CN86102640A

CN86102640A - 用重组dna技术制备乙型肝炎颗粒的方法

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Publication number: CN86102640A
Application number: CN198686102640A
Authority: CN
Inventors: 约翰·S·萨尔斯特罗姆; 马克·L·罗尔伯; 翰斯·索马
Original assignee: Andotronix Co
Current assignee: Andotronix Co; Endotronics Inc
Priority date: 1985-04-15
Filing date: 1986-04-15
Publication date: 1987-04-08
Also published as: ATE139795T1; JPS6255088A; DE3650536D1; ES553953A0; AP8600035A0; IL78472A0; IE860965L; SG43220A1; EP0198474B1; EP0719863A1; ES8802440A1; FI861417A0; ZA862797B; DE3650536T2; EP0198474A1; HK1003794A1; YU60986A; IL78472A; IE75355B1

Abstract

带有Pre S₁- Pre S₂- S蛋白质编码区但不含编钠乙型肝炎核心抗原的序列的细菌质粒，用来转染真核细胞系，以生产含有由Pre S₁- Pre S₂- S蛋白质编码区编码之多肽的颗粒。

Description

本发明是关于载有Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区、但缺少对乙型肝炎核心抗原进行编码的序列的细菌质粒，这种细菌质粒可用于转染真核细胞系以生产含有由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区所编码的多肽的颗粒。

遗传工程上最近的一些进展已能使若干种肽和蛋白质较多量地在细菌、酵母以及哺乳动物细胞中得到表达。尽管许多蛋白质和肽已能以相当数量在细菌中表达，人们仍然希望使那些应用于人类医学的蛋白质和多肽能在哺乳动物细胞中大量地得到表达，以避免由细菌细胞或由在细菌细胞中的表达所产生的任何污染产品所带来的种种缺点。

人们对各种乙型肝炎表面抗原蛋白在哺乳动物细胞中的表达有特殊的兴趣。这类多肽在哺乳动物细胞中的表达速率目前还不够高，不能满足工业化生产的要求。

乙型肝炎病毒在人类的传播能引起使人衰弱的慢性病，造成肝脏严重受损、原发癌和死亡，在许多情况下，患乙型肝炎后有可能完全康复。但是乙型肝炎病毒传染在许多非洲和亚洲国家中流行。这些国家人口中很大一部分的人是乙型肝炎病毒的慢性带毒者。所以有进一步传播乙型肝炎的潜在危险。

注射疫苗是已知的唯一抗乙型肝炎病毒的保护方法。最近，一些公司（例如美国的Merck、Sharp和Dohme公司，法国的Pasteur Institute）已在推销一种用血浆制成的防乙型肝炎病毒疫苗。该疫苗中含有乙型肝炎病毒蛋白作为抗原，这些蛋白在正常情况下是存在于乙型肝炎病毒颗粒的膜上。这种抗原一般被称为乙型肝炎病毒表面抗原（HBs Ag），并将编码这种抗原的病毒基因称为HBs Ag基因。上述的疫苗含有由分离乙型肝炎病毒感染的人血浆而得到的表面抗原。虽然这种表面抗原本身并不致病，但它能刺激人体产生针对乙型肝炎病毒的各种抗体。

工业上生产乙型肝炎表面抗原的唯一原料是感染有乙型肝炎病毒的人的血液。从人的血清中分离和纯化这种表面抗原是一个既麻烦又费时的过程，故其成本较高。而且，只要人血清仍是工业生产表面抗原的唯一原料，能供疫苗使用的表面抗原的量就将是有限的。

为了大规模地-特别是在乙型肝炎病毒流行的地区-应用疫苗，极为重要的是要找到一种既便宜，实际上又不受限制的生产乙型肝炎病毒表面抗原的原料。因为从人血清中提取表面抗原时有各种致病物污染的潜在危险，人们希望避免以人血清作为表面抗原的原料。除人类和黑猩猩外，也没有乙型肝炎病毒能在其中生长和传播的生物系统。

最近的分子生物成就已经表明，无性繁殖乙型肝炎病毒的全部基因组的序列是可能的（Siddiqui，A.等人，Proc.Natl.Aca.Sci.，U.S.A.，Vol.76，p.4664，1979;Sninsky，J.J.等人，Nature，Vol.279，p.346，1979;Charnay，P.等人，Nucl.Acids Res.，Vol.7p.335，1979）。此外，对应于乙型肝炎病毒的不同病毒蛋白的各个编码区也已被识别（例如可以参看：欧洲专利申请公开号13828、20251和38765;Galibert等人，Nature，Vol.281，pp.646-650，1979;Pasek等人，Nature，Vol.282，pp.575-579，1979;Valenzuela等人，Nature，Vol.280，pp.815-819，1979）。

根据这些成就，为了表达编码乙型肝炎病毒表面抗原蛋白的病毒染色体组的上述部分，人们已经试验了一些宿主系统。

对于许多情况已经证明，细菌可以提供生产某些真核细胞产品的低成本生产系统。但已观察到，真核细胞产品在细菌内合成时有许多困难。例如：

1）真核细胞结构基因不易在细菌中得到有效率的复制，这是因为细菌中的密码用途不同于真核细胞中的密码用途。

2）真核细胞基因产物对宿主细菌细胞可能有毒性;

3）真核细胞基因产品的结构和功能也许依赖于某些后转译过程（post-translational process），如糖基化和二硫键的特殊连接过程，这两种过程都不能由细菌宿主来完成;

4）仅仅在很少情况下基因产品才能自细菌宿主细胞释放出来;

5）真核细胞启动子通常对细菌不起作用，而须由细菌启动子替代之，这种替代会造成改变真核细胞基因产品的后果，即，产品的N-末端部分来自于细菌，该部分含N-甲酰蛋氨酸作为起始氨基酸，而后者在真核细胞中并不存在，它会产生一个新的对于哺乳动物免疫系统的免疫原决定因素;

6）在纯化过程中，细菌细胞壁成分会与基因产品一同被纯化出来，它对使用基团产品的哺乳动物受者能引起严重的变态反应或导致过敏性休克。

对细菌生产的乙型肝炎表面抗原也一直存在各种问题。首先，细菌的生产速率很低，此外，纯化过程必须自细菌溶胞物开始，原因是产品不能从细菌细胞中释放出来。另一个问题来自这样的事实：有些后转译过程在细菌中并不存在，例如表面抗原的糖基化过程，此过程对免疫应答的水平和特异性有影响。这些理由中的任何一个都是不希望以细菌作为生产宿主的原因。

经过用含有乙型肝炎表面抗原编码序列的重组载体予以转化的酵母细胞能在酵母培养基中合成和积累相当大量的所说表面抗原。但是这种宿主系统也存在一些严重缺点，即，1）表面抗原不能从酵母细胞中释放出来，而必须从这种细胞的细胞溶胞物中分离出来，2）和从哺乳动物细胞中释放出来的表面抗原不同，由酵母细胞制得的表面抗原单体不能形成以共价连结的二聚体。

人们对建立生产表面抗原的哺乳动物细胞系已进行了一些尝试。这些细胞系有从人肝细胞癌得到的（Alexander，J.J.等人，Afr.Med.J.，Vol.50，p.2124，1976），也有从用克隆的乙型肝炎病毒DNA转染的细胞得到的。另外，猴肾细胞已用带有40%乙型肝炎病毒基因组的猴病毒40基（SV-40-based）重组DNA载体进行了感染（Laub，O.等人，J.of Virol.，Vol.48，p.271，1983）。联合转染方法也已用来选择表达表面抗原的细胞系（Standring，D.N.等人，J.of Voirol.，Vol.50，p.563，1984）。二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的增强方法已被应用于建立能产生较大量抗原的哺乳动物细胞系（Michel等人，Proc.Natl.Aca.Sci.，Vol.81，p.7708，1984）。同样，人们已选择利用转化了的表型作为可选择标志（Hsiung，N.等人，Molec.and Applied Genetics，Vol.z，p，497，1984）的真核细胞病毒载体来将表面抗原转移到哺乳动物细胞中。在这些情况下，是用含有致瘤DNA序列或来自致瘤病毒的DNA序列的DNA结构来选择能产生表面抗原的细胞系。当把通过这些细胞制得的表面抗原用于疫苗时，采用癌基因序列作为选择标志是否安全就成为新的问题。

一些文献中讨论了由乙型肝炎病毒编码序列合成的多肽的表达问题。

欧洲专利申请公开号013，828-A1（EPA013，828）（1980年8月8日公开）中谈到，在用来产生对于生产具有乙型肝炎表面抗原的抗原性的多肽有用的重组DNA载体的片段中，也可以含有这样一些核苷酸序列：它们负责对HBV基因组中其位置刚刚在S蛋白编码区之前的长度为163个氨基酸的一段钛链（Pre S编码区）进行编码。该文献还谈到，含有前体序列、也含有HBs Ag结构基因的基因片段，可以在构建一种克隆载体之前，或者在构建过程中，利用一种或多种限制性核酸内切酶而被切开。该文献进一步谈到，位于负责对HBs Ag进行编码的结构基因之前的上述含163个氨基酸的密码前体，应在利用含有S蛋白编码序列的克隆化载体进行转译过程之前，从载体上被切开。

欧洲专利申请公开号072，318-82（EPA072，318）（公开于1983年2月16日）中描述了一种通过使用一种载体转化的酵母细胞生长来产生HBs Ag的方法，该载体中含有酵母复制子、一种酵母启动子以及一种负责对S蛋白进行编码的DNA碎片，其中特别排除了位于负责对HBs Ag进行编码的结构基因之前的163密码前体。该文献中还介绍了含有一种HBs Ag抗原的疫苗以及一种通过从对HBs Ag免疫的动物的血清中提纯HBs Ag抗体以获取这种抗体的方法。其中也介绍了一种能与HBs Ag抗体形成一种免疫复合物的14～18毫微米的抗体颗粒。

从Feitelson等人在Virology（Vol.130，pp.75-90，1983）中所述可见，若干种与表面抗原有关的多肽可以在Pre S编码序列部分地得到编码，其中包括24，000、28，000、32，000、43，000和50，000道尔顿的一些种类。

Laub等人在J.Virol.（Vol.48，No.1.pp.271-280，1983）中，描述了一种猴病毒40早期替换载体的构建过程，该载体具有一种负责对HBs Ag进行编码的结构基因，包括刚好位于该基因之前的163密码前体序列;他们还描述了通过用这种载体予以转化了的SV40转化CV-1细胞（COS细胞）来表达编码序列的过程。Laub等人还介绍说，与用含有刚好位于对HBs Ag进行编码的结构基因之前的163密码前体予以转化的COS细胞所能表达的HBs Ag相比较，用只含有S蛋白编码序列的载体予以转化的COS细胞所能表达的HBs Ag更多。

Takeda化学品工业公司的日本专利申请J5-8194-897-A（1983年11月12日公开）（Takeda Ⅰ）介绍了一种负责对完全Pre S-S蛋白多肽进行编码的乙型肝炎病毒（简记为HBV）DNA（adw亚型）、含有这种DNA的载体以及由这种DNA转化的宿主。Takeda化学品工业公司的公开于1984年5月10日的日本专利申请J5-9080-615-A（Takeda Ⅱ）介绍了一种负责对完整Pre S-S蛋白多肽进行编码的HBV-DNA（adw亚型）以及由这种DNA所产生的多肽及其在疫苗方面的应用。Takeda化学品工业公司的公开于1984年4月27日的日本专利申请J5-9074-985-A（Takeda Ⅲ）介绍了一种含有一种或多种完整adw型Pre S-S蛋白编码序列、S蛋白编码序列或乙型肝炎病毒核心抗原（HBs Ag）编码序列，含有这种DNA的载体以及用这种DNA转化的宿主。Takeda Ⅲ中谈到，这种由Pre S-S蛋白编码序列编码的43，000道尔顿的多肽“也许可以用做预防HBV感染的疫苗”。Takeda Ⅲ中还介绍了Pre S-S蛋白编码序列在大肠杆菌中的克隆化和通过这种序列所产生的多肽的识别方法。

Gerlich在1983年10月18日提交给在波洛尼亚的欧洲临床微生物学协会的一份报告中指出：从克隆化了的HBC-DNA的DNA序列中已推断出四种可能的HBV基因;对应于HBV表面蛋白的基因（S-基因）由一种未被打乱的编码序列所构成，它被转译成至少三种多肽;大蛋白P24及其糖基化形式GP27的序列自S-基因的第三保留转译起始信号开始;小表面蛋白GP33或GP36自第二起始信号开始;只有HBV的P41多肽有可能应用S-基因的完整编码序列;P41带有HBV的主要抗原决定因子;此因子仅存在于完整的病毒颗粒中，而并不存在于由其制得目前的各种乙型肝炎疫苗的20豪微米剩余表面抗原颗粒中。在Gerlich的报告中，并没有关于P41的Pre S₁区的具体内容，也没有关于Pre S区特别含有一种有可能应用在一种HBV疫苗中的抗原决定因子的内容。

Stibbe等人（Developo Biol.Standard Vol.54，pp.33-43，1983）在关于病毒性肝炎的第二届世界卫生组织/IABS讨论会（雅典）：《肝炎病毒感染免疫预防的标准校验》（1982年，希腊，雅典）中报告说，从感染有HBV的人血清中分离出的颗粒至少含有三种小蛋白-GP33、GP36和P41-它们是由十二烷基硫酸钠胶电泳所检定的。Stibbe等人作出这样的结论：GP33和GP36可能不是HBV疫苗的主要成分。在Sttibbe等人的报告中，并没有关于P41的Pre S1区的具体内容，也没有关于该区特别含有一种有可能应用在一种HBV疫苗中的抗原决定因子的内容。

Stibbe等人（J.Virol.，Vol.46，No.2，pp.626-628，1983）介绍说，来自于HBs Ag编码区的称为GP33和GP36的小糖蛋白是由Pre S₂-S蛋白编码区负责编码的。Pre S₂区是乙型肝炎病毒基因组中Pre S编码区的一部分，它负责对刚好位于S蛋白之前55个氨基酸进行编码。

Nenrath等人介绍说（Science，224，pp.392，394，1984），一种具有和Pre S₂区的末端氨基的26个氨基酸的序列相同的序列的多肽能起到高效免疫原的作用，并且提出：可利用由该免疫原诱发的抗体进行诊断试验。

Heerman等人（J.Virol.，Vol.52，No.2，pp.396-402，1984）描述了含有S蛋白编码序列，也含有Pre S编码序列的389个氨基酸的整个编码序列，它负责下述多肽的编码：在天然得到的HBV颗粒中和在病毒表面抗原丝状体中找到的一种多肽，即P39，及其糖基化形式，即GP42，以及其它HBV抗原伴生的多肽P24、GP27、GP33和GP36。Heerman等人还透露道，为P39/P42蛋白所独有的部分，即其Pre S₁区，可以结合已由HBV颗粒的免疫作用所诱发的抗体。他们提出：这种Pre S₁区可能具有高的免疫原性。Pre S₁区是Pre S编码区中刚好位于Pre S₂区之前的那一部分，此部分由负责对1-108号氨基酸（或1-122号氨基酸，这取决于病毒的亚型）进行编码的各编码区所组成，它是一段刚好位于Pre S₂编码序列之前的氨基酸链。Heerman等人还陈述说，为了寻求具有免疫原性和保护作用的多肽或寡肽作为一种抗HBV的互生疫苗，Pre S区的各个序列可能是很重要的。

Michel等人（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，Vol.81，pp.7708-7712，1984）描述了载有人血清多清蛋白（polyalbumin）接受体的HBs Ag在转染了载有Pre S₂-S蛋白编码序列的质粒的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的合成过程。

Cattaneo等人在“Nature，Vol.305，pp.335-338，1985”中透露道，HBV基因组的S基因是在Pre S区的首端（即在S基因上游的489个核苷酸或163个密码子）开始转译过程的，而m RNA是在核心基因中某一位点形成/多腺苷酸氏的。

