接受了两次免疫后的小体积取血(见下表)。安排了另外4次免疫接种。进行两次更小体积的取血，预期最终的血液合并量为40-70ml。

第二次免疫取血用于探测45L ΔTM S蛋白纯化工艺的蛋白质印迹。使用初级抗体，分别以1∶1000和1∶10,000稀释度进行2小时和45分钟的蛋白质印迹。以1∶1000使用第二抗体(兔IgG)1小时(见图59中的凝胶和印迹)。第二次免疫取血的1∶10,000稀释度产生了合理的印迹信号。印迹温育时间可延长1-2小时，以改善信号。使用1∶10,000稀释度的第二次免疫取血应为至少1,000多个印迹提供足够物料。

提供3mg ΔTM S蛋白进行小鼠免疫原性研究。初步报告数据表明，和铝一起以IM途径免疫小鼠获得了良好的血清ELISA滴度和病毒中和滴度。在该研究中使用了两个剂量。

实施例9：动物实验

该研究由疾病控制中心以盲方式进行。

该研究的实验材料是截短的S蛋白(ΔTM)和全长his-标记的S蛋白(histag)。采取常规的安全措施，其它的常规安全措施根据需要采用。

测试材料冷冻储存(≤-20℃)。所有材料都按照供应商说明和文件要求储存。

分配的测试材料的全部数量都有文件记录。制备测试材料的药剂，并以单独的小瓶运送一每个免疫时间点每个剂量水平1个小瓶。在每个给药日，在给药前融化制备的剂量小瓶。

用于该研究的雄性和雌性(未产；未妊娠)CD1、VAF/Plus小鼠购自Charles River Laboratories。小鼠重约16-18克(规定的购买重量范围)，刚到时约4周大。小鼠经常用于免疫研究；具体地说是用于超敏反应研究，可获得大量的背景资料，使得该小鼠成为了该研究的合适候选者。用具有硬木屑垫的实心底塑料笼装小鼠，每笼最多装6只。在开始研究前，对小鼠房间和笼进行清洁和消毒，此后根据需要换笼。这要按照公认的动物养护准则实施。

小鼠房间用荧光照明，并保持12小时昼/夜循环。按照NationalResearch Council′s，“Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals”，1996，尽最大可能将室温保持在约18-26℃，相对湿度保持在约30-70％。每日记录室温和相对湿度值。

随意就可获得合乎标准的啮齿类动物膳食[例如Purina RodentDiet 5002(PMI Nutrition International，Brentwood，MO)]。生产商提供了每个食物批次的分析，并保留设施记录。膳食中不存在对研究的完整性有不利影响的已知杂质。Chicago市自来水通过自动饮水分布系统或水瓶随意供应。淡水(瓶)每周至少提供两次。保留水分析报告。

选择用于研究的动物在耳号或耳孔处给予永久的识别号码。各个笼的卡片也以动物编号和研究组别标识实验动物。分配的识别号码在研究中是唯一的。

按照以下显示的研究设计通过IM注射给予小鼠测试材料。对动物称重，使用约束随机处理分派处理组，使得所有实验组的预测体重都相仿，使用的每只动物的体重变化都不超过平均体重的±20％。

动物接受50μl含分级剂量测试材料的药剂。在指定日期麻醉动物并收集血清。运送血清进行ELISA分析和血清中和实验。

组别	剂量水平	第1天		第15天		第30天		第45天		第60天
											剂量1	S	剂量2	S	剂量3	S	剂量4	S	S
1	3μg										40	-	32	8	24	8	16	8	8
		2	9μg	40	-	32	8	24	8	16										8	8
3	9μg-his标记										40	-	32	8	24	8	16	8	8
		4	27μg	40	-	32	8	24	8	16										8	8
5	50μg										40	-	32	8	24	8	16	8	8
		对照	-	NA	8	NA	-	NA	4	NA										-	4

剂量＝IM给药(50μl)的小鼠数-一半雄性，一半雌性

S＝处死用于取血-一半雄性，一半雌性

NA＝不适用

购买用于该研究的动物保持隔离状态至少1周。在隔离期间，每天至少观察动物1次。在隔离完结时，由兽医师检查动物的健康状态，然后让其进行实验。

每周对动物称重，每日观察毒性和生存体征。记录所有的行为改变征兆、皮毛状况改变、体液的不寻常排出、病灶或其它相关观测结果。记录并废弃死亡的动物，不进行大体尸检。对发现死亡或在濒死状况下处死的动物不进行尸检。在动物死亡时不保存组织。

动物接受总共1、2、3或4次50μl含测试材料的IM注射。在第1、15、30和45天免疫动物。使用0.5cc一次性无菌塑料注射器和27g×1/2英寸针注射药剂。对照动物不给药。

小鼠重度麻醉，然后取血，由后眼窝窦、腹主动脉或通过心脏穿刺收集全血。通过使血凝结、以1300×g离心20分钟、取出血清至合适的标记试管中收集血清样品。将血清储存于约-20℃，直至在第30天和第75天取血后运走。通过由腹主动脉放血，接着用戊巴比妥钠麻醉或通过CO₂窒息，对研究动物实施安乐死。

体重和每周的体重增加以每个时间点受影响组的平均值和标准偏差提供。通过方差(ANOVA)分析，如果合适的话通过Dunnett检验或Tukey的HSD检验，以统计学分析处理组之间对数变换数据的差异。P值≤0.05被认为是显著差异。以发生率概括临床观察结果。

实施例10：检测小鼠血清中抗体水平的ELISA实验

为了检测小鼠血清中的抗体水平，使用作为板上抗体源的纯化-TM、多克隆兔抗体、hrp缀合的二抗以及Pierce的Pico CLW ELISA检测试剂盒开发ELISA。使用关闭激发灯的Perkin Elmer荧光计。

图60和61是Excel图，表示用多克隆兔血清工作的系统。在图60中，使用恒定浓度的一抗和二抗(稀释度1∶500)平板包被各种量的抗原。图61显示了用100ng TM/孔和1∶1000稀释度的二抗滴定兔多克隆抗血清。稀释度为以1∶1000开始的2倍。

在双盲研究中，如下表所示，用各种剂量的SARS S ΔTM和His-标记的全长S蛋白免疫接种6组小鼠(5个实验组，1个对照组)。在第1、15、30、45、60和75天对小鼠取血。

根据预先进行的实验，决定工作血清稀释度为1∶100稀释度。用捕捉免疫实验测定每个样品的抗-S ΔTM抗体滴度，其中96孔平板的每个孔都包被100ng S ΔTM。在抗-S ΔTM抗体结合S ΔTM后，使用HRP缀合的绵羊抗小鼠抗体产生特异性信号(ECL)。图71中报告的结果是雄性和雌性受试小鼠的平均值。对照1包括第1(红色)和第30(蓝色)取血日的血清，对照2是实验对照，包括阴性对照(PBS，红色)和阳性对照(兔抗-S ΔTM)。所有的实验都在两块板上以双份进行。研究不是非盲的，直至所有实验完成并收集数据后为止。

图71中的图清晰显示抗-SARS S、ΔTM或His-标记全长的抗体可以剂量依赖方式和加强有效方式被诱导。在双份平板上的结果可重现。而且，图75中的图也清晰显示了抗体滴度随时间提高。

再检测用于研究的His-标记的S蛋白(9μg剂量水平)的浓度。由于蛋白制品中的干扰，9μg属于过度评价，约2μg更精确地反映了实际剂量。此新评价和当前研究一致。用His-标记的全长S蛋白给药的小鼠的值低于3μg剂量水平的小鼠，这表明实际剂量可能低于3μg。

进行另外的实验，以验证用于小鼠研究的捕捉免疫实验。

在小鼠SARS S免疫原性研究的第一部分中(上文)，用兔抗His-标记的SARS ΔTM确定最佳包被条件为100μl的1μg/ml SARS SΔTM。初级抗体(小鼠血清)工作稀释度1∶100由先前的中试实验而定，其中连续稀释选择的小鼠血清，测定其SARS ΔTM结合情况。选择两个血清样品用于本研究。一个是#111(3μg剂量，第15天取血)，代表较低端的特异性信号。另一个是#196(50μg剂量，第30天取血，在小鼠研究中的信号最强)，为较高端。血清连续稀释，以1∶100稀释度开始，实验用两种包被条件(1μg/ml和2μg/ml SARS S ΔTM)在平板上以双份进行。结果示于图72。