Persing等人在“Proc.Natl.Acad.Sci.V.S.A.，Vol.82，pp，3440-3444，1985”中透露，用一种Pre S₂-S蛋白编码序列转化的鼠细胞产生三种与HBs Ag有关的多肽，其分子量分别为24，000、27，000和35，000道尔顿，这三种多肽均被有机化为与聚合人血清清蛋白（HSA）结合在一起的复杂的免疫活性HBs Ag颗粒，该粒经为20毫微米;而用在Pre S₂区的3′末端附近有移码突变的Pre S₂-S蛋白编码序列转化的鼠细胞只产生24，000和27，000道尔顿的多肽，它们被有机化为粒经22毫微米的免疫活性HBs Ag颗粒，这些颗粒不能与HSA结合。Persing等人作出结论：Pre S₂-S蛋白编码序列可以对分子量为35，000道尔顿的一些多肽进行编码;Pre S₂编码部分是造成HBs Ag的HSA结合活性的原因，但并不是为HBs Ag颗粒的集合与分泌所必需;HBs Ag的特优多肽（即分子量为24，000的一些种类）不能通过简单地解离为Pre S₂-S蛋白编码序列所编码的较大前体（即分子量为27，000和35，000的一些种类）而获得。

Milich等人在“Science，Vol.228，pp.1195-1199，1985”中透露。含有带Pre S₂-S的氨基酸和HBs Ag的氨基酸的HBs Ag颗粒-这种颗粒是由转染有含Pre S₂-S蛋白编码序列的质粒的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞所分泌的-可以防止对仅含有HBs Ag的各种疫苗的不应答现象的发生，这是由于对HBs Ag的免疫应答与对Pre S₂的免疫应答无关;在由Pre S₂-S蛋白负责编码的33，000道尔顿多肽的氨基末端的26个氨基酸残基代表在Pre S₂区中的优势抗体结合部位。

Neurath等人在“Nature，Vol.315，pp.154-156，1985”中公开了下述内容：Pre S₂区负责编码带有肝细胞可专门识别的区域的HBV膜上的蛋白质;Pre S₂-S蛋白负责编码存在于HBV颗粒中的一种蛋白质;与负责对基因进行编码的Pre S₂相对应的各种多肽具有高的免疫原性;结论是：HBV疫苗应含有Pre S₂。

Valenzuela于1985年5月15日在波士顿召开的Bio-Expo-5会议上公开了如下内容：完整Pre S₂蛋白编码序列在酵母中的表达;这些酵母细胞确实能够合成一种含有HBs Ag和Pre S₂多肽的颗粒，这种颗粒在电子显微镜下的形态及其沉降性质和只含有HBs Ag的各种颗粒极为相似;Pre S₂区对形成22毫微米HBs Ag颗粒的能力并无影响。Valenzuela还说，可以假设，HBV是这样进入肝脏的：它先使多清蛋白与其多清蛋白受体结合，然后此受体又与肝细胞中的多清蛋白受体结合，于是HBV病毒便进入肝中。HBV的多清蛋白接受体是由Pre S₂区编码的。Valenzuela作出结论：含有Pre S₂的各种疫苗可以诱发出这样的抗体;它们除通过正常的机制使HBV失活外，也许还能干扰HBV进入肝细胞的方式。也可以参看Valenzuela等人在“Bithechnology，Vol.3，pp.317-320，1985”中所述。

Valenzuela等人在“Biotechnology，Vol.3，pp.323-327，1985”中公开由Pre S₂编码序列编码的HBs Ag多清蛋白受体作为制备多价疫苗的一种手段的应用方法。Valenzuela通过在酵母中表达完整的HBV1gD-Pre S₂S蛋白编码序列而制成了一种杂种HBs Ag-疱疹单式Ⅰ病毒糖蛋白D（HSVID）颗粒。

Newrath等人在欧洲专利申请公开号0，154，902-Az（公开于1985年9月18日）中描述了这样一种乙型肝炎疫苗：它含有一种带有一个至少由6个连续氨基酸所组成的氨基酸链的肽，此肽在乙型肝炎病毒膜的Pre S基因编码区。这种疫苗中不含有相应于天然存在的乙型肝炎病毒膜蛋白的氨基酸序列以及生理上可接受的稀释剂。上述肽是游离的，或也以与一种载体连结。Neurath的欧洲专利申请对下述两个较早的美国专利申请要求了优失权：U.S.Serial.No.587，090（1984年3月7日提交）和U.S.Serial No698，499（1985年5月2日提交）。

Kent等人在“Pept.Chem.，Vol.22，pp.167-70，1984”公开了下述内容：用化学方法合成的一种含有Pre S₂区N-末端26个氨基酸的肽是一种极好的抗原，也是可供合成疫苗选择的良好抗原。

Lo等人在“Biochem.Biophys.Res.Comm.，Vol，129，No，3，pp.797-803，1985”中透露了对不同亚型（adw、adr、ayw和adyw）的HBV的完整HBV DNA的限制性核酸内切酶图鉴定方法，包括完整Pre S区的限制性核酸内切酶图鉴定方法。Lo等人还公开了应用一种pUC8′表达载体在大肠杆菌中克隆化和表达完整HBV DNA的方法，并且声称，他们要将这种在原核细胞或真核细胞中表达的HBV基因产物作为诊断试剂或作为疫苗源使用。

Wong等人在“J.Virology，Vol.55，No1，pp.223-231，1985”中公开了两种HBV多肽的识别方法，这两种肽是由完整Pre S开读码编码的，即42和46千道尔顿的糖基化多肽，它们含有HBs Ag的决定因子和Pre S区的决定因子。Wong等人还介绍了含有108个氨基酸的一种tribrid融合蛋白的表达〔这108个氨基酸与Pre S区（adw₂亚型）的174个氨基酸的N末端第27至133号氨基酸相对应〕以及β-半乳糖苷酶的序列和氯霉酸乙酰转移酶序列的表达。这种肽含有来自于Pre S₂区的15个氨基酸和来自于Pre S₁区的93个氨基酸。Wong等人还透露了如下内容：（a）tribrid融合蛋白所产生的多克隆抗血清能够检测部分纯化的病毒颗粒制剂中42和46kd（千道尔顿）的多肽，和（b）糖基化的42和46kd多肽看来与Heerman等人所介绍（上文已引用）的39和42kd的未糖基化的多肽相对应。

Offensperger等人在“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.82，pp.7540-7544，1985”中介绍了对Pre S肽-β-半乳糖苷酶融合蛋白进行编码的克隆化DNA序列借助于大肠杆菌的表达。

有若干文献讨论了含有鼠金属硫因（metallothionein）基因的启动子的质粒。

Hamer等人在1982年12月23日提交的序列号为452，783的美国专利申请中，以及Pavlakis等人在“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.80，p.37，1983”中，都介绍了含有人体生长激素（hGH）和一种金属硫因基因（MMT）启动子的重组牛乳头状瘤病毒质粒。

Hofschneider等人在公布于1984年4月11日的欧洲专利申请第EPO，105，141A2号（European Patent Appln.NoEPO，105，141A2）中介绍了含有S蛋白编码序列并含有1型牛乳头状瘤病毒DNA和Maloney老鼠肉瘤病毒DNA中任一种的重组质粒。Hofschneider等人所介绍的这种质粒最好使用与S蛋白编码序列相联系的天然启动子，但Hofschneider的文献中却确实是这样说的（而并非是举例）：“〔a〕较好的天然真核细胞表达信号的另一个例子是来自于老鼠细胞的金属硫因信号。”

Fogel等人在“European Patent Appln.Publication No EPO，096，491A2”中介绍了含有一种完整金属硫因基因序列，包括启动子区的质粒作为使MMT基因的下游基因在用这种质粒转化的哺乳动物宿主中获得强表达的手段的用途。

“University Patent，Inc.”“PCT Patent Appln.Publication NoWO83/01783”（1983年5月26日公开）和Palmiter等人在“Cell，Vol.29，p.701，1982”中介绍了一种含有与一种结构基因（最好是对应于来自于疱疹单式病毒的胸苷激酶的基因）相融合的老鼠MT-1基因启动子的质粒，用这种质粒对老鼠胚胎进行的微量注射，并且介绍：所产生的融合多肽产品在由这些胚胎发育成的成鼠的有差别的细胞中的表达在给予重金属离子后是可调节的（regulable）。Palmiter等人还介绍了含有与大鼠生长激素相融合的鼠MT-1启动子的质粒、用这种质粒对老鼠胚胎进行的微量注射以及用给以重金属来调节基因表达所获的融合多肽产物。

本发明涉及一种通过重组DNA技术制得的颗粒，该颗粒至少含有一种由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质。

本发明还涉及一种重组DNA载体，该载体含有Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区以及一种鼠金属硫因（MMT）启动子。这种载体中最好还含有转录终止位点以及选择标记。

本发明还涉及用含有Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区及MMT启动子的重组DNA载体转染的转染宿主真核细胞。这种载体中最好另外含有转录终止位点及选择标记。这种宿主最好是哺乳动物细胞。此外，本发明涉及一种制备这种转染宿主细胞的方法，该方法包括用本发明的重组DNA载体来转染真核细胞。

本发明还涉及制备含有至少一种由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的颗粒的方法，此法包括：a）在使本发明的转染宿主真核细胞能表达这种蛋白质的培养基条件下培养这种宿主;b）分离出这种颗粒。最好是，这种宿主能够将组成这种颗粒的这种蛋白质集于颗粒中并分泌到培养基中。这种方法最好还包括：于这种培养基内加入重金属离子或类固醇激素，以增强该蛋白质的表达。本发明还涉及由这种方法制得的颗粒。

本发明还涉及由免疫防护量的本发明之颗粒组成的疫苗。

本发明还涉及一种在哺乳动物血清样品中检测对下述蛋白质的抗体的存在的方法：这些蛋白质是由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的;该方法包括：

a）使该样品与一种覆盖有未标记的本发明的颗粒的固体底物相接触;

b）培养和冲洗所说的接触样品;

c）使所说的接触样品与本发明的标记颗粒接触，从而产生一种标记接触样品;

d）培养和冲洗所说的标记接触样品;和

e）测定标记接触样品中的标记颗粒含量。

本发明还涉及一种检测哺乳动物血清样品中下述蛋白质是否存在的方法：这些蛋白质是由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区负责编码的。该法包括：

a）制备一种组合物，它含有由本发明的颗粒所构成的一种免疫原所产生的抗体;

b）使该样品与该组合物的第一部分和已标记的免疫原接触，培养和清洗该第一部分;

c）使一种不含免疫原的对照物与该组合物的第二部分和已标记免疫原接触，培养并清洗此第二部分;

d）于上述步骤b）和c）的组合物中加入相同量的葡萄球菌所带的蛋白A，培养这两种组合物并将液体与固体分开;和

e）测定上步骤d）中所得的各组合物中标记免疫原的含量。

本发明还涉及一种检测一种哺乳动物血清中由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的抗体是否存在用的鉴别药盒（diagnostic kit），它包括：

a）依附于一种固体载体的组成本发明颗粒的未标记蛋白;和

b）用-例如-人Ig G或Ig M的标记抗体。

本发明还涉及一种检测哺乳动物血清样品中由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白是否存在用的鉴别药盒，它含有：

a）由本发明的颗粒所产生的、依附于一种固体载体的抗体;以及

b）由本发明的颗粒所产生的标记抗体。

本发明还涉及一种联合转染的真核细胞宿主细胞，这种宿主细胞是用本发明的重组DNA载体和第二种重组DNA载体联合转染的，第二种重组DNA载体含有Pre S₂-S蛋白编码区-或仅含S蛋白编码区-以及一种MMT启动子。第二种重组DNA载体最好还带有一种转译终止位点，可以含有或不含有一种选择识别物。联合转染宿主也可以任意地用本发明的重组DNA载体、第二种重组DNA载体和第三种重组DNA载体联合转染。此处的第三种重组DNA载体含有一种MMT启动子及一种选择识别物。第三种重组DNA载体最好还含有一种转录终止位点。另外，本发明涉及一种制备这种联合转染宿主细胞的方法，它包括：用本发明的重组DNA载体、上述的第二种重组DNA载体以及上述的第三种重组DNA载体来联合转染一种真核细胞，其中第三种重组DNA载体可以选用或不选用。

本发明还涉及一种制备含有至少一种由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的颗粒的方法，该方法包括：a）在使联合转染的宿主真核细胞能表达这种蛋白质的培养基条件下培养这种宿主;b）分离这种颗粒。最好是，这种联合转染的宿主能够把这种蛋白集中于颗粒中并分泌到培养基中。该方法最好还包括：在这种培养基中加入重金属离子或类固醇激素，以增强这种蛋白质的表达。本发明也涉及用这种方法制得的颗粒。

本发明涉及一种重组DNA多联体，此多联体含有：a）一种载体，它含有Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区以及至少一种含有下列编码区中之一种的载体：Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区或Pre S₂-S蛋白编码区或S蛋白编码区;和b）MMT启动子。这种多联体最好还含有一种选择识别物及一个转译终止位点。这种多联体可采用本领域中已知的方法制得。

本发明还涉及一种用本发明的多联体转染的宿主真核细胞。这种宿主最好是哺乳动物细胞。此外，本发明涉及一种制备用本发明的多联体转染的宿主细胞的方法，此法包括用本发明的多联体对一种真核细胞进行转染。

本发明还涉及一种制备一种颗粒的方法，这种颗粒至少含有一种由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质，该方法包括：a）在使含有本发明的多联体的本发明的转染宿主能表达这种蛋白质的培养基条件下培养这种宿主;以及b）分离出这种颗粒，最好是，这种转染宿主能够把这种蛋白集中到这样的颗粒中并分泌到培养基中。这种方法最好还包括：在这种培养基内加入重金属离子或类固醇激素，以增强这些蛋白质的表达。本发明还涉及由这种方法制成的颗粒。

图中示有pBPV342-12质粒的部分限制核酸内切酶解图。图1中还图示了在质粒pBPV342-12上来自于质粒pML2的DNA、牛乳头瘤病毒（BPV）DNA、MMT启动子以及sv-PAS-t转译终止区所在的位置。图1中也说明了用限制性核酸内切酶分开质粒pBPV342-12的情况。

图2中示有质粒pAO1的一种部分限制性核酸内切酶解图，该质粒含有完整的线形乙型肝炎病毒基因组。图2还说明了用限制性核酸内切酶Eco RI分开pAO1、用T DNA连接酶将Eco RⅠ线形HBV产物连接成多联体以及用限制性核酸内切酶将所得到的多联体产物分开而产生含有对于Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区的完整DNA编码序列的一种特殊DNA片段。

图3中示有质粒pDM1的部分限制性核酸内切酶解图，并且说明了含有质粒pMMT-neo的一种BamHⅠ DNA片段与乙型肝炎病毒的一种编码Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码序列的Bg1Ⅱ基因组片段相连接而构建这种质粒的过程。

图4A和4B中示有质粒pDM2的部分限制性核酸内切酶解图，并且说明了这种质粒通过一种Bam HⅠ限制性核酸内切酶片段和一种BamHⅠ-Bg1Ⅱ限制性核酸内切酶片段相接而构建的过程，这两种片段都来自于质粒pDM1。

图5中示有质粒pDM3的部分限制性核酸内切酶解图，并且说明了该质粒通过pDM1和pMMT-neo而构建的过程。

图6是一种曲线表示图，它说明了本发明的颗粒在一种Bio Rad（A5m）柱中的洗脱图谱。

图7是一种说明本发明的颗粒的一种典型等密度Cs Cl离心分离过程的曲线图，这些颗粒来自于30份第一个峰的洗脱液，该峰是Bio Rad（A5m）柱中产生的。

图8A、8B和8C各图说明了本发明的纯化颗粒的不同稀释液在小鼠身上引起的血清反应阳性转变。

图9A和9B中示有质粒pENDO-1的一种部分限制性核酸内切酶解图并说明了该质粒的多步构建过程。

图10中示有质粒pENDO-2的一种部分限制性核酸内切酶解图，并说明了该质粒通过质粒pENDO-1与质粒pDM2的限制性核酸内切酶DNA片段相互连接而构建的过程。