对于#111，信号微弱但可以检出。稀释度信号是线性的，除了在实验较低端的线性范围以外。1∶100稀释度明显是该样品的最佳选择，进一步的稀释度危害实验质量。在另一方面，#196显示特异性信号随着连续稀释而线性下降。相反，1∶100稀释度是在滴定的较高端。该稀释度对弱和强的特异性信号都有损害。因此，本研究验证了用于小鼠免疫原性研究的实验条件。

包被浓度增加至2μg/m1改善了较低滴度的检测，但较高滴度的血清必须进一步稀释，以便处于线性检测范围内。

因为在两个不同日期测试两个相同的血清样品，所以可评价捕捉免疫实验的重现性(见图73)。两个实验的结果是可重现的。第1天的CV(标准偏差/平均值)由于是两块板的平均结果(也叫做板间CV)而约为10％，而第2天的CV得益于相同板的平均值(板内CV)而低于10％。#111的信号微弱，位于实验范围的较低端。

研究的II部包括在第45、60和75日取血。获得的总血清样品，包括在第45、60和75天取出的血样，其示于下表。

组别	剂量水平	性别	取血日
									第1日	第15日	第30日	第45日	第60日	第75日
			组1	3μg SΔTM	雄性	0	5	3							4	4	4
雌性	0	4							4	4	4	4
					组2	9μg S TM	雄性	0					4	4	4	4	4
雌性	0	4	4	4					4	4
							组3	3μh His-S FL			雄性	0	4	4	4	4	4
雌性	0	4	4	4	4	4
									组4	27μg SΔTM	雄性	0	4	4	4	4	4
雌性	0	4	4	4	4	4
							组5	50μg SΔTM			雄性	0	4	4	4	4	4
雌性	0	4	4	4	4	4
									对照	裸	雄性	4	0	2	0	2	2
雌性	4	0	2	0	2	2

所有的小鼠抗SARS S蛋白血清送至加拿大的CDC进行血清中和研究。按照SOP进行小鼠血清的病毒中和实验。血清被2倍连续稀释。对于每个稀释度，加入100感染单位的病毒。在温育过程中发生病毒中和。混合物用于接种Vero-E6细胞，并监测致细胞病理作用(CPE)。未加热(滴度1)和加热(56℃，30分钟，滴度2)血清的结果概述于下表。

			取血日
											第15天				第30天
				剂量水平	性别	ID	免疫原性	病毒中和		D									免疫原性	病毒中和
滴度	滴度-1	滴度-2(56C)									滴度	滴度-1	滴度-2(56C)
							组1	3μgSΔTM	雄性					#1	2,000	＜10	＜10	#5	16,000	20	20
#2	4,000	＜10	10
											#3	2,000	＜10	＜10	#7	32,000	80	80

			#4	1,000	＜10	＜10	#8	32,000	40	10
											#6	8,000	＜10	＜10
			雌性	#111	16,000	20	40	#115	128,000	320									640
		#112									8,000	＜10	＜10	#116	64,000	80	80
				#113	2,000	＜10	＜10	#117	32,000	80								20
		#114									32,000	20	＜10	#118	64,000	320	160
				平均
	组2	9μgSΔTM	雄性								#21	2,000	10	＜10	#25	32,000	320				80
#22				4,000	＜10	＜10	#26	32,000	160	80
											#23	4,000	20	10	#27	8,000	20	10
#24				4,000	＜10	10	#28	32,000	160	40
											雌性	#131	32,000	40	20	#135	128,000	320	80
#132			32,000	10	＜10	#136	128,000	320	160
										#133		16,000	10	20	#137	64,000	160	160
#134			2,000	＜10	＜10	#138	64,000	160	80
										平均
组3		“9”μgHis-SFL	雄性	#41	＜1000	＜10	＜10	#45	2000		10										＜10
	#42									1000		＜10	＜10	#46	64000	160	160
				#43	1000	＜10	＜10	#47	16000		10							10
	#44									＜1000		＜10	＜10	#48	32000	80	80
				雌性	#151		40	20	#155									40	20
	#152									20		＜10	#156		10	＜10
					#153		＜10	10	#157								40	20
	#154									＜10		＜10	#158		80	80
					平均
	组4	27μgSΔTM	雄性	#61								10	＜10	#65		160					40
#62						＜10	＜10	#66			160						40
				#63								＜10	＜10	#67		160		40
#64						＜10	＜10	#68			160						160
				雌性						#171			＜10	＜10	#175			320	160
#172					＜10	＜10	#176		320		160
										#173					#177		160	160
#174					20	10	#178		40		80
										平均
组5		50μgSΔTM	雄性	#81		10	＜10	#85			320										80
	#82											40	10	#86		80	40
				#83		10	10	#87			320							640
	#84											20	＜10	#88		320	320
				雌性	#191		＜10	＜10	#195									320	320
	#192									40		10	#196		2560	320
					#193		20	20	#197								80	80
	#194									10		20	#198		80	320
					平均
	对照	裸	雄性											#105		＜10					＜10
								#106			＜10						＜10