图11中示有质粒pENDO-0的一种部分限制性核酸内切酶解图并说明了该质粒的构建过程。

术语“Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区”表示负责称为Pre S₁- Pre S₂-S多肽的完整多肽的编码的HBV DNA基因组编码区（它包括从对于起始的蛋白氨酸的密码子直到末尾的规定不插入氨基酸和指示转译终止的终止密码子（TTA）的这一段）或者这种编码区的任何起作用的衍生物。由该区负责编码的蛋白质包括Pre S₁- Pre S₂-S多肽（例如，HBV亚型adw中的389个氨基酸残基）、Pre S₂-S多肽（例如，HBV亚型adw中的281个氨基酸残基）以及S多肽（例如，HBV亚型adw中的226个氨基残基）。较好的Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区来自于下列亚型：adr、ayw、adyw和adw.术语“起作用的衍生物”表示Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区的任何如下所述的衍生物：由这种衍生物编码的多肽被组装为一种颗粒时，在致免疫能力方面能起和下述的一种颗粒实际上相同的作用：这种颗粒是由天然Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区所编码的多肽组装而产生。这些衍生物包括Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区的部分序列，也包括这种编码区经过修饰而得到的衍生物。修饰这种编码区的方法在本领域中是已知的，包括，例如，采用化学或生物诱变剂、照时或直接的遗传工程方法（如利用酶或其它重组体及分子生物学方法插入、除去或取代核酸）进行处理。

术语“Pre S₂-S蛋白编码区”表示HBV DNA基因组的下述区域：此区域负责称为Pre S₂-S多肽的完整多肽的编码，包括对于起始的蛋氨酸的密码子直到（如上面所详细说明的）末尾的规定不插入氨基酸的终止密码子（TAA）的一段;或者表示此编码区的任何起作用的衍生物。由此编码区编码的蛋白质包括Pre S₂-S多肽（HBV亚型adw中的281个氨基酸残基）和S多肽（例如，HBV亚型adw中的226个氨基酸残基）。较好的Pre S₂-S蛋白编码区是从下列各HBV亚型得到的：adr、ayw、adyw和adw。术语“起作用的衍生物”表示Pre S₂-S区蛋白编码区的任何如下所述的衍生物：由这种衍生物编码的多肽被组装成一种颗粒时，就致免疫能力而言能起和下述一种颗粒实际相同的作用：这种颗粒是由天然Pre S₂-S蛋白编码区编码的多肽组装而产生的。这种衍生物包括Pre S₂-S蛋白编码区的部分序列，也包括该编码区经修饰而产生的衍生物。可以用来修饰该编码区的方法在本领域中是已知的，有些修饰方法上文中已作概述。

术语“S蛋白编码区”表示HBV DNA基因组的下述区：此区负责称为S多肽的完整多肽的编码，包括对于起始的蛋氨酸的密码子直到（如上面所详细说明的）末端的规定不插入氨基酸的终止密码子（TAA）的一段;或者表示此编码区的任何起作用的衍生物。由此编码区编码的蛋白质包括S多肽（例如，HBV亚型adw的226个氨基酸残基）。较好的S蛋白编码区是从下列各HBV亚型得到的：adr、ayw、adyw和adw。术语“起作用的衍生物”表示S蛋白编码区的任何如下述的衍生物：由这种衍生物编码的多肽被组装为一种颗粒时，在致免疫能力方面能起和下述的一种颗粒实际上相同的作用：这种颗粒是由天然S蛋白编码区编码的多肽组装而成的。这种衍生物包括S蛋白编码区的部分序列，也包括修饰该编码区所得到的衍生物。可用来修饰该编码区的方法在本技术领域中是已知的，有些修饰方法上文中已作概述。

术语“启动子”表示在一种DNA分子内位于某一基因上游处的DNA序列，该序列指导合适的宿主细胞RNA聚合酶复合物在所说的DNA分子上的某个特定位置上附着于该DNA分子，并指导其正确定位而开始在该DNA的某一特定点上转录该基因，从而合成出各DNA链中某一种的DNA拷贝。

术语“转录”表示通过宿主细胞生物合成系统，包括RNA聚合酶复合物而进行的这样的过程：此过程是用两个互补DNA链中之一种作为模板，以一种连续方式，即从5′端到3′端（对于DNA模板链是从3′端到5′端）聚合各核苷酸，从而产生这两个DNA链中某一种的精确样板，但此样板中含有的是核苷酸而不是脱氧核苷酸。

术语“转录终止序列”表示DNA分子中用t代表的区，该区向参与转录过程的RNA聚合酶复合物发出信号：终止这种转录过程的进行;从而产生能够被适当地处理的一种RNA分子，（处理方式）包括多腺苷酰化和转运这种注定要在宿主细胞质中被用做信息RNA分子的RNA分子。

术语“多腺苷酰化”是指这样的过程：通过该过程，宿主细胞生物合成系统识别出RNA分子内的一个作为多腺苷酰化信号的特殊序列，它通常是5′-AATAAA-3′，此序列用PAS代表;这使在一种非由模板决定的多腺苷酸基（部分）的下游（与3′端所指方向一致）约15～20个核苷处的该RNA分子加成到3′端，这种加成作用是专门通过酶即，poly-A聚合酶完成的。

术语“选择识别物”表示一种基因决定子，在细胞中被表达时，这种决定子赋予该细胞一系列特殊的性质，这些性质使这样一种细胞可以从其他一些不带有或不表达所说的基因决定子的细胞中被区别或选择出来。

较好的一些选择识别物包括抗药识别物。术语“抗药识别物”是指一类特殊的选择标记物，它们赋予一种表达这种识别物的细胞对于一种药物或一种抗菌素的致死作用的抗药性，这种药物或抗菌素一般可以使不带有或不表达所说的抗药识别物的细胞的生长停止或杀死这种细胞。

较好的一些抗药识别物包括抗新霉素基因，即neo的一些编码区;Eco-gpt基因（Mulligan，R.C.和Berg，P.，Science，Vol.209，p.1422，1980），二氢叶酸还原（DHFR）基因（Ringold，G.et al，J.of Molec.and Appld.Genet.，Vol.1，p.165，1981）。

术语“含有至少一种由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的颗粒”是指缺乏任何核酸的一种乙型肝炎颗粒，这种颗粒是在一种用完整Pre S₁、Pre S₂和S区转染的一种真核细胞的培养物溶胞物中形成或由这种溶胞物形成的，其中，这种颗粒含有一些亚单位，这些亚单位主要由S多肽（二聚体）组成，但是它们也可以含有较少量的完整Pre S₁- Pre S₂-S多肽，也可以有选择地含有较少量的Pre S₂-S多肽。

本发明涉及含Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区以及一种MMT启动因子的一种重组DNA载体。MMT启动子可以如下两种方式掺入到该DNA载体中：或在该载体中有对应于该DNA序列的天然启动子（乙型肝炎启动子）存在的情况下掺入，或取代该乙型肝炎启动子的位置而掺入。MMT启动子的位置最好刚好在该DNA载体中的Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区的上游。这种载体最好还含有一种转译终止序列以及一种识别物。这种选择识别物最好是一种抗药识别物，例如新霉素基因。这种转录终止序列是一种SV40终止位点（sv-PAS-t）较好，或者是鼠珠蛋白基因的DEF区（mg-PAs-t）更好。SV40终止序列在本技术领域中是人所熟知的，并且在一些文献中有关于此序列的描述，如：Mullingan和Berg在“Science，Vol.209，p.1422，1980”中所述。Falck-Pederson等人在“Cell，Vol.40，p.897，1985”中描述了鼠珠蛋白基因的DEF区。这种载体可利用普通的重组DNA方法和其它分子生物学方法进行制备。在非常好的情况下，利用mg-PAS-t区时，该载体不含任何病毒DNA链并没有致癌性，即，它不会转化（癌化）任何引入了这种载体的宿主细胞。这种载体转染进入一种宿主后，如果它不含有一种能够在被它转染的一种宿主中起作用的自动复制序列（复制子），则整合到宿主染色体中并被动地与宿主基因组一起进行复制。

本发明的重组DNA载体最好具有下列特征：

1）Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区。

2）刚好位于Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区上游的MMT启动子。

3）为了培育、扩大和制备大量重组DNA载体，该载体应能在细菌中或在由于它进入其中而转化的其他原核动物宿主细胞中复制。因此，这种载体应含有一种细菌或其它原核生物的复制子，即一种具有为了在用这种载体转化的一种原核生物宿主细胞（如一种细菌细胞）中进行这种载体的染色体外复制及维持这种载体所要求的所有功能的DNA链。这种复制子在本领域中是人所熟知的。

4）这种载体复制子应该小（即小于6-8千碱基对），这样才有可能容易地对其进行遗传学和分子生物操作。

5）这种载体应载有一种选择识别物，最好是一种抗药识别物，如抗氨苄青霉素的识别物，这是为了在转化有这种载体的细菌宿主细胞中应用这种载体。

6）这种载体应载有另一种选择标记物，最好是一种抗药识别物，如抗新霉素;这是为了在转染有这种载体的真核细胞宿主细胞中应用此载体。

7）这种载体应含有适于克隆化的核酸内切酶限制位点。

8）这种载体应含有一种转录终止和多腺苷酰化序列。

最佳的是，本发明的载体不含一种能够在一种转染有该载体的真核宿主细胞内起作用的自动复制序列（复制子）。采用一种不能在真核细胞宿主细胞中复制的载体系统的基本原因是，所有能够在一种由其转染的哺乳动物宿主真核细胞中进行自动的和染色体外的复制的载体系统都含有来自于致癌病毒的复制子。人们希望采用含有并非来自致癌病毒的DNA来表达DNA序列，以编码有药物价值的多肽，这种多肽的例子有由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质。

本发明的载体含有MMT启动子。MMT启动子是一种非病毒的强转录启动子。Pavlakis和Hamer在“Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.11，p.397，1983”中描述了MMT启动子的编码序列。MMT启动子可以通过重金属离子，如锌离子和镉离子调节，也可通过类固醇激素如地塞米松调节。这种调节是众所周知的（例如参见Yagle和Palmiter在“Molecular and Cellular Biol，Vol.5，p.291，1985”中所述）。

本发明还涉及一种用本发明的重组DNA载体转化的转染宿主真核细胞。这种宿主是一种哺乳动物细胞较好，是一种中华仓鼠卵巢（CHO）细胞系、一种vero细胞系、一种L-细胞系或一种小鼠成纤维细胞系则更好。这种宿主可按照普通的方法（如Graham和van der Eb在“Virology，Vol.52，p.456，1973”中所述的方法或Wigler，M.在“Cell，Vol.14，p.725，1978”中所述的方法）用本发明的一种重组DNA载体来转染一种真核细胞而制备。

本发明还涉及一种制备颗粒的方法，该颗粒含有由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质，这些蛋白质中至少有一种与由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的多肽相对应;该方法包括：a）在使本发明的转染宿主能表达这些蛋白质的培养基条件下培养这种宿主，和b）分离出这种颗粒。这种联合转染的宿主最好能把这些蛋白质组装成这种颗粒而分泌到培养基中。最好在这种培养基中加入重金属离子或类固醇激素（如地塞米松）以诱发MMT启动子，从而增强这种编码区的表达。以重金属离子如隔或锌为最佳。该培养中所含金属离子或类固醇激素的浓度可用普通的方法定出。

本发明还涉及用上述方法制得的颗粒。如果本发明的转染细胞能够将这种颗粒直接分泌到培养基中，则可用普通的蛋白分离方法从本发明的转染宿主的培养基中分离出这种颗粒。若本发明的转染宿主细胞并不分泌这种颗粒，则这些颗粒是采用普通的培养物溶胞方法从这种宿主的培养物溶胞中得到的。得到的这种颗粒以一种糖基化形式存在，它们是由一些由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质，包括至少一种由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质所组成的。

本发明还涉及一种疫苗，它含有免疫保护量的本发明的颗粒。“免疫保护量”是指本发明的颗粒的量，就是在宿主中诱发和保持足以使一种传染物失效并防止该传染物增殖和由该传染物引起的疾病的抗体所需要的颗粒量（最好是1-20ug）。

本发明的颗粒不含病毒DNA成分，所以不会产生种种不希望的副作用，由天然原料制得的各种疫苗一般会产生这些副作用，如意外地感染了这种病毒、各种过敏反应、发烧等等。本发明的含有免疫保护量的本发明颗粒的疫苗可以用来改善HBV免疫应答和克服对不含有由完整Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的乙型肝炎病毒的不应答现象。

本发明的一种疫苗还通过将免疫有效量的本发明的颗粒混合在一种合适的缓冲液（如用磷酸盐缓冲的盐水）中而制得。该疫苗还可含有一种佐剂，如氢氧化铝等。

另外，也可以将本发明的颗粒中所含的多肽从这种颗粒中解离出来，然后重新结合在一种脂泡中。可以使用这种含有本发明的多肽的脂泡来制备一种抗乙型肝炎病毒的疫苗。合适浓度的脂泡可用做一种具有或不具有一种佐剂（如氢氧化铝）的疫苗。

本发明疫苗的颗粒可与一种生理可接受的稀释剂（介质），如磷酸缓冲盐水一同使用。

可以按照和美国专利4，118，479中所介绍的同样的方法制备和应用含有免疫保护量的本发明颗粒的本发明的疫苗，这里通过引用该篇文献将其全部内容合并于此。

本发明疫苗可通过皮下、皮内或肌肉注射给药。不过较好的给药途经取决于特定的疫苗，一般认为肌肉注射更为适宜。给药频率随疫苗（不同）而变动。

本发明还涉及一种检测哺乳动物血清样品中有无对于由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的抗体存在的方法，此法包括：

a）使该样品与包被有本发明的非标记颗粒的一种固体底物接触;

b）培养弄清洗所说的接触样品;

c）使该接触样品与本发明的标记颗粒接触而制成一种标记接触样品;

d）培养并清洗该标记接触样品;和

e）测定该标记接触样品中标记颗粒的含量。

本发明还涉及一种检测哺乳动物血清样品中由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质存在与否的方法，它包括：

a）制备一种含有由本发明的颗粒组成的免疫原所产生的抗体的组合物;

b）使上述样品与该组合物的第一部分及已标记的该免疫原接触，培养弄清洗该第一部分;

c）使一种不含有抗原的对照物与该组合物的第二部分及已标记的免疫原接触，培养并清洗该第二部分;

d）于上述步骤b）和c）的组合物中加入相同量的葡萄球菌所带的蛋白A，培养这两种组合物并将液体和固体分开;和

e）测定上述步骤d）所得到的各组合物中标记免疫原的含量。

本发明还涉及一种诊断药盒，它用于检测哺乳动物血清样品中对于蛋白质的抗体的存在，这些蛋白质是PreS₁-PreS₂-S蛋白编码的;该诊断药盒含有：

a）附着在一种固体载体上的含有本发明颗粒的未标记蛋白质;和

b）用-例如-人Ig G或Ig M的标记抗体。

本发明还涉及一种诊断药盒，它用于检测哺乳动物血清样品中由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质;此药盒含有：

a）各种抗体，它们是由本发明的颗粒所产生的，它们附着于一种固体载体上;和

b）各种标记抗体，它们是由本发明的颗粒所产生的。

本发明还包括各种诊断试验，这些试验用于直接检测乙型肝炎表面抗原及由这种抗原所诱发出的抗体。采用放射免疫传（RIA）或酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV感染的动物如人类的血清中含有的由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的HBV抗原。有一种诊断试验包括以下各项：

1.用抗体包被含有结合位点的一种固体底物，如聚苯乙烯珠粒，这种抗体是对于含有氨基酸序列的颗粒的抗体，该序列与Pre S₁- Pre S₂-S所带的多肽的氨基酸序列相对应。

2.采用-例如-Tris（即三羟甲基氨基甲烷）缓冲的盐水洗此包被珠以除去多余的抗体;