		雌性					#215		＜10	＜10
															#216		＜10	＜10
			平均

注意：对于病毒中和实验，红色和黑色的数字分别得自实验042104和051104。

			第45天		第60天		第75天
										剂量水平	性别	ID	免疫原性	ID	免疫原性	ID	免疫原性
滴度	滴度	滴度
			组1	3μgSΔTM	雄性	#9	64,000	#13					32,000		#17		32,000
#10	64,000	#14							128,000	#18	16,000
						#11	32,000	#15				128,000	#19	256,000
#12	256,000	#16							64,000	#20	64,000
雌性	#119	256,000							#123	128,000	#127				128,000
					#120	128,000	#124	128,000				#128	256,000
	#121	512,000							#125	128,000	#129			128,000
					#122	512,000	#126	128,000				#130	128,000
	平均									228,000				108,000		126,000
组2				9μgSΔTM	雄性	#29	64,000	#33				64,000	#37				64,000
	#30	128,000	#34						64,000	#38	128,000
						#31	64,000	#35				128,000	#39	128,000
	#32	128,000	#36						128,000	#40	32,000
						雌性	#139	512,000				#143	64,000	#147	128,000
	#140	512,000	#144		128,000				#148	256,000
							#141	128,000			#145	256,000	#149	256,000
	#142	256,000	#146		64,000				#150	256,000
							平均					224,444		111,556		152,667
	组3	“9”μgHis-S FL	雄性	#49	256,000	#53			512,000	#57							512,000
#50							64,000	#54			512,000	#58	128,000
				#51	64,000	#55			256,000	#59				32,000
#52							128,000	#56			64,000	#60	1,032,000
				雌性	#159	1,032,000			#163	1,032,000				#167	256,000
#160			32,000				#164	256,000			#168	32,000
					#161	64,000			#165	64,000			#169	1,032,000
#162			1,032,000				#166	512,000			#170	256,000
					平均					321,827				368,840		381,407
组4		27μgSΔTM	雄性	#69			16,000	#73			128,000	#77					64,000
	#70				128,000	#74			64,000	#78			512,000
				#71			256,000	#75			256,000	#79		64,000
	#72				32,000	#76			512,000	#80			512,000
				雌性			#179	256,000			#183	256,000		#187	512,000
	#180		512,000		#184	512,000			#188	256,000
							#181	256,000			#185	512,000	#189	256,000
	#182		512,000		#186	512,000			#190	128,000

	平均			246,000		344,000		288,000
									组5	50μgSΔTM	雄性	#89	256,000	#93	32,000	#97	512,000
#90	512,000	#94	512,000	#98	64,000
						#91	128,000	#95				512,000	#99	64,000
#92	16,000	#96	64,000	#100	512,000
						雌性	#199	2,048,000				#203	256,000	#207	512,000
#200	128,000	#204	1,024,000	#208	128,000
							#201	1,024,000			#205	128,000	#209	256,000
#202	1,024,000	#206	512,000	#210	512,000
							平均					642,000		380,000		320,000