3.然后使这些珠粒与一种含蛋白质溶液，如牛血清清蛋白（BSA）或白明胶接触，以使这些珠粒上的蛋白结合位点饱和（减少非特异性结合）。可以采用一种合适浓度（如1mg/ml到50mg/ml）的这种含蛋白质溶液;

4.然后洗这些珠粒以除去多余的BSA或白明胶;

5.然后将这些珠粒与怀疑含有HBV或HBV表面抗原的血清样品一起培养（以正常血清作为对照物）;

6.然后用一种溶液，如用Tris缓冲的盐水洗这些珠粒，并将这些珠粒与一种用放射性元素标记的抗体，如¹²⁵I标记的HBV表面抗原抗体相混合;

7.然后培养这些珠粒;以及

8.然后洗这些珠粒并用一种γ计数器对其进行计数。

由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的本发明的颗粒可以用做一种诊断工具，以检测给定样品中的对于HBV表面抗原蛋白的Pre S₁- Pre S₂-S区的抗体。用一种其上带有结合位点的固体底物，例如聚苯乙烯珠粒来吸附含Pre S₁- Pre S₂-S的颗粒。然后使这种底物与一种物质，例如白明胶、BSA或奶粉相接触，使在底物上的非常特异性结合位点饱和。然后用一种缓冲溶液洗此底物，随后除去该缓冲液。把一种用动物血清稀释的样品，如人的血清加到该底物中。培养并清洗所得物。然后于此物中加入对于人的Ig G或Ig M的用放射性元素标记的，如碘代的（¹²⁵I）抗体。培养、清洗所得物并对其进行计数，如用γ计数器计数。如果计数高于由正常血清对照物得到的计数，则该样品中含有对于HBV的Pre S₁- Pre S₂-S编码区的抗体。

对于由HBV的Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白质的抗体检测程序被认为能够用做一种检查乙型肝炎病毒感染的诊断手段。

检测一种试验样品中的由HBV基因组的Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码的各种抗原所用的一种诊断药盒中含有以下各项：

1.一种用对于具有与本发明的HBV表面抗原颗粒的Pre S₁- Pre S₂-S区相对应的氨基酸序列的颗粒包被的固体底物;

2.一种使该固体底物上的蛋白结合位点饱和的含蛋白质溶液;和

3.给定量的用放射性元素标记的抗体，如对于HBV表面抗原多肽的抗体。

另一种检测试验样品中由HBV基因组的Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区编码蛋白的抗体用的诊断药盒中含有下列各项：

1.一种固体底物，其上吸附有颗粒，这些颗粒中含有与本发明的HBV表面抗原蛋白的各Pre S₁- Pre S₂-S编码区相对应的氨基酸序列，该底物被暴露于一种含蛋白溶液中，以使固体底物上的非特异性蛋白结合位点饱和;和

2.给定量的人类的Ig G或Ig M的用放射性元素标记的各种抗体。

用在上述各试验药盒中的用放射性元素标记的各种抗体可以以溶液的形式或以适宜于重建的冷冻干燥的形式包装。此外，上述的用放射性元素标记的各种抗体也可以用酶联的或荧光标记的各种抗体代替。

可以将上述试验药盒和检测对于乙型肝炎病毒的各种Pre S₁- Pre S₂-S编码区多肽的抗体的方法用于下述一些用途：如通过从患者身上提取血清并应用上述试验或使用上述试验来检查该患者的HBV感染;以及通过从感染患者身上提取血清并应用上述抗体检测方法来预期HBV感染的复原。

用于抗体检测的上述试验方法和试验药盒可用来进行不同HBV疫苗之间的品质比较，方法是，提取注射过疫苗的患者的血清，然后利用上述试验方法或药盒进行抗体检测。一般来说，所有采用这种抗原作为试剂的已知免疫检定方法都可以采用本发明的含有Pre S₁、Pre S₂或S的颗粒来完成。所有采用含抗体的血清或试剂的已知免疫检定法一般都可以采用通过使用由本发明的重组DNA方法制得的一种多肽而制成的抗体血清来完成。这些免疫检定法包括Langone和Van Vunakis在“Methods of Enzymology，Academic Press，Vols.70，73 and 74”中介绍的所有免疫检定法。这些检定法已在下述申请号的一些美国专利公开文件中公开了：4，459，359、4，343，896、4，331，761、4，292，403、4，228，240、4，157，280、4，152，411、4，169，012、4，016，043、3，839，153、3，654，090和Re.31，006，这里通过引用而将“Methods of Enzymology”第70、73和74卷的内容合并于此。

本发明还涉及一种联合转染真核细胞，它是用本发明的重组载体和一种含有Pre S₂-S蛋白编码区-或只含S编码区-以及一种MMT启动子的第二重组DNA载体联合转染的。第二重组DNA载体最好还含有一种转录终止位点，并有选择地含有一种选择识别物。上述联合转染宿主可以有选择地用本发明的重组DNA载体、第二重组DNA载体以及一种含有MMT启动子和选择识别物的第三重组DNA载体进行联合转染。第三重组载体中最好还含有一种转录终止位点。当一种原核细胞宿主细胞，如一种细菌细胞是由第二重组DNA载体或可有选择地使用的第三重组DNA载体所转化时，所说的第二重组DNA载体和可有选择地使用的第三重组DNA载体中最好还含有一种负责在这种宿主中的生长和扩大的复制子。

另外，本发明涉及一种制备这种联合转染宿主细胞的方法，该方法包括用本发明的重组DNA载体、上述的第二重组DNA载体以及上述的可以有选择地使用的第三重组DNA载体联合转染一种真核细胞。上述的第二重组DNA载体及可以有选择地使用的第三重组DNA载体可通过普通的方法构建。如不使用可选用的第三载体，则第二重组DNA载体最好还含有一种选择识别物，例如一种抗药识别物。如果第二和（或）可选用的第三重组DNA载体中含有一种转录终止位点，则该位点最好是mg-PAS-t终止位点。在上述的第二重组DNA载体中，MMT启动子最好刚巧位于这种载体中Pre S₂-S蛋白编码区的上游。在上述的可选用的第三重组DNA载体中，MMT启动子最好刚刚位于此载体中选择识别物的上游。上述的第二重组DNA载体和可选用的第三重组DNA载体最好都不含有任何非HBV病毒DNA链且无致癌性。这样，转染进入一宿主后，这些较好的载体就整合到宿主染色体中并与宿主基因组一起被动复制。

使用普通方法，可将本发明的载体、上述的第二重组组DNA载体以及可选用的上述的第三重组DNA载体以两两配对的方式，或以三种载体一起用的方式联合转染到一种真核细胞宿主中。另一种方法是，在一连串的步骤中把本发明的载体、第二重组DNA载体以及可选用的第三重组DNA载体转染到一种真核细胞宿主中。开始时，是按照本发明的方法将本发明的载体转染到一种真核细胞宿主中而制得本发明的转染宿主。

然后，这样的被转染过的宿主再用上述第二种重组DNA载体转染，进一步地用或不用上述第三种重组DNA载体以常规方法转染，以产生本发明的联合转染宿主。

优选的是，本发明的载体，第二种重组DNA载体及选用或不选用的第三种重组DNA载体含有相互之间不同的选择标记，以便在直至最后转染宿主的各转染步骤中，均能鉴定出新转染的宿主。进行这种次级性转染是为了增加多重转染宿主细胞所含有的Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的基因拷贝数目。最好是第二种重组载体及选用的第三种载体均不含有能在真核细胞中起作用的复制子。

本发明还涉及本发明的联合转染宿主产生的颗粒的制备方法，该粒子至少含有一种由整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码的蛋白质，该方法包括：1）在使本发明的联合转染宿主细胞能表达这种蛋白质的培养基条件下培养这种宿主;2）分离出这种颗粒。优选的是能够将这种蛋白质集中于这种颗粒之中并分泌到培养基中。最好是，这种方法还另外包括将重金属离子或类固醇激素加入到这种培养基中的步骤，以增加联合转染载体所含的Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的表达量。最为优选的重金属离子是锌和镉。培养基中所含重金属离子或类固醇激素的最适浓度可按常规技术确定。本发明还涉及由这种方法制备的颗粒。如果本发明的联合转染宿主将这种颗粒直接分泌到培养基中，那么这种颗粒就可用常规的蛋白质分离技术将其从本发明联合转染宿主的培养基中分离出来。如果联合转染宿主不是将这种颗粒直接分泌到培养基中，那么，可用常规的培养物溶胞技术从这种联合转染宿主的培养物溶胞物中得到它们。这种颗粒以糖基化形式被分离出来，并且含有由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区，Pre S₂-S蛋白质编码区和S蛋白质编码区所编码的蛋白质。

本发明还涉及一种疫苗，它含有免疫防护量（优选1-20微克）的由本发明联合转染宿主所产生的颗粒。

由本发明联合转染宿主所产生的颗粒不含有病毒DNA成份，并且因此没有天然衍生疫苗所常见的副作用，例如意外的病毒感染，变态反应，发烧等等。本发明的疫苗含有免疫防护量的由本发明联合转染宿主所产生的颗粒，可用来改善HBV免疫反应，以及用来克服不含有任何一种整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码序列所编的蛋白质的疫苗所产生的对乙型肝炎病毒的无应答性。

本发明的疫苗，可将免疫防护量的由本发明联合转染宿主所产生的颗粒与适宜的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲生理盐水相结合而制备。此外，疫苗可以含有佐剂，例如氢氧化铝等。

另外，由本发明联合转染宿主所产生的颗粒内含有的多肽，可以从所述的颗粒上离解下来并再结合到脂泡上。乙型干炎疫苗可以用含有本发明所述颗粒之多肽的脂泡来制备。含有脂泡的疫苗还可以含有佐剂，例如氢氧化铝等。

由本发明联合转染宿主所产生的颗粒包括本发明的疫苗，可以与生理上相容的稀释剂（介质）一起使用，例如磷酸盐缓冲盐水。

含有免疫防护量的本发明之颗粒的疫苗，可以按美国专利4118479号所揭示的一般方法一样地制备和使用。

疫苗可以皮下注射，皮内注射或肌肉注射。虽然最佳途径取决于具体的疫苗，但一般均认为肌肉注射更为适宜。施用的频次根据疫苗而定。

本发明还涉及测定哺乳动物血清样品中是否存在着由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码蛋白质之抗体的方法，该方法包括：

（a）将样品与用本发明之联合转染宿主产生的尚未标记的颗粒所涂敷的固相底物相接触;

（b）对接触过的样品进行培养并冲洗;

（c）将已接触过的样品与标记过的本发明之颗粒相接触以产生标记接触样品;

（d）培养标记接触样品并冲洗之;

（e）测定标记接触样品中标记颗粒的含量。

本发明还涉及测定哺乳动物血清样品中存在的由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码之蛋白质的方法，该方法包括：

（a）产生一种组合物，其中含有本发明之颗粒所含的免疫原所产生的抗体;

（b）将样品与第一部分组合物及标记过的免疫原相接触，培养并冲洗此第一部分;

（c）将无抗原对照与第二部分组合物及标记过的免疫原相接触，培养并冲洗第二部分;

（d）对上述步骤b）和c）的组合物加入等量的葡萄球菌所携之蛋白质A，对两种组合物均进行培养并将液体与固体分开;

（e）对由上述步骤d）所获得各组合物均测定基标记免疫原的含量。

本发明还涉及测定哺乳动物血清样品中存在的由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码之蛋白质之抗体的鉴别药盒，其中包括：

（a）附着在固相载体上的含有本发明之颗粒的未标记蛋白质;

（b）用诸如人Ig G或Ig M标记的抗体。

本发明还涉及测定哺乳动物血清样品中存在的由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码之蛋白质的鉴别药盒，其中包括：

（a）附着于固相载体上的本发明之颗粒产生的抗体;

（b）标记过的本发明之颗粒产生的抗体。

本发明涉及一种重组DNA多联体，其中包括1）一种质粒载体，其带有Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区以及至少另外一种质粒载体，该质粒载体含有Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区，Pre S₂-S蛋白质编码区或S蛋白质编码区中之一种;以及2）MMT启动子。这种多联体最好另外还含有选择识别物及转录终止位点。

本发明还涉及用本发明之多联体转染的真核宿主细胞。这种宿主优选哺乳类细胞。此外，本发明还涉及用本发明之多联体制备这种转染宿主细胞的方法，其中包括用本发明之多联体转染真核细胞。

本发明还涉及制备颗粒的方法，该颗粒由本发明的转染宿主细胞产生并含有至少一种由整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码的蛋白质，该方法包括：1）在能使这种宿主表达这种蛋白质的培养基条件下，对含有本发明之多联体的本发明之转染的真核宿主细胞进行培养;2）分离出这种颗粒。优选的是，这种联合转染宿主能将这种蛋白质集中于这种颗粒之中并分泌到培养基中。这种优选方法还另外包括向这种培养基中加入重金属离子或类固醇激素的步骤，以增加转染载体所含之Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的表达。最为优选的重金属离子是锌或镉。培养基中所含重金属或类固醇激素的最佳浓度可用常规技术确定。本发明还涉及由这种方法制备的颗粒。如果用本发明之多联体转染的宿主将这种颗粒直接分泌到培养基中，则用常规的蛋白质分离技术就能将这种颗粒从本发明之转染宿主的培养物溶胞物中获得之。这种颗粒是以糖基化的形式被分离出来，并且含有由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区，Pre S₂-S蛋白质编码区，S蛋白质编码区所编码的蛋白质。

本发明还涉及一种疫苗，其含有免疫防护量（优选1-20微克）的由用本发明之多联体转染的宿主所产生的颗粒。

用本发明之多联体转染的宿主所产生的颗粒不含有病毒DNA组分，并且因此没有天然衍生疫苗所常见的有害副作用，如意外的病毒感染，变态反应，发烧等等。本发明的疫苗含有免疫防护量的由用本发明之多联体转染的宿主所产生的颗粒，可用来改善HVB免疫反应及克服不含任何一种由整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码之蛋白质的疫苗所产生的对乙型肝炎病毒的无应答性。

本发明的疫苗，可将免疫防护量的由本发明多联体转染宿主所产生的颗粒与适宜的缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水相结合而制备。此外，疫苗还可含有佐剂，例如氢氧化铝等。

另外，用本发明之多联体转染的宿主所产生之颗粒内含有的多肽，可以从所述的颗粒上解离下来并重新结合到脂泡中。用含有本发明之所述颗粒之多肽的脂泡可以制备乙型肝炎疫苗。含有脂泡的疫苗还可另外含有佐剂，例如氢氧化铝。

用本发明之多联体转染的宿主所产生的颗粒包括本发明的疫苗，可与生理上相容的稀释剂（介质）一起使用，例如磷酸盐缓冲生理盐水。

含有免疫防护量的本发明颗粒的疫苗，可按美国专利4118479号所揭示的一般方法制备使用。

疫苗可以皮下注射，皮内注射或肌肉注射。虽然最佳途径要根据具体的疫苗而定，但一般认为肌肉注射更为适宜。施用的频次根据疫苗而定。

本发明还涉及测定哺乳动物血清样品中存的由Pre S-Pre S-S蛋白质编码区所编码的蛋白质之抗体的方法，该方法包括：

（a）将样品与用由本发明多联体转染的宿主所产生之非标记颗粒所涂敷的固相底物相接触;

（b）培养并冲洗所述的接触样品;

（c）将接触过的样品与标记的本发明之颗粒相接触，从而产生标记接触样品;

（d）培养并冲洗所述标记接触样品;

（e）测定标记接触样品中标记颗粒的含量。

本发明还涉及测定哺乳动物血清样品中存在的由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区所编码之蛋白质的方法，其方法包括：

（a）制备一种含有本发明之颗粒所含免疫原产生的抗体的组合物;

（b）将样品与第一部分组合物及已标记过的免疫原相接触，培养并冲洗该第一部分;

（c）将不含抗原对照样品与第二部分组合物及标记过的免疫原相接触，培养并冲洗第二部分;