该研究的结果表明，所有接受两剂的小鼠的血清都可中和SARS-CoV，而接受一剂的小鼠大部分产生中和血清。这种中和能力显然是加强有效性的。结果还显示了剂量依赖性的一般趋势，但在9μg以上的剂量水平达到平稳段。

进一步分析一部分数据的相关性。因为以100倍稀释度获得了小鼠免疫原性研究的全部小鼠血清的MFI值(见实施例11)，所以两组数据可以在相同图中作图，以观察其相关性。在图74中，Y轴代表病毒中和的滴度1，而X轴显示相同血清的MFI值。所有的阴性结果(滴度1＜10)和1个偏差值(动物D为#25)排除在外。

在样本数量为16时，图形显示R2值为0.90，表明两个研究之间具有良好关联(见图74)。

实施例12：SARS S ΔTM的生物活性

用ACE2/S ΔTM/兔α获得各种SARS S ΔTM浓度和固定的1∶50稀释度的初级抗血清的MFI值。结果示于图76，其表明MFI值与样品浓度良好相关，R2值为0.99。该结果体现了SARS S ΔTM的功能活性，表明纯化的重组体正确折叠。这也表明SARS S ΔTM是疫苗的合适抗原。

总而言之，这些研究已经表明，重组SARS S蛋白可以剂量依赖方式和加强有效方式激发小鼠SARS-CoV-中和血清。而且，在研究过程中疫苗似乎具有良好耐受性。

实施例12：用铝胶配制SARS S ΔTM

测试SARS SΔTM与佐剂铝胶的结合情况。固定量的纯化SARSSΔTM(4个柱后)与可变量的铝胶混合，以使最终的Al(OH)₃浓度为0.05％、0.1％、0.15％和0.2％。使混合物静置1小时，然后以10,000RPM于室温旋转10分钟。分析获得的上清液的SARS S ΔTM浓度。

根据上清液中的蛋白浓度，计算沉淀中的SARS S ΔTM的量(假定结合铝胶)。在0.05％、0.1％、0.15％和0.2％Al(OH)₃时，每mg Al(OH)₃结合96μg、61μg、46μg和38μg SARS S ΔTM。

已知二价阴离子如磷酸根基团和Al(OH)₃形成颗粒。进行深入研究来分析缓冲液如何干扰颗粒化。根据目测，由强到弱的干扰顺序如下：

        PBS＞TBS/Tris＞MES＞1％乙酸＝H₂O

PBS甚至在稀释20倍时仍保持其作用。但是，在此水平上观察到Tris/HCl基本无效。

用溶解BSA的H₂O、PBS、TBS、100mM、50mM、20mM和10mM Tris-HCl，pH7.3进一步研究这些观察结果。由于BCA的干扰，不能评价BSA的100mM和50mM Tris溶液的作用(无法制备BSA标准品的100mM和50mM Tris溶液)。在0.1％铝胶(等于0.15％Al(OH)₃)的情况下，当分别用PBS、20mM Tris、10mM Tris和H₂O稀释时，每mg Al(OH)₃结合156μg、325μg、323μg和326μg BSA。除了BSA/PBS以外，几乎所有的BSA(最大值除外)都与Al(OH)₃的Tris或H₂O溶液结合。BSA的实际结合能力可能更高。在一个Al(OH)₃获得最高值的单独实验中，当用H₂O稀释时每mg Al(OH)₃结合高达500μg的BSA。

这些结果表明，SARS S ΔTM的PBS溶液可与Al(OH)₃形成颗粒，但方式低效，原因在于磷酸阴离子的干扰。如果需要SARS S ΔTM与Al(OH)₃形成颗粒，则用SARS S ΔTM的水溶液或10/20mM Tris溶液可能更好。

以下的编号段落进一步描述了本发明：

1.分离的SARS蛋白，或体内和/或体外表达所述蛋白的载体，例如质粒、重组病毒，如重组杆状病毒。

2.段落1的分离的SARS蛋白，其重组表达。

3.段落2的分离的SARS蛋白，其由重组病毒或段落1的为重组病毒的载体表达。

4.段落2的分离的SARS蛋白，其由DNA质粒或段落1的为DNA质粒的载体表达。

5.段落3的分离的SARS蛋白，其由重组杆状病毒或段落3的为重组杆状病毒的病毒表达。

6.任何前述段落的分离的SARS蛋白或其表达载体，其中蛋白为S、M、E或N，或其表位片段或其组合。

7.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为S蛋白。

8.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为S1。

9.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为S2。

10.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为S的免疫原性片段。

11.段落10的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为S的表位。

12.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为M蛋白。

13.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为M的免疫原性片段。

14.段落13的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为M的表位。

15.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为N蛋白。

16.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为N的免疫原性片段。

17.段落10的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为N的表位。

18.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为E蛋白。

19.段落6的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为E的免疫原性片段。

20.段落10的分离的SARS蛋白或其表达载体，其为E的表位。

21.任何前述段落中的分离的SARS蛋白或其表达载体，其由第一载体(如杆状病毒)表达产生，第一载体通过涉及第二转移载体(例如质粒)的同源重组方法制备，第二载体含有第一载体中的外源核酸分子，其中制备的转移载体(例如质粒)具有限制位点；转移载体的制备包括用在限制位点远处切割的酶以此切割方式(酶在远处切割)切割载体，由此将限制性位点由转移载体中切除，而转移载体具有独特的粘性末端；在单独的反应中，进行聚合酶链反应或其它扩增反应，由此使限制位点成为反应扩增产物的一部分；用远处切割酶切割扩增产物，由此使扩增产物具有独特的粘性末端；以及，连接具有独特粘性末端的转移载体和具有独特粘性末端的扩增产物，以此避免间插的核酸分子。

21.任何前述段落的SARS蛋白，其被纯化至至少90％或90％以上，或至少95％或95％以上。

22.免疫原性、免疫性或疫苗组合物，其含有或基本由或由任何前述段落中的SARS蛋白或表达SARS蛋白的载体组成。

23.段落22的组合物，其中SARS蛋白被纯化至至少90％或90％以上，或至少95％或95％以上。

24.段落22或23的组合物，其包含载体或稀释剂和/或佐剂。

25.一种在易感染宿主中激发抗SARS的免疫应答的方法，其因此包括给予宿主段落22的组合物或任何前述段落中的蛋白或载体。

26.段落25的方法，其中给予为注射或口服或粘膜或局部给予。

27.一种抗SARS蛋白的抗体，其由任何前述段落中的蛋白或载体激发。

28.段落27的抗体，其为S蛋白特异性的。

29.段落27或28的抗体，其为单克隆抗体。

30.一种诊断试剂盒或实验，其包含段落29的单克隆抗体或任何前述段落中的蛋白。

31.一种检测SARS的方法，其包括检测样品中的抗原与段落29的单克隆抗体结合的情况，或检测样品中的抗体与任何前述段落中的蛋白结合的情况。

32.一种抗流感疫苗，其中改进包括其含有或表达任何前述段落中的SARS蛋白或任何前述段落中的载体。

33.一种抗肺炎疫苗，其中改进包括其含有或表达任何前述段落中的SARS蛋白或任何前述段落中的载体。

34.一种抗流感疫苗，其中改进包括其含有或表达任何前述段落中的SARS蛋白或任何前述段落中的载体，并且其包含或表达肺炎球菌蛋白。

35.一种抗肺炎球菌疫苗，其中改进包括其含有或表达任何前述段落中的SARS蛋白或任何前述段落中的载体，并且其包含或表达流感病毒蛋白。

36.任何前述段落中的组合物，其在喷雾器中或为气溶胶形式或在喷雾分配器中，这些喷雾器、气溶胶形式或喷雾分配器计划鼻内给药。

37.任何前述段落中的组合物，其中存在或表达的SARS蛋白来自不止一个分离株，例如至少2或3个分离株，如3个分离株。

38.任何前述段落中的组合物，其中存在或表达的流感病毒蛋白为HA和/或NA和/或M2。

39.任何前述段落中的组合物，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自一个或多个流感病毒株，例如两个或更多个流感病毒株，如三个不同流感病毒株。