（d）对上述步骤b）和c）的组合物加入等量的葡萄球菌所携之蛋白质A，培养这两种组合物并将液体与固体分离;

（e）对上述步骤d）所获各组合物均测定其标记免疫原的含量。

（a）附着于固相底物的含本发明之颗粒的未标记蛋白;

（b）用如人Ig G或Ig M标记的抗体。

（a）附着于固相载体上的由本发明之颗粒诱导的抗体;

（b）由本发明之颗粒产生的已标记的抗体。

第一个优选实施方案

在第一个优选实施方案中，本发明的一个载体包括掺入来自重组质粒pBPV342-12（Law et al，Molecular and Cellular Biol，Vol3，p.2110，1983）和pAOI（Cummings，I.W.et al，Proc.Natl.Aca.Sci.，U.S.A.，Vol.77，p1842，1980）的基团序列的载体构造。将这些质粒的某些遗传组份结合起来以创造出本发明的载体，定名为pDM1（见图3）。质粒pDM1含有携带Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的基因碎片，条件为在所述蛋白质编码区的天然启动子系统的控制下，还含有抗新霉素基因，MMT启动子和SV40 PAS-t功能段，然后将该质粒通过转染引入到任何一种真核细胞，如哺乳动物细胞中，以产生高水平的表达并且最好分泌出本发明的颗粒。

质粒pBPV342-12（见图1）含有的基因序列包括MMT-启动子，抗新霉素基因，SV40 PAS-t功能段，以及牛乳头状瘤病毒（BPV）基因组。在建造质粒pDM1的过程中，质粒pBPV342-12被BamHⅠ酶解，其结果是该质粒被分割为两个DNA片段。将片段分离出后，弃出7.95千碱基的片段，该片段含有整个BPV基因组。除去BPV.DNA有很大的优越性，因为这样做就排除了用于疫苗配方的本发明之颗粒含有任何BPV DNA或蛋白质的可能性。剩下的来自p BPV342-12的BamHⅠ片段（6.65千碱基）含有MMT-启动子的基因序列，抗新霉素基因和SV40 PAS-t区，随之将该片段与衍生自质粒pAOⅠ的DNA序列用常规技术连接起来，但不与含有整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的片段相连（在以下讨论;同时参见图2）。

含有全部乙型肝炎病毒基因组的质粒pAOⅠ（见图2）用EcoRⅠ酶解产生3.2千碱基的片段。将3.2千碱基的片段相互连接产生含有长多联体DNA结构的衔接重复，该结构含有编码乙型肝炎核心抗原和表面抗原的基因序列。这种处理乙型肝炎病毒基因序列的方法是Cummings等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.1842，1980年中揭示的方法，其对于在质粒pAOⅠ中分子克隆化所造成的置换以及恢复关于Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的功能性结构都是必要的。通过随后的BglⅡ酶解，HBV核心抗原基因碎片被除去，留下了（2.78千碱基）DNA片段，其含有乙型肝炎病毒基因组的Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区以及该区的天然启动子系统（P_HB）。

然后将线性p BPV342-12 BamHⅠ片段（见图1）和p AOⅠ衍生的BglⅡ片段（见图2）连接起来，产生保留有Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区之天然启动子（P_HB）的重组质粒p DM1（见图3）。

在本发明的第二个优选实施方案中，pDM1中的天然启动子被BglⅡ和BamHⅠ酶解切下来，从而使MMT启动子直接位于Pre S₂-S蛋白质编码区之前，以便由MMT启动子控制所述编码区的转录。在BamHⅠ+BglⅡ酶解之后，得到三种分离的DNA片段（见图4A和4B）：

1）含有多腺苷化位点和MMT启动子的5.1千碱基片段;

2）含有抗新霉素基因和天然启动子的3.0千碱基片段;

3）含有Pre S₂-S蛋白质编码区的1.4千碱基片段。

提纯之后，5.1和4.1千碱基片段用常规技术连接起来，产生含有Pre S₂-S蛋白质编码区的重组质粒（6.46千碱基），此时受MMT启动子的控制。因为这两个连接片段的相关定向是随机的并且产生了两种不同类型的质粒，但是其中只有一种表现出从MMT启动子到表面抗原基因序列的正确转录解读方向，正确的功能性质粒p DM2用EcoRⅠ+XbaⅠ酶解纯化的侯补质粒而确定。在这一酶解之后，带有正确方向的质粒产出2.1和4.4千碱基的片段。

含有p DM2的细菌系HB101储存于德意志微生物收集中心（DSM），储存日为1985年4月4日，储存号为DSM3285。含有p DM1的细菌系HB101储存在美国样板培养物收集中心，储存号为储存日为。

第三个优选实施方案

在第三个优选实施方案中，MMT启动子被拼接到含有Pre S₁-Pre S₂-S蛋白质编码区的HBV基因碎片上，其方式为去除天然启动子系统并在MMT启动子的直接控制下将所述的编码序列定位（见图9）。

第四个优选实施方案

在第四个优选实施方案中，从质粒p BR322.G2回收到的鼠珠蛋白基因mg-PAS-t碎片用作对SV40PAS-t区段的多腺苷化终止（PAS-t）信号的取代物。mg-PAS-t的取代使DNA转运载体没有任何非HPV病毒基因组成成分（见图9，10和11）。

第五个优选实施方案

第五个优选实施方案是制备质粒DNA混合多联体的方法，通过将含有编码Pre S₁-Pre S₂-S，Pre S₂-S蛋白质编码区的基因结构之质粒与含有抗药物识别物的质粒以高比率连接而增大基因拷贝数目，用于以后转染到细胞株中。

质粒p BR322.G2，POL INK23456，和p Blg12.8均储存于美国样板培养物收集中心，储存日分别为

储存号为

在以下的实施例中，更详细地描述了本发明之重组DNA载体，宿主及颗粒的制备，以及对哺乳动物细胞系的掺入。下述各实施例的目的仅在于对本发明进行说明，并且根本不打算限制本发明。

材料及方法

A.哺乳动物细胞系的来源及其描述

1.L-细胞

NCTC无性系929，是由K.K.Sanford，W.R.Earle和G.D.Likely（J.Nat.Cancer Inst.，Vol.9，pp.229，1948）于1948年三月从W.R.Earle（J.Nat.Cancer Inst.，Vol.4pp.165，1943）在1940年所建立的亲代L品系中衍生出来的。亲代L品系是从100日龄的C3H/An雄鼠的正常皮下网状和脂肪组织中衍生出来的，无性系929是（用分离单个细胞的毛细技术）从亲本品系的第95代传代培养物中建立起来的。

鼠L细胞的一个亚系LM（TK-）是由D.R.Dubbs和S.Kit（S.Kit et al，Exp.Cell Res.，Vol.31，pp297-312，1963;和D.R.Dubbs & S.Kit，Exp.Cell Res.，Vol.33，pp19，1964）分离出的，并且是胸苷激酶缺乏型。它在含HAT的培养基中不能生长。在此细胞系中没有观察到HAT抗性的自然回复，并且看来很象是发生了这一基因的缺失。

起源组织的连续传代培养号：

648;克隆553。

冰冻培养基：培养基90%;DMSO10%;不含抗生素。

生活能力：81-96%（染料排斥）。

培养基：DMEM+10%FBS（Dulbecco′s和Vogt′s改进的Eagle′s培养基+10%FBS）。

融冻细胞的生长特征：在每个T-25烧瓶中对5毫升上述培养基接种6-8×10⁵个细胞，在37℃7天内增加50倍，条件是每周换两次培养基，并用含5%或10%的增湿二氧化碳混合气调pH至7.3。传代培养物由刮削或摇震制备。细胞在其他补充以10%-30%马血清的培养基（Waymouth′s，Eagle′s，NCTC135等等）中也能良好生长。

覆板效率：70%。

形态：类似成纤维细胞。

胞核：100个细胞的染色体分布频率：2n＝40。

细胞：2 2 1 4 2 9 4 12 16 17 4 13 2 2 2 1 6

染色体 56-58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71-76-82-125-241

在77/100个细胞中发现具有次级缢痕的长中间着丝粒的染色体。

无菌性：对支原体，细菌和真菌的试验为阴性。

种类：用混合凝集和血凝试验鉴定为鼠种。

病毒感受性：易于感受假狂犬病病毒和泡状口炎病毒（印度系）。当细胞在上述培养基中培养时，疱疹单式B病毒，牛痘仅在第一代产生细胞致死作用。对某些病毒的感受性依所用的培养基而不同。不感受1型脊髓灰质炎病毒，B-5型柯萨其病毒和多形瘤病毒。

致肿瘤性：对每只裸鼠皮下注射接种1×10⁶个细胞。在非辐射鼠中，肿瘤的产生为0/25。在X光辐射的鼠中（425r，全体），于注射位置产生的肿瘤（肉瘤）为11/18。

逆转录酶：阳性

其制备成的特征以提交在美国样板培养物收集中心的为准。

2.Vero细胞

Vero细胞株是由Y.Yasumuar和Y.Kawakita于1962年3月27日在日本千叶大学从非洲绿猴正常成年猴的肾中获得的（Nippon Rinsho，Vol.21，p1209，1963）。

起源组织的传代培养序数：121。

冰冻培养基：基本培养基（Eagle），有非必须氨基酸和Earle′s BSS，85%;小牛血清5%;二甲亚砜（DMSO）10%;不含抗生素。

存活性：约97%（排除染料）

培养基：DMEM，5%FBS。

融冻细胞的生长特征：在每个T-25烧瓶中，对3毫升上述培养基接种3×10⁵个存活细胞，在37℃7天内增殖50倍，条件为每周新三次培养基，并用5%或10%的增湿二氧化碳混合空气调pH至7.4。用胰酶消化法制备传代培养。

覆板效率：在上述培养基中约为24%。

形态：类似上皮成纤维细胞。

胞核：50个细胞中染色体分布频率：2n＝60。

细胞：2 1 2 2 3 4 5 7 2 1 17 2 2

染色体：47-49 59 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

无菌性：对支原体，细菌和真菌的试验为阴性。

种类：用免疫荧光试验测定为猴种。

病毒感受性：易于感受3型脊髓灰质炎病毒，Getah，NNdumu，Pixuna，Ross River，Semliki，Paramaribo，Kokobera，Modoc，Murutucu，Guaroa，Pongola和Tacaribe虫媒病毒。不感受Stratford，Apeu，Caraparu，Madrid，Nepuyo和Ossa虫媒病毒。

没有发现含逆转录酶。

其制备成的特征以提交在美国样板培养物收集中心的为准。

3.CHO-KI细胞

CHO-KI细胞是由T.T.Puck于1957年（J.Exp.Med.，Vol.108，p.945，1958）从其来源于中华仓鼠成鼠的活体解剖卵巢的亲代CHO细胞株中作为亚克隆衍生出的。CHO-KI细胞要求有脯氨酸和数目为20的染色体模数（Proc.Nat.Acad.Sci.，Vol.60，p.1275，1968）。该细胞明显缺乏脯氨酸合成所需的活性基因形式以及在将谷氨酸转换为谷氨酸-r半缩醛步骤中存在的生物合成链中的封阻。独立脯氨酸的回复频率为10（Genetics，Vol.55，p.513，1967）。

起源组织的传代培养序数：约为400;7代在ATCC。

冰冻培养基：92%培养基;8%甘油;不含抗生素。

存活性能力：约90%（排除染料）

培养基：90%F-12培养基（Ham）;10%小牛血清;不含抗生素。

融冻细胞的生长特征：在上述培养基中按每毫升10⁵个活的细胞接种，在37℃7天之内增殖15-20倍。

覆板效率：在上述培养基中约为90%。

形态：类似上皮细胞。

胞核：50个细胞中染色体分布频率：2n＝22。

细胞：2 2 35 3 4 1 1 1 1

染色体：18 19 20 21 22-24-32-39-42

无菌性：对支原体，细菌和真菌的试验为阴性。

种类：用细胞毒素抗体排斥染料试验及同功酶分析鉴定为中华仓鼠种。

病毒感受性：易于感受泡状口炎病毒（印度系）和Getah虫媒病毒。不感受2型脊髓灰质炎病毒，Modoc和Butten William虫媒病毒。

逆转录酶：未检测到。

特性：该细胞需要脯氨酸酸才能生长。

由T.T.Puck（Eleanor Roosevelt Insitute for Cancer Research，University of Colorado Medical Center，Denvor，Colorado）提供。

4.NIH/3T3细胞

NIH/3T3细胞是高度接触抑制细胞的连续细胞株，是从按最初随机繁殖3T3（ATCC CCL92）和其近亲BALB/c3 T3（ATCC CCL163）相同的方式培养的瑞士小鼠胚胎培养中建立的。建立的NIH/3T3经过多于5次的亚克隆连续循环，以发展出具有对转化检测为最适形态特征的亚克隆。最早可用的该亚克隆的传代比初级胚胎培养物多120。NIH/3T3对肉瘤病毒焦点群系和白血病病毒繁殖高度敏感，并且被证实为在DNA转染研究中是非常有用的（J.Virol.，Vol.4，pp.549-553，1969;Cell，Vol.16，pp63-75 and 347-356，1979）。

B.培养基，缓冲液及溶液。

1.对哺乳动物细胞的培养

a.Dulbecco′s改良Eagle培养基，高葡萄糖（DMEM）。

制备GIBCO培养基干粉并补充以：

26mM NaHCO₃（Gibco）

2mM L-谷氨酰胺（Gibco）

1mM 丙酮酸钠

60μg/ml庆大霉素或100单位/毫升青霉素+100μg/ml链霉素1

b.Ham′s F12

制备GIBCO干粉培养基并补充以：

14mM NaHCO₃

60μg/ml庆大霉素

c.细胞冷冻培养基

90%（v/v）FBS-DMEM

10%（v/v）二甲亚砜

冷冻培养基在使用前制备。所有的培养均用0.45和0.2微米的过滤剂（Gilman）无菌过滤。培养基的消毒效果用不含抗生素的培养基等分试样37℃培养1星期来评价。静态培养所用的培养基补充以10%FBS。对小牛血清以56℃30分钟热灭活。无菌培养基在使用前储藏于40℃。

d.胰蛋白酶溶液

0.5g/l胰蛋白酶

0.2g/l存在于Hank′s平衡盐溶液中的EDTA（四钠）

因为发现EDTA对Vero细胞有毒性，所以对这些细胞使用不含EDTA的胰蛋白酶溶液。

e.PBS（磷酸盐缓冲盐水，GIBCO）

1.83mM NaCl

8.6mM NaHPO₄

2.2mM KHPO₄

f.TNE 160mM NaCl

10mM Tris，pH7.5

1mM EDTA

2.分子生物学

a.用于SDS-PAGE过程的溶液丙烯酰胺（浓液）

30%（v/v）丙烯酰胺（Bio Rad）

0.8%（v/v）N′N-亚甲基-双丙烯酰胺（Bio Rad）

4×用于分离凝胶的缓冲液

1.5M Tris-Cl，pH8.8

0.4%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）（Serva）

4×用于层胶的缓冲液

0.5M Tris-Cl，pH6.8

0.4%（w/v）SDS

3×样品缓冲液

22.3%（v/v）甘油

0.03%（w/v）溴酚兰

6.7%（w/v）SDS

10×电极缓冲液

0.25%M Tris，pH8.2

1.90M甘氨酸

1%（w/v）SDS

b.银染色程序的溶液

溶液Ⅰ 50%（v/v）甲醇

10%（v/v）乙酸

溶液Ⅱ 10%（v/v）甲醇

5%（v/v）乙酸

溶液Ⅲ 10%戊二醛

溶液Ⅳ 20%Ag NO₃于H₂O中（Stick）

溶液Ⅴ 3%（w/v）Na₂CO₃

0.1%（v/v）甲醛

c.切口转译的溶液

10×反应缓冲液 500mM Tris-Cl，pH7.2

100mM Mg SO₄

1mM DTT

核苷酸混合物 100mM dGTP

100mM dATP

100mM dTTP

于10mM Tris中，pH7.5

d.用于杂交的溶液

20-×SSC 3M NaCl

0.3M柠檬酸钠（Na₃-Citrate）

50×Denhardt′s溶液

1%（w/w）Ficoll400（PL-Pharmacia）

1%（w/w）聚乙烯吡咯烷酮（б）

1%（w/w）BSA

消毒过滤，并在-20℃储藏

预杂交混合液

50%（v/v）甲酰胺

5×Denhardt′s溶液

5×SSC

50mM磷酸钠（Na-Phosphate）

pH7.0

250μg/ml变性鲑鱼精子DNA

预杂交混合液

50%甲酰胺

5×SSC

20mM磷酸钠（Na-Phosphate）

pH7.0

1×Denhardt′s溶液

100μg/ml变性鲑鱼精子DNA

e.用于限制性内切酶的缓冲液

根据制造商的说明书或者：

低盐缓冲液中盐缓冲液高盐缓冲液

SmaⅠ BglⅡ BamHⅠ

HpaⅠ PstⅠ PvuⅠ

XbaⅠ EcoRⅠ SalⅠ

SpeⅠ BstEⅡ（60℃）

限制酶用缓冲液：

低盐中盐高盐

Tris，pH7.4 10mM 6.6mM 6.6mM

MgCl 10 6.6 6.6

盐 20（KCl） 60（NaCl） 150（NaCl）

巯基乙醇 10 6.6 6.6

5.培养基

1）L-肉汤：10g 细菌用胰化胨

5g 酵母膏

10g NaCl

11 H₂O

2）L-肉汤琼脂板：

每升含15g Difo琼脂的L-肉汤。

3）L-肉汤-amp琼脂板：

含20-50μg/ml氨苄青霉素的-L-肉汤

C.酶类

使用的酶如下：

1.脱氧核糖核酸酶Ⅰ（Worthington）

2.DNA聚合酶Ⅰ（“Klenow-Fragment”）（Boehringer Mannheim）

3.T₄-DNA连接酶Ⅰ（Boehringer Mannheim）

4.限制性内切酶：

EcoRⅠ，XbaⅠ，BamHⅠ，BglⅡ，BstEⅡ，SpeⅠ，SalⅠ，HpaⅠ，SmaⅠ，PvuⅠ，PstⅠ（Boehringer Mannfeim，BRL，New England Biolabs）

5.溶菌酶（δ）

6.链霉蛋白酶

D.分析定量过程

1.染料结合测定

本发明纯化颗粒制剂中总蛋浓度用Bio-Rad蛋白测定药盒（proteinassay kit）确定。该方法中使用了Bradford测定，也就是用分光光度方法测定考马斯兰与蛋白质的结合。用卵清蛋白作为对照。

2.放射免疫测定法（RIA）

在NML RIA¹²⁵I“夹心”放释免疫测定中，包被有鼠抗乙型肝炎表面抗原抗体（anti-HBs）的珠粒，在适宜的控制下用血清或血浆温育。含有由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白质编码区所编码之多肽的颗粒与固相抗体相结合。当抽去未结合的材料并冲洗珠粒之后，用人¹²⁵I-Anti-HBs与珠粒上的抗体-抗原复合物相反应。然后冲洗珠粒去除未结合的¹²⁵I-Anti-HBs。

保留在珠粒上的放射活性用γ闪烁计数器测定样品每分钟计数（cpm）大于或等于由负对照平均计数率（NCx）乘以一个参数而确定的死亡值时，被认为是有反应样品。

3.免疫沉淀

在T75烧瓶中细胞生长至100%融合。然后，培养基用5毫升含400μCi的L-[³⁵S]甲硫氨酸和400μCi的L-[³⁵S]半胱氨酸但不含甲硫氨酸的培养基替换，过夜温育。用聚乙二醇分步沉淀样品浓缩10倍。浓缩的蛋白质（约10cpm）用10μl预免疫豚鼠血清或1和10μl存在于50μl TEN（10mMTris，pH7.4，1mM EDTA，130mM NaCl）中的抗HBs Ag豚鼠血清，以及0.5%Tween20于37℃温育1小时。免疫球蛋白与20μl蛋白质A-琼脂糖Cl-4B（Pharmacia）于37℃连接1小时，用TEN-Tween20和500mM Li Cl洗一次，然后再用TEN-Tween20洗一次。样品在下述的SDS-PAGE系统中电泳。在10%三氯乙酸，10%冰醋酸和30%甲醇的溶液中将凝胶固定60分钟，并且在Enlighning（NEN）中温育30分钟。将凝胶干燥并以KODAKXAR-5胶片放射自显影。

4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）样品及凝胶的制备。

为用于PAGE分析，将本发明之纯化颗粒的等分试样调至10μg/ml。从每种样品中取出10μl，并与存在于10%SDS中的10μl1MDTT和10μl样品缓冲液混合。在装载之前将样品加热5，10或15分钟以破碎20nm颗粒并产生单体分子。在加入10μl负载缓冲液之后，在具有12.5%聚丙烯酰胺-0.4%双丙烯酰胺的0.75mm厚凝胶板（12×18×0.1cm）上，用Laemmli（1970）缓冲系统电泳6小时，电流为15mA，电压为100V。蛋白质泳道用银染色可见（见下述银染色一节）。

5.银染色

根据Merril等人（1981）对PAGE凝胶进行银染色。用50%甲醇和10%乙酸的溶液将蛋白质在凝胶中固定30分钟。用10%甲醇和5%乙酸的溶液冲洗凝胶30分钟。在10%戊二醛中温育30分钟之后，对凝胶用去离子水过夜冲洗。在0.1%Ag NO₃中温育30分钟后，对凝胶用水短短洗一下。染色的凝胶在100ml3%Na₂CO₃和30μl甲醛的溶液中展色，并在1%乙酸中固定。将凝胶封在塑料袋中并照相。

E.遗传工程过程

1.重组DNA过程

a.纯化DNA的限制性内切酶酶解

对具体的内切酶要依据制造商的说明书。

b.质粒DNA的分离

大规模Cs Cl质粒的制备：

（1）在L-肉汤中将1升带有质粒的细胞培养至0.5OD₆₀₀，用200μg/ml氯霉素扩增12-20小时。

（2）在Sorval RC5b中以8000rpm离心20分钟。

（3）重新悬浮于18ml的25%蔗糖，50m M Tris，pH8.0的冷液中。

（4）转移到250ml锥形烧瓶中。保持在冰上。

（5）加入存在于250mM Tris中的6毫升5mg/ml溶菌酶，pH8.0，放置10-15分钟。

（6）加入6ml250m MEDTA，pH8.0，并缓缓搅拌;在冰上保温育15分钟。

（7））加入30ml混合清洁剂：

0.01% Triton X-100

60mM EDTA，pH8.0

50mM Tris，pH8.0

（8）在冰上保温育30分钟。

（9）在4℃，用SW28旋转离心机以每分钟25000转离心90分钟。

（10）对上清液，按250μg/ml加入链霉蛋白酶，在37℃温育30分钟。

（11）苯酚萃取一次，苯酚用1/2体积的TE（10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA）平衡。

（12）弃去液相;加乙酸钠至300mM;加入2体积的100%乙醇;彻底混匀。在-20℃放置过夜。

（13）离心;再悬浮于6ml TE-10（10mM Tris，10mM EDTA，pH8.0）中。

（14）加入9.4g Cs Cl，0.65ml的6mg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓;用无菌重蒸水配至体积为10ml。

（15）装满Beckman可热封的梯度管内;在Ti70.1 Beckman旋转离心机上以每分钟48000转离心40小时。

（16）紫外光照射可见质粒带，用注射器和18号针刺穿管壁移出质粒DNA。

（17）用等体积异丁醇连续萃取3次去除质粒部分的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。

（18）对2升1份的10m MTris，pH7.4，1mM EDTA，pH7.5，5mM NaCl溶液在4℃透析2小时或更长时间。

（19）用上述TE以1/3体积平衡的苯酚萃取一次。

（20）加Na Ac至300mM，加2体积100%乙醇;在-20℃过夜沉淀，或在-70℃沉淀30分钟。

c.切口转译

切口转译按Rigby等人（J.Mol.Biol.，Vol.113，pp.237-251，1977）所述进行。用于进行DNA的32磷标记的反应混合物通常含有pDM2的EcoRⅠ-XbaⅠ片段0.5μg，总体积为30μl，含有50mMTris，pH7.8，5mMMg Cl₂，10mM巯基乙醇，0.1mM，dATP，0.1mMd GTP，0.1mMd TTP，50μCi P-dCTP，10单位聚合酶Ⅰ，3μl按2×10^-5倍稀释的1mg/mlDN酶Ⅰ，在15℃温育90分钟，产出的总cpm为3×10⁶至12×10⁶，也就是1×10⁷至5×10⁷cpm/μg DNA

d.感受态细菌细胞的转化

从致密的过夜培养物中，取出1ml细菌悬浮液用于接种100ml生长培养基（L-肉汤）。细胞在37℃生长到密度为OD₅₅₀＝0.7，这是在500ml锥形烧瓶中剧烈摇震2小时之内达到的。将培养物在冰上冷却10分钟终止生长。自该培养物中取出3ml，以每分钟3000转离心5分钟收获指数曲线生长期的细菌细胞。细胞重新悬浮于1.5ml 50mM CaCl₂存在于10mM Tris中的液体中，pH8.0，并在冰上再保育15分钟。以每分钟3000转离心5分钟再次收获细胞，并重新悬浮于200μl 50mM CaCl₂存在于10mM Tris中的液体中，pH8.0，在4℃保持过夜。

此后，连接的混合物用10mM Tris，pH7.5，和1mM EDTA配成总体积为70μl，并加到200μl细菌细胞悬浮液中进行DNA摄取。

混合物在冰上保温育30分钟，然后加入1ml L-肉汤，混合物在42℃温育2分钟并在37℃温育40分钟。温育之后，细胞展开在琼脂板上，每块板对体积为50μl至300μl的细胞悬浮液含有50μg氨苄青霉素/毫升琼脂琼脂板在37℃温育过夜。在此温育期之后，形成了单个分离的细菌无性系。

e.Southern吸印法测定

为使本发明载体的宿主细胞基因组内的机构特征化，从产生本发明颗粒的细胞系中分离出染色体DNA，用适宜的限制性内切酶酶解，并按Southern的方法（J.Mol.Biol.，Vol.98，pp503-517，1975）使用32磷标记的DNA探针分析。在用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶解染色体DNA（20μg）之后，所获的片段用0.7%琼脂糖凝胶电泳分开。随后，用366nm紫外光照射10分钟和用0.5NNa OH及1M NaCl的溶液温育45分钟使DNA变性。凝胶在0.5M Tris，1.5M NaCl，pH7.5的液体中温育60分钟而中和。在3M NaCl，0.3M柠檬酸钠（20×SSC）浸泡20小时，用常规干纸巾盖住硝化纤维素过滤器的顶部通过凝胶，将DNA转移到硝化纤维素滤器上。硝化纤维滤器在80℃真空烘箱中保持2小时。

来自pDM1质粒（4.3Kb）之EcoRⅠ-XbaⅠ片段的放射性DNA探针用切口转译法制备。

为了与DNA探针杂交，硝化纤维滤器封于含有10ml预杂交混合物的塑料袋中，该混合物为50%甲酰胺，5×SSC，50mM磷酸钠，pH7.0，5×Denhardt′s溶液，250μg/ml变性鲑鱼精子DNA。过滤器于45℃该混合物中温育4小时，此后，预杂交混合物被杂交混合物取代，杂交混合液为50%甲酰胺，5×SSC，20mM磷酸钠，pH7.0，1×Denhardt′s溶液，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA，5×10⁵cpm/ml³²磷探针。过滤器在45℃杂交混合液中温育18小时后，在50℃的0.1×SSC，0.1%SDS中洗三次，每次5分钟。过滤器在60℃干燥10分钟，对在两个增感屏之间的两张X光底片（XAR-5，KODAK）曝光，并保存于-80℃。第一张X光底片在曝光三天后冲洗;第二张底片曝光7天后冲洗。标记的DNA探针与来自产生本发明颗粒之转染体的细胞DNA限制性片段之一的杂交，证实了细胞的DNA确实含有本发明的整合载体。如Southern吸印过程所阐明，因为细胞的DNA限制形式与原始质粒结构的相同，所以在整合到宿主细胞DNA中时没有发生质粒DNA的主要重排。

2.哺乳动物细胞系的转染和产生本发明之颗粒的克隆的鉴定

用Wigler等人（Cell，Vol.14，p.725，1978）的磷酸钙沉淀法转染细胞。细胞接1∶6平分到新的培养皿中，已经接受了抗药识别基因（neo）的细胞在含有G418的培养基中生长选择。在选择性培养基中生长10天后，抗药菌落被克隆到微滴板上。在细胞融合后，用RIA技术评价本发明之颗粒的表达水平。

组织培养皿（直径100mm）用5×10⁵个细胞接种并在37℃温育过夜。转染前4小时，更新培养基。要转染的DNA悬浮于1ml含有250mM CaCl₂，140mM NaCl，25mM Hepes，pH7.1和0.75mM NaHPO₄的溶液中。将这种磷酸钙-DNA沉淀加到含细胞的培养基中。过夜温育之后，向细胞培养物中加入新鲜培养基，细胞再温育两天。

F.哺乳动物细胞的静态细胞培养过程

1安瓿保存于-196℃液氮中的细胞通过将安瓿放入37℃水浴5分钟快速融冻。1ml新融冻的细胞悬浮液通过缓慢加入适宜的培养基而稀释。随后，离心收获细胞，重新悬浮于10ml培养基中。此后，离心收获细胞，重新悬浮于10ml培养基中，转移到T25培养瓶中，在37℃和有5%CO₂的保温器中生长。以这些条件，对L-细胞和CHO细胞的增倍时间为15-20小时，而对Vero细胞为30-40小时。L-细胞和CHO细胞可以超过100%融合并保持存活及生长，但是Vero细胞却在100%融合处传代。

G.哺乳动物细胞在ACUSYST-P中的生长过程及本发明之颗粒的收获

1.接种物的制备和生长

细胞保留在含有DMEM-10%FBS的T75或T150烧瓶中。摇瓶（850cm）用收获自T-烧瓶中的细胞10-15×10⁶个接种。生长3-5天后，从6个摇瓶中收获到的细胞总数约为10⁹个，并用于接种在ACUSYST-P中的6个中空纤维筒（HFC′s），是美国明尼苏达州明尼阿波利斯市Endotronics，Inc.的产品。

2.ACUSYST-P培养和本发明之颗粒的收获

接种后，HFC′s插入到ACUSYST-P培养系统中，培养基流经药筒的速率调整到并保持在50ml/hr。每天检测培养基的pH，pO₂，葡萄糖和乳酸。生长2-3周后，从每个ACUSYST-P中空纤维筒的超毛细空间每周两次收获600ml流体。用放射免疫测定法（RIA）测定本发明之颗粒的生产。由于冰冻破坏RIA可测定的活性，所以收获物在纯化前储存在4℃。用Azocoll底物蛋白水解（б）法测定，在这样的条件下没有能检测到蛋白酶活性。

3.质量控制过程

a.对细菌和真菌存在的测试

每升含有约5×10⁵个细胞的一池细胞，悬浮在从其中收获出细胞的培养基中，用于测定细菌和真菌的存在。1ml细胞在胰蛋白酶大豆琼脂（BBL）板上形成条纹，另1ml细胞接种到硫乙醇酸盐培养基（DIFCO）中，检测好氧及厌氧细菌的存在。将1ml细胞在Sabouraud（DIFCO）琼脂板上形成条纹以检测真菌污染。这些试验在正常基础上进行以保证生长培养基无菌性和细胞培养物中没有细菌和真菌污染。

b.支原体的测试：荧光染色

用荧光染料Hoechst 33258染色方法确定细胞的胞质中是否存在支原体DNA。这种染色DNA在紫外光下发出荧光，并且为快速灵敏地检测支原体提供了基础。该过程涉及对要检测的细胞培养物做盖玻片，在50-70%融合时使用。在固定和染色之后，盖玻片用荧光显微镜检验。胞质中的荧光表明存在有支原体。