40.一种用于制备任何前述段落中的组合物的试剂盒，其包含：(a)在一个或多个容器中的SARS蛋白或表达SARS蛋白的载体，和/或(b)在一个或多个容器中的流感病毒蛋白或表达流感病毒蛋白的载体，和/或(c)在一个或多个容器中的肺炎球菌蛋白或表达肺炎球菌蛋白的载体，其中所述试剂盒可选地含有给予组合物和/或成分混合物的说明书，所述容器可选地在相同包装中。

41.一种制备第一载体(如杆状病毒)的方法，第一载体通过涉及第二转移载体(例如质粒)的同源重组方法制备，第二载体含有第一载体中的外源核酸分子，其中制备的转移载体(例如质粒)具有限制位点；转移载体的制备包括用在限制位点远处切割的酶以此切割方式(酶在远处切割)切割载体，由此将限制性位点由转移载体中切除，而转移载体具有独特的粘性末端；在单独的反应中，进行聚合酶链反应或其它扩增反应，由此使限制位点成为反应扩增产物的一部分；用远处切割酶切割扩增产物，由此使扩增产物具有独特的粘性末端；以及，连接具有独特粘性末端的转移载体和具有独特粘性末端的扩增产物，以此避免间插的核酸分子。

42.段落41的方法，其中所述方法用于连接前导序列的核酸分子和目的蛋白的编码核酸分子。

43.任何段落的方法，其中所述酶为SapI。

44.一种分离的蛋白或表达该蛋白的载体，其由第一载体表达产生，第一载体(如杆状病毒)通过涉及第二转移载体(例如质粒)的同源重组方法制备，第二载体含有第一载体中的外源核酸分子，其中制备的转移载体(例如质粒)具有限制位点；转移载体的制备包括用在限制位点远处切割的酶以此切割方式(酶在远处切割)切割载体，由此将限制性位点由转移载体中切除，而转移载体具有独特的粘性末端；在单独的反应中，进行聚合酶链反应或其它扩增反应，由此使限制位点成为反应扩增产物的一部分；用远处切割酶切割扩增产物，由此使扩增产物具有独特的粘性末端；以及，连接具有独特粘性末端的转移载体和具有独特粘性末端的扩增产物，以此可避免间插的核酸分子。

这样已经详细地描述了本发明的优选实施方案，要理解的是，由所附权利要求书限定的本发明不限于以上描述提出的具体细节，因为本发明有可能存在多种显著变化，而不偏离本发明的精神和范围。

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Claims (56)

1.一种分离的SARS蛋白，或体内和/或体外表达所述蛋白的载体，例如质粒、重组病毒，如重组杆状病毒。

2.权利要求1的分离的SARS蛋白，所述蛋白重组表达。

3.权利要求2的分离的SARS蛋白，所述蛋白由重组病毒表达。

4.权利要求1的载体，所述载体为重组病毒。

5.权利要求2的分离的SARS蛋白，所述蛋白由DNA质粒或权利要求1的为DNA质粒的载体表达。

6.权利要求3的分离的SARS蛋白，所述蛋白由重组杆状病毒或权利要求3的为重组杆状病毒的病毒表达。

7.权利要求1的分离的SARS蛋白或其表达载体，其中所述蛋白为S、M、E或N，或其表位片段或其组合。

8.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为S蛋白。

9.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为S1。

10.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为S2。

11.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为S的免疫原性片段。

12.权利要求11的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为S的表位。

13.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为M蛋白。

14.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为M的免疫原性片段。

15.权利要求14的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为M的表位。

16.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为N蛋白。

17.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为N的免疫原性片段。

18.权利要求11的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为N的表位。

19.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为E蛋白。

20.权利要求7的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为E的免疫原性片段。

21.权利要求11的分离的SARS蛋白或其表达载体，所述蛋白为E的表位。

22.权利要求1的分离的SARS蛋白或表达所述蛋白的载体，其由第一载体如杆状病毒表达产生，第一载体通过涉及第二转移载体例如质粒的同源重组方法制备，第二载体含有第一载体中的外源核酸分子，其中制备的转移载体例如质粒具有限制位点；转移载体的制备包括用在限制位点远处切割的酶以此切割方式(酶在远处切割)切割转移载体，由此将限制性位点由转移载体中切除，而转移载体具有独特的粘性末端；在单独的反应中，进行聚合酶链反应或其它扩增反应，由此使限制位点成为反应扩增产物的一部分；周远处切割酶切割扩增产物，由此使扩增产物具有独特的粘性末端；以及，连接具有独特粘性末端的转移载体和具有独特粘性末端的扩增产物，以此避免间插的核酸分子。