大量的Hoechst 33258苯甲酰胺荧光染料溶液是用5mg该染料溶解于100ml PBS，用磁搅拌而制成。用0.22μm的膜过滤使其无菌，保存于暗处，4℃，在使用前用PBS千倍稀释。来自盖玻片培养物的培养基，是50-70%融合的，是抽自细胞的，并在4℃更换两次乙醇∶乙酸（3∶1）固定之。用去离子水洗一次以及用稀释的双苯甲酰胺荧光染料（Hoechst-33258）在37℃温育30分钟之后，用去离子水洗涤盖玻片。封固盖玻片，细胞面向下，在载片上用甘油封固剂（22.2ml 2.1%柠檬酸;1ml H₂O;27.8ml2.8% Na₂HPO₄;50ml甘油，pH5.5）。

C.d对病毒的测试

1）细胞培养物中的测试

用被测细胞系悬浮液接种后，在温育期的最少14天内检查被测细胞的正常形态。此外，在第3-5天，及又12天之后，用羊或人血红细胞冲洗至少4%接种的测试培养物以检测血细胞吸附。培养物在3-4℃温育30分钟后读出试验值，于34-37℃30分钟后再读一次。对吸附红细胞的病毒感染细胞的检测结果表明没有病毒污染。

2）动物实验

待测细胞以每毫升10⁶个的浓度悬浮于140mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，pH7.2的溶液中，对各组动物接种。在其中一组，对至少来自两窝的至少10只乳鼠接种。每只动物腹腔注射0.1ml细胞并脑内注射0.01ml接种。每日观察至少14天。实验开始24小时之后每只死亡的鼠或病死的鼠均作尸体解剖以检查病毒感染的证据。该检查中还包括另一至少5只乳鼠试验组，它们被以适宜的组织悬浮液脑内和腹腔内不足量接种然后每日观察至少14天。此外，从最初24天试验的全部存活鼠的乳化组织（除去皮肤和内脏）的一池中做一盲目继代移植。

在另一组，对10只成鼠接种。每只动物以0.5ml细胞腹腔内接种，以0.03ml细胞脑内接种。观察动物4星期，任何患病的及表现出异常的动物均进行检查以找出病因。对病毒污染的动物实验的结果表明没有病毒污染。

d.致肿瘤性实验

适宜的致肿瘤实验使用裸鼠（nu/nu），包括对出生后24小时之内的20只动物给以0.1ml强力血清。以肌肉注射或皮下注射，并在生命的第2，7和14天重复。1百万个常规参照肿瘤细胞产生逐渐增长的肿瘤并转移。1百万个侯补细胞系的存活细胞以皮下注射途径接种到任何肿瘤生长产生颤抖的部位（腿部为适宜的）。观察动物21天，观察注射部位形成瘤的证据，周期性测量以确定它们是否逐渐增长。在21天观察期的结尾，所有动物均被处死，检查在注射部位以及其它器官如淋巴节，肺，肾和肝中肿瘤形成的肉眼能看到的证据。对所有类似肿瘤的病灶以及所有注射部位都进行组织病理学检查。此外，由于有些细胞系含产生迁移而又没有定位肿瘤生长的迹象，所以对所有动物的肺和区域淋巴节都进行组织病理学检查。

为本实验的目的，逐渐增长的肿瘤被定义为可触摸到的瘤，并在21天的观察期内体积增大，而且在进行组织学检查时表现出为存活的并且接种的细胞有丝分裂活跃。与显微存活细胞相联系的静止或退化的肿瘤被认为不属于逐渐增长的肿瘤。

H.本发明颗粒的纯化

1.用聚乙二醇的分步沉淀

将超毛细空间的培养基从ACUSYST-P培养系统中收获到并收集到3000ml的体积。向每一体积中加入180g聚乙二醇（PEG）（б），在室温下搅拌20分钟，在4℃再搅拌3小时使之溶解。放入500ml瓶中，用GS3.旋转离心机以每分钟4500转（3000×g）在10℃离心30分钟收集沉淀。收集上清液，再加入180g PEG8000，在室温下以上述方式溶解。溶液在4℃再搅拌3小时。以上述方式收集其中的沉淀，只是改为以每分钟9000转（15000×g）离心60分钟。片状沉淀物重新悬浮于20ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

2.凝胶过滤层析

在PEG沉淀后获取的材料重新溶于PBS，进行凝胶过滤层析，使用Bio Rad A-5m树脂，温度4℃。柱的大小为25×1000mm，床体积为480ml。用典型的分步层析法，将10-15ml体积的本发明颗粒1000μg装柱，用PBS或TNE洗脱，流连为6滴/分（18毫升/小时），接3ml1份收集。图6显示出从A-5m柱上洗脱出的可进行放射免疫测定（RIA）分析之材料的曲线。实线表示各部分在280nm处的吸收，圆点表示RIA结果计算出的材料量。

3.在Cs Cl中等密度离心

覆盖凝胶过滤柱色谱结果的第一个峰并含有部分本发明之纯化颗粒的30个部分被收集起来（约100ml）。用Cs Cl调其密度至1.30g/cc，然后转移到放在SW27/28旋转离心机（Beckman）中的硝化纤维管中。底层是密度为1.35g/cc的Cs Cl溶液4ml，上层是密度为1.25g/cc的溶液4ml及1.20g/cc的溶液4ml建立起梯度。该梯度在10℃以每分钟28000转离心50小时，分份，收集梯度上部1.20g/cc密度层中的纯化颗粒（图7）、纯化颗粒与梯度中段中少量污染蛋白质很好地分开。对溶液透析除盐24小时，首先用水，然后对盐水透析，换三次盐水。

作为进一步控制质量的方法，一部分该梯度纯化的材料进行线性Cs Cl梯度离心。正如所预期地在1.20g/cc部分出现了纯化颗粒的单峰。

Ⅰ.本发明纯化颗粒之佐剂的制备及稳定性试验

为了制备本发明疫苗的佐剂，将1/10000体积的乙基汞硫代水杨酸钠，1/10体积过滤消毒的0.2MAl K（SO₄）₂∶12H₂O加入到所需浓度的抗原存在于消毒盐水的液体中。用消毒的1N NaOH调pH至5.0，悬浮液在室温下搅拌3小时。明矾-沉淀的抗原以每分钟2000转离心10分钟回收，重悬浮于含1∶10000乙基汞硫代水杨酸钠的无菌生理盐水，在无菌条件下分成等分试样。

为了测定明矾吸收的本发明之颗粒的稳定性，将明矾重新溶解在3%柠檬酸钠中并接着对3%柠檬酸钠和PBS连续透析而回收抗原。本发明颗粒的质量再用平行线放射免疫测定法，对照纯化HBs Ag标准于PBS-50%牛胎儿血清的稀释液来确定。

表1

稳定性试验参数

样品;两种样品，每种的量均很大并被明矾吸附

样品浓度：5μg/ml

储存器：玻璃管瓶

储存温度：2-8℃

试验：（a）定性的：SDS-PAGE，

（b）定量的：放射免疫测定法

例1：含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区多肽颗粒的表达

A.制备重组质粒PMMT-neo：

用限制内切酶BamHⅠ酶解质粒pBPV342-12（见图1及材料与方法）。生成两个DNA分子：一个分子（7.95千对碱基）包括牛乳头瘤病毒（BPV）的整个基因组;另一个分子（6.65千对碱基）含有细菌质粒pML2（删除有毒顺序的pBR322质粒）的一部分，小鼠的金属硫因（metallothionein）启动子，抗新霉素基因（neo）和SV40 PAS-t（见图1）。当它自身连接时环化，该片段就成为pMMT-neo质粒（见图5）。

反应在总体积为40微升的反应缓冲液中进行（见材料与方法），pBPV342-12DNA的终浓度为0.2微克/微升;含80个单位的BamHⅠ，在37℃下反应4小时。用0.7%琼脂糖凝胶电泳检查酶解是否完全（见材料与方法）。加40微升8摩尔的LiCl中止反应，然后用1毫升乙醇于-80℃沉淀30分钟。再将DNA沉淀重悬在100微升的10毫摩尔的Tris，pH7.8。

B.分离含与天然转录启动子相连的整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的片段。

用美国国家科学学报77卷，1842页刊登的Cummings，I.W.等人在1980年叙述的方法制备和克隆HBV基因组，亚型adw。环状的HBV基因组在唯一的EcoRⅠ点线性化，然后克隆到λ噬菌体gtWES中，再亚克隆到一个细菌质粒中，生成pAO1质粒（见图2）。由于EcoRⅠ限制酶点位于Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区中，所以当在该点断开成线性时，Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区也被切断了。为重建完整的该编码区，分离出pAO1质粒的3.2千对碱基的EcoRⅠ点插入体，并将其与质粒DNA分开。分离的方法是在含200个单位的EcoRⅠ的总体积为400微升的反应缓冲中37℃下酶解100微克的pAO14小时。然后通过0.7%制备性琼脂糖凝胶电泳将3.24对碱基的插入DNA与质粒DNA分开。将DNA从凝胶电泳洗脱到DE81 Whatman离子交换滤纸，再用高盐溶液将DNA洗脱。通过一次苯酚/氯仿萃取纯化DNA，再用酒精沉淀两次。将为完整HBV基因组编码的纯化的线性3.2千对碱基的EcoRⅠ片段在DNA高浓度下自身连接。高浓度的DNA有利于形成多联体：将30微克EcoRⅠ片段DNA在50微升含1.8单位T₄DNA连接酶和2毫摩尔ATP的反应缓冲液中，15℃下反应1小时，再置4℃下过夜使其连接，再用苯酚/氯仿萃取两次，单独氯仿萃取一次纯化，然后用酒精沉淀两次。将DNA沉淀重悬在20微升10毫摩尔Tris中，pH7.8。再在含505单位的BglⅡ的50微升反应缓冲液中，37℃下酶解4小时。

甲1.5%琼脂糖凝胶电泳分离上述DNA片段。分离出2.78千对碱基含整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区及表达表面抗原多肽必须的天然启动子系统的BglⅡ片段，如上述方法用琼脂糖凝胶纯化之。（见图2）。

c.将含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的片段插入pMMT-neo质粒中：组建pDM1质粒。

取1微升A部分所述方法制备的DNA溶液，与B部分制备的2.78千对碱基BglⅡ片段5毫升混合。

上述混合液在含0.9单位T₄DNA连接酶的10微升反应缓冲液中，于15℃连接反应1小时，再于4℃下过夜。

细菌细胞，优先的是HB101，作为如材料方法中所述转化方法中摄取DNA的受体细胞。连接反应液含10毫摩尔TriS，pH7.5，1毫摩尔EDTA，总体积为70微升，加入200微升的受体细菌细胞悬液以摄取DNA。

将混液放置冰中30分钟，然后加1毫升L-肉汤;再将其在42℃下温育2分钟，37℃下40分钟，然后将细胞分散在LB琼脂平板皿，每皿氨苄青霉素的含量为50微克/毫升，注入细胞悬液50到300微升。将培养皿在37℃温育过夜。筛选含有所需2.78千对碱基BalⅡDNA插入片段的pMMT-neo细菌质粒的单个菌落。（见图3）

优选的是用菌落杂交法筛选。用牙签取出筛选的单个菌落，转到有栅格的含LB-氨苄青霉素的琼脂平皿上，使得能鉴定克隆。将平皿37℃温育过夜。

将滤纸铺在琼脂表面，使滤纸湿润，从而将菌落转移到硝酸纤维滤纸上。剥下滤纸，再将其转移到三层Whatman 3M纸上，将其浸在0.5摩尔NaoH，1摩尔Tris，pH7.0;或1.5摩尔Nacl/0.5M TriS，pH7.4，或2×SSC。当细菌溶解时，将滤纸置于浸泡了的Whatman纸上，从而菌落就转到Whatman纸的上面，然后中和固定。

在空气中干燥滤纸，再在真空下80℃烘烤干，然后在硝酸纤维滤纸上将DNA与放射标记的DNA探针杂交，该探针是含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的2.78千对碱基的BglⅡ片段，用B部分叙述的切口-转译法制备的（见材料与方法）。

先将硝酸纤维滤纸浸在予杂交混液中，该液含50%甲酰胺，20毫摩尔磷酸钠缓冲液，pH6.61×Denhardts溶液;100微克/毫升变性鲑鱼精子DNA和在68℃，0.2N NaOH中解链的1×10⁷cpm放射活性的32p标记DNA。

再将予杂交液中浸过的滤纸，放在45℃的同样混液中温育16小时。然后在含2×SSC和0.1%SDS溶液中室温下洗两次，每次5分钟，再在含0.1SSC，0.1%SDS溶液中50℃下洗两次，每次15分钟。再将滤纸放在X光底片上-80℃下使底片曝光（最好用3M底片）两天。

含克隆的2.76千对碱基BglⅡ片段重组质粒的菌落在片上以黑斑出现。50个菌落中有4个含该片段。用Birnboim和Doly在“核酸研究”1979年第7卷第1513页所述制备性小凝胶来分离这些菌落的质粒，再用BglⅡ和XbaⅠ双酶解法分析之。分析结果证实达到上述组连所需新质粒的目的（见图3）。

D.用金属硫因启动子取代Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区天然起动子：组连pDM2

将上述质粒pDM1用限制酶BglⅡ和BamHⅠ完全酶解。100微升反应液含20微克质粒DNA，先将其在含50单位BglⅡ，6.7毫摩尔Tris，pH7.8;6.7毫摩尔MgCl₂;6.7毫摩尔β-巯基乙醇的反应缓冲液中，37℃下反应4小时;将反应液食盐浓度提高到150毫摩尔Nacl，再加40单位BamHⅠ在37℃过夜使其完全酶解，得到三个片段，大的为5.1千对碱基，中等的为2.97千对碱基，小的为1.4千对碱基。用制备性0.7%琼脂糖凝胶电泳分离这些片段，将5.1和1.4千对碱基的片段再用DE81Whatman离子交换滤纸电泳分离。

将滤纸4℃浸在高盐溶液中4小时，以回收DNA。再用苯酚/氯仿萃取法提纯，然后用酒精两次沉淀DNA。将DNA沉淀重悬在20微升10毫摩尔Tris，pH7.8缓冲液中。取1微升用琼脂糖凝胶电泳检查其纯度和估测其量。

在BglⅡ端含金属硫因启动子的大片段（5.1千对碱基）被接到含PreS₂-S蛋白编码区但不含天然启动子或该基因Pre S₁区的小片段（1.4千对碱基）上。大片段含有天然聚脂末端中止反应信号（hb-PAS-t），该信号是表达乙肝Pre S₂-S蛋白编码区所必需的（见图4）。

因为大片段也含细菌质粒，它有可能自我连接并繁殖，而不将小BamHⅠ片段包在其中。将20微升大片段制备液的10微升加入28单位碱性磷酸酯酶，在37℃下温育20分钟。然后加1微升50毫摩尔的EGTA在68℃温育10分钟以终止反应。在DNA溶液中加Licl使其浓度达0.8摩尔，然后用酒精沉淀两次以进一步纯化。

将DNA沉淀重悬在10微升10毫摩尔的Tris，pH7.8，取5微升作为对照，检查其自我连接情况，另外5微升混入5微升电泳洗脱的小BamHⅠ片段（1.4千对碱基）。每个样品的连接反应是在上述20微升总体积中进行，然后如上述方法转化HB101细菌细胞。

取出12个单菌落，使其生长在2毫升培养液中，根据Birnboim和Doly方法（刊在Supra）分离质粒DNA。用限制酶EcoRⅠ+XbaⅠ双酶解检查质粒DNA插入与否及小BamHⅠ片段的插入方向。