23.权利要求1的SARS蛋白，所述蛋白被纯化至至少90％。

24.权利要求1的SARS蛋白，所述蛋白被纯化至至少95％。

25.一种免疫原性、免疫性或疫苗组合物，其含有或基本由或由权利要求1的SARS蛋白或表达SARS蛋白的载体组成。

26.权利要求25的组合物，其中SARS蛋白被纯化至至少90％。

27.权利要求26的组合物，其中SARS蛋白被纯化至至少95％。

28.权利要求25的组合物，所述组合物包含载体或稀释剂和/或佐剂。

29.一种在易感染宿主中激发抗SARS的免疫应答的方法，因此所述方法包括给予宿主权利要求25的组合物。

30.一种在易感染宿主中激发抗SARS的免疫应答的方法，因此所述方法包括给予宿主权利要求1的蛋白或载体。

31.权利要求30的方法，其中通过注射或口服或粘膜或局部给予。

32.权利要求30的方法，其中通过注射或口服或粘膜或局部给予。

33.一种抗SARS蛋白的抗体，所述抗体由权利要求1的蛋白或载体激发。

34.权利要求33的抗体，所述抗体为S蛋白特异性的。

35.权利要求33的抗体，所述抗体为单克隆抗体。

36.一种诊断试剂盒或实验，其包含权利要求35的单克隆抗体。

37.一种诊断试剂盒或实验，其包含权利要求1的蛋白。

38.一种检测SARS的方法，所述方法包括检测样品中的抗原与权利要求35的单克隆抗体结合的情况。

39.一种检测SARS的方法，所述方法包括检测样品中的抗体与权利要求1的蛋白结合的情况。

40.一种抗流感疫苗，其中改进包括疫苗含有或表达权利要求1的SARS蛋白或权利要求1的载体。

41.一种抗肺炎疫苗，其中改进包括疫苗含有或表达权利要求1的SARS蛋白或权利要求1的载体。

42.一种抗流感疫苗，其中改进包括疫苗含有或表达权利要求1的SARS蛋白或权利要求1的载体，并且疫苗另外包含或表达肺炎球菌蛋白。

43.一种抗肺炎球菌疫苗，其中改进包括疫苗含有或表达权利要求1的SARS蛋白或权利要求1的载体，并且疫苗另外包含或表达流感病毒蛋白。

44.权利要求22的组合物，所述组合物在喷雾器中或为气溶胶形式或在喷雾分配器中，这些喷雾器、气溶胶形式或喷雾分配器计划鼻内给药。

45.权利要求22的组合物，其中存在或表达的SARS蛋白来自不止一个分离株。

46.权利要求45的组合物，其中存在或表达的SARS蛋白来自至少两个分离株。

47.权利要求46的组合物，其中存在或表达的SARS蛋白来自至少三个分离株。

48.权利要求40的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白为HA和/或NA和/或M2。

49.权利要求42的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白为HA和/或NA和/或M2。

50.权利要求48的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自一个或多个不同的流感病毒株。

51.权利要求50的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自至少两个不同的流感病毒株。

52.权利要求51的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自至少三个不同的流感病毒株。

53.权利要求49的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自一个或多个不同的流感病毒株。

54.权利要求53的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自至少两个不同的流感病毒株。

55.权利要求54的疫苗，其中表达或存在的流感病毒蛋白来自至少三种不个的流感病毒株。

56.一种用于制备权利要求22的组合物的试剂盒，其包含：(a)在一个或多个容器中的SARS蛋白或表达SARS蛋白的载体，和/或(b)在一个或多个容器中的流感病毒蛋白或表达流感病毒蛋白的载体，和/或(c)在一个或多个容器中的肺炎球菌蛋白或表达肺炎球菌蛋白的载体，其中所述试剂盒可选地含有给予组合物和/或成分混合物的说明书，所述容器可选地在相同包装中。

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