十二个质粒DNA中的两个具有与金属硫因启动子同样方向插入的小BamHⅠ片段（1.4千对碱基）。

将这些质粒DNA大量培养，并准确通过联合转转染方法引入真核细胞。

此外，携带金属硫因启动子的pMMT-neo质粒的EcoRⅠ/BglⅡ片段（1.9千对碱基）用来取代pDM1中Pre S-S蛋白编码区前的EcoRⅠ-BamHⅠ短片段（1.9千对碱基）用来取代pDM1中Pre S-S蛋白编码区前的EcoRⅠ-BamHⅠ短片段（32对碱基），形成如图5所示的pDM3质粒。

E.将C和D部分得到的重组DNA载体引入哺乳动物细胞，建立生产本发明颗粒的细胞系。

用重组质粒pDM1和pDM2联合转染小鼠L细胞，非洲绿猴（Vero）细胞和3T3小鼠成纤维细胞。采用标准转染程序进行（见Graham和Van der Eb，“病毒学”第52卷，456页，1973年Supra.）摄取并维持有质粒DNA的细胞抗药物G418，因此残留在含该药物的选择培养基中。没摄取该DNA的细胞则死亡。这些细胞可从培养皿表面的单个菌落被观察到。将细胞用培养筒天性繁殖;再进一步以常规方式在常用的培养基例如：Dulbecco氏修饰了的Eagle培养基（即在该培养基中补加10%小牛血清和500微克/毫升的G418）中大量培养。将其中5个克隆建立细胞系，分别命名为ENDO-Ⅰ，Ⅱ-Ⅲ-Ⅳ和Ⅴ。将它们冷冻作为母液。用放射免疫法测定静止培养的该细胞系的产率（RIA法，见材料与方法），与已知细胞系产率比较。用本发明的细胞系，平均每天每毫升培养液可产生500到1000纳克的颗粒。

F.生产本发明颗粒的细胞系Acusyst-P培养物。

用在六个摇瓶中生长在DMEM+10% FBS基质中大约10⁹细胞接种在Acusyst-P培养系统的六个空纤维筒中。从每个Acusyst-P中空纤维筒的超毛细空隙中每周收集两次约600毫升的液体，在纯化前其贮存在4℃下。用RIA法测定本发明颗粒的浓度。

G.从Acusyst-P培养基质中分离纯化本发明的颗粒。

用聚乙二醇沉淀，凝胶过滤和在氯化铯梯度中等密度超离心法纯化新细胞系生产的含由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区编码的蛋白颗粒。

1.用聚乙二醇分步沉淀（PEG）：

将超毛细空隙取出的介质从Acusyst-P培养系统中收集，合并成每份3000毫升。每份中加入180克PEG8000（SIGMA公司产品），室温下搅动20分钟使其溶解，再在4℃下搅动3小时，将其注入500毫升离心瓶中，用GS3转头，以4500转/分（3000×g），10℃离心30分钟收集沉淀。收集上清液，再加入180克PEG8000，如上述使其室温下搅动溶解。再在4℃下搅动3小时。如上述离心收集沉淀，改用9000转/分（15，000×g）60分钟。再将沉淀重悬在20毫升磷酸缓冲盐水（PBS）。

2.凝胶过滤层析：

将用PEG沉淀的材料重溶在PBS中，在4℃过Bio Rad A-5m树脂柱。柱大小为25×1000mm，床体积是480毫升。在典型的分部操作中，将溶在10到15毫升PBS的1000微克本发明PEG沉淀颗粒装柱，用PBS或TNE以6滴/分（18毫升/小时）速度洗脱，每份收集3毫升。图6表示从A-5m柱上洗脱曲线。实线表示每份样品在280纳米处的吸光率，虚线表示用RIA法计算的每份样品中含本发明颗粒的量。

3.在氯化铯中等密度离心：

大约有30份在图中复盖了凝胶层析的第一个峰（见图6），它们都部分地含纯化的颗粒。将这30份合并在一起约100毫升。将其密度用氯化铯调至1.30克/c.c.，随后移到安在SW27或SW28转头（Beckman）上的硝酸纤维管中。最下层为4毫升的密度为1.35克/c.c.，氯化铯溶液，再加一层4毫升1.25g/c.c.，溶液，最上层为1.20克/c.c.，的溶液。在28，000转/分，10℃离心50小时，并分离样品。纯化的抗原离心后位于上部的密度为1.20克/c.c.，的层中，收集抗原。本发明的颗粒与梯度中部结合的少量杂质蛋白被很好地分离（见图7）。放置盐水中透析脱盐三次，其透析24小时。

作为检测产品质量的方法，将梯度离心纯化的材料置于氯化铯线性梯度离心。如所期望的在1.2克/c.c.，处有一个单峰。

H.细胞系产生的本发明颗粒的特征：

所制备出本发明颗粒多肽的纯度和物理性质是通过常规的实验室技术测定的，诸如：放射免疫试验，免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺电泳等。

1.纯度测定：

a.测定血浆蛋白污染水平：

通过标准的RIA技术用抗牛血清蛋白的特异性抗体：Ig A，Ig G，Ig M等测定在纯化的本发明颗粒中混有不同血清蛋白的量。结果示在表2，可看出没有明显地免疫球蛋白污染，仅有少量的清蛋白污染。

表2

用RIA法测定血浆蛋白的污染

蛋白总蛋白的%

清蛋白 0.05

Ig G 0.2

Ig A 0.2

Ig M 0.2

b.用Dot Blot法测定宿主细胞或Pre S₁-Pre S₂-S核酸序列对本发明纯化颗粒制备液的污染水平：

将点吸印杂交法（Dot Blot）用于提纯的本发明的颗粒，测定Pre S₁-Pre S₂-S DNA顺序或宿主染色体DNA对它的污染。每个点在40微升0.25N NaOH加入100纳克纯化的本发明颗粒，在68℃加热10分钟。作为正对照，在40微升0.25N NaOH中加20微微克重组质粒pDM1 DNA;以同样条件处理。在NaOH中变性后立即将其散置在硝酸纤维素各点上。然后用与Southern吸印法类似的程序处理、杂交，只是探针改用50∶50的染色体DNA和本发明含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区质粒DNA的混合物。如予期的结果，杂交探针与本发明的重组质粒DNA杂交产生很强的信号，而与纯化颗粒杂交只产生很弱的本底信号。杂交的样式说明在样品中没有Pre S₁-Pre S₂-S DNA或染色体DNA。

2.免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析：

为测定本发明转染体产生的Pre S₁-Pre S₂-S多肽的式样，将其用生物合成标记，免疫沉淀和在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。通过与天然得到和乙肝病毒（HBV）抗体免疫沉淀将蛋白与培养介质分离，其电泳图可通过银染色使肉眼观察到。两个主要蛋白的大小相当由S蛋白编码区编码的非糖基化和糖基化的多肽（分别为24千道尔顿和27千道尔顿）。两个小蛋白相应由Pre S₂-S蛋白编码区编码的分别为33千道尔顿和36千道尔顿的两个多肽。该方法不能观察到少量含Pre S₁-Pre S₂-S的多肽。但Western免疫吸印法（见infra）可观察到整个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白。凝胶顶部的弱带是聚集蛋白，用天然得到的HBV颗粒免疫沉淀它也是可见的。因此，用Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区转染的细胞分泌的蛋白不仅与天然产物的抗体反应，大小也与天然产物一样。这些蛋白的大小从乙肝病毒得到的天然糖基化Pre S₁-Pre S₂-S，Pre S₂-S和S多肽一样说明这些细胞正常情况下是进行糖基化物。

3.免疫吸印（Western）

为鉴定与特定抗HBV抗体反应并银染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析出现的每种多肽，使用Western免疫吸印法。将SDS-聚丙烯酰胺电泳分离的蛋白通过电泳吸印，在4℃，100伏，用3小时转到硝酸纤维滤纸（Schleicher和Schull）。然后将滤纸用蛋白饱和以防止过氧化物酶标记的抗体与其非特异性结合。为此，在室温下将滤纸在含20%新生小牛血清的PBS缓冲液中温育1小时。然后通过将HBV特异性抗体与过氧化物酶结合使本发明的颗粒多肽可观察到。将滤纸铺在蜡膜（parafilm）上，在湿盒中，室温下用结合的抗体溶液浸泡蜡膜3小时。用含0.5%吐温（Tween）的10毫摩尔Tris和5毫摩尔Cacl的缓冲液洗六次。然后泡在含色厚POD（0-二盐酸苯二胺），0.3克/升过氧化氢的柠檬酸-磷酸缓冲液中。中止液为0.5N的硫酸。相应所有6个病毒多肽的蛋白带，即所有由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码的蛋白都显现出来。

4.含本发明颗粒的Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区编码的纯化蛋白的氨基酸组成：

加酸水解后，测定Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区编码的纯化蛋白的氨基酸组成，并与S-蛋白编码区，Pre S₂-S蛋白编码区或Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区核苷酸顺序计算的多肽氨基酸组成比较。结果示在表3，与从DNA序列予测的结果及发表的结果一致（见Shiraishi等人，1980年J.Gen.Vircl，48卷31页的文章）。突出的特点是这些多肽富含丝氨酸，脯氨酸和亮氨酸。

表3

本发明纯化蛋白颗粒的氨基酸组成

残基百分数

予测值

氨基酸^＊测定值 S Pre S₂-S Pre S₁-Pre S₂-S

天冬酰胺

十天冬氨酸 5.5 4.2 5.2 7.3

苏氨酸 7.5 8.0 7.9 7.8

丝氨酸 12.5 11.3 12.0 10.8

谷酰十谷氨酸 7.5 4.2 4.5 5.1

脯氨酸 12.5 10.8 10.5 12.6

甘氨酸 8.6 6.6 7.1 8.3

丙氨酸 5.0 2.8 4.5 5.4

缬氨酸 4.2 5.2 5.2 4.8

半胱氨酸 3.2 6.6 5.2 3.8

蛋氨酸 1.9 2.3 2.2 1.9

异亮氨酸 4.9 7.5 7.5 6.7

亮氨酸 12.8 15.5 13.9 12.1

酪氨酸 2.0 2.8 2.6 1.9

苯丙氨酸 5.6 7.5 6.0 5.4

赖氨酸 2.1 1.9 1.5 1.3

组氨酸 0.9 0.5 1.1 1.9

精氨酸 2.1 2.4 3.0 3.0

98.8% 100.1% 99.9% 100.1%

＊在水解过程色氨酸丢失的。

I.本发明纯化的乙型肝炎颗粒的电镜检验：

在电镜下，纯化的本发明的颗粒为直径22纳米的球形颗粒，它与乙肝S蛋白多肽组成的颗粒相似。

J.制备加佐剂的本发明纯化颗粒，测定其稳定性：

为制备加佐剂的本发明疫苗的将1/10，000体积的乙基汞硫代水杨酸钠，和1/10体积用于灭菌滤纸的0.2M AlK（SO₄）₂∶12H₂O加入无菌盐水中所需浓度的抗原。用无菌1N NaOH将pH调至5.0，把悬液在室温下搅动3小时。以2000转/分离心10分钟回收明钒沉淀的抗原，将其在重悬在含1∶10，000乙基汞硫代水杨酸钠的无菌正常盐水中，在无菌条件下分成几份。

为测定本发明颗粒的稳定性，将吸附在明钒上的颗粒重溶在3%柠蒙酸钠液，再在3%柠檬酸钠和PBS中连续透析。然后平行线放射免疫试验，以在PBS-50%新生小牛血清标准稀释作对照，测定本发明颗粒的量。稳定性试验结果（表4）表明纯化颗粒（全部或明矾吸附部分）在2°-8℃下至少7个月之内是稳定的。

表4

稳定试验

SDS-聚丙烯酰胺

电泳带的样式

贮存时间（月）总体的样品明矾吸附的样品

开始 1 2 1 2

1 正常正常正常正常

2 正常正常正常正常

3 正常正常正常正常

4 正常正常正常正常

5 正常正常正常正常

6 正常正常正常正常

7 正常正常正常正常

RIA法定量测定

活性百分数（%）

总体样品明矾吸附样品

贮存时间（月） 1 2 1 2

开始 101 101

1 101 101 100 100

2 99 99 99 100

3 100 100 99 101

4 99 100 101 99

5 102 99 99 98

6 100 101 100 100

7 99 98 98 101

K.血清转换与本发明颗粒的ED50：

血清转换试验是在五组成年白鼠上进行的（图8A，8B和8C）。用1毫升含本发明颗粒的明矾佐剂疫苗皮下注射Gm雌1CR系瑞士小鼠，稀释度为：1/1（5.0微克），1/4（1.3微克），1/16（0.31微克），1/64（0.16微克）和1/256（0.078微克）。28天后放血，用HBIG标准作对照，根据AUSAB试验测定抗体滴度。每个动物的血清样品要连续稀释四倍，每个试验重复三次。

显示正血清型的小鼠百分数随着本发明颗粒稀释度增加而下降。50%的动物显示正血清型的用量（ED50）约为含该颗粒疫苗的0.05-0.25微克。一般来说，用本发明的疫苗得到的血清转换与从天然疫苗得到的结果差别不明显。

例2：含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区多肽颗粒的表达：

A.制备重组质粒pENDO-1：

从重组质粒pBglⅡ2.8，pBR322.βG2（由Tilghman等人叙述的将质粒pMB9.βG2的7千对碱基EcoRⅠβG片段亚克隆到pBR322的EcoRⅠ切点而生成的质粒，刊在美国科学院学报75卷，725页，1978），pDM2，Polink 23456（见infra）及pMMT-neo分步组建不含非HPV病毒基因组部分的重组表达载体。

参看图9A和9B，pBglⅡ2.8质粒含一个包括Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的片段（1.3千对碱基的BstEⅡ-HpaⅠ片段）和携带转录Pre S₂-S蛋白编码区的天然强启动子，但缺少转录Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区及结束转录和聚腺苷酰化的天然（弱）启动子。质粒pBglⅡ2.8被BstEⅡ和HpaⅠ酶解，生成两个DNA片段。然后用3.5%聚丙烯酰胺凝胶分离各片段，纯化和保留其中含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的片段（1.34千对碱基。HpaⅠ末端是平整的。通过加入DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）和四种dNTP′S，用常规的技术填充其中一个单链，使Bst EⅡ末端平整，产生一个具两个平整末端的DNA片段。

采用的一个多连接体质粒Polink 23456，在多连接体区（见下面）有一系列限制酶切点。多连接体的连接物是被夹在质粒PBR328的EcoRⅠ-SalⅠ骨架片段上。（3.1千对碱基）

用HpaⅠ酶解Polink 23456，使其线性化。该线性化质粒有两个平整末端。将该质粒的平整末端与从pBglⅡ2.8质粒（见上）得到的含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的1.34千对碱基DNA片段连接。由于1.34千对碱基片段可从任何方向连接到polylinker质粒上，正确的方向天然转录方向顺时针）通过EcoRⅠ酶解来确定，然后在1%琼脂糖凝胶分析片段大小。携带Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的质粒从正确方向用EcoRⅠ酶解得到两个带（0.4和4.11千对碱基）;不正确方向酶解得到两个1.0和3.5千对碱基的片段。用HpaⅠ酶解和用BamHⅠ部分酶解含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的新质粒，将HpaⅠ和BamHⅠ限制点间的短序列（2.4对碱基）与HpaⅠ-BamHⅠ部分酶解的骨架（5.6千对碱基）分离，从完全酶解的反应混液中除去该片段。

用BalⅠ（形成平整端）和BglⅡ酶解（产生粘性末端）酶解质粒pBR322.βG2，得到一个含小鼠球蛋白mg-PAS-t聚腺苷酰化中止序列的一个基团（1.6千对碱基）。然后将mg-PAS-t片段连接到来自上一步的打开的HpaⅠ-BamHⅠ线性化质粒，BalⅠ-to-HpaⅠ和BglⅡ-to-BamHⅠ（BglⅡ和BamHⅠ“粘性”末端是一样的，又是相容的，彼此可以连接。）形成一个新中间重组质粒（6.0千对碱基），它既含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区也含mg-PAS-t序列，而且是以正确的方向和顺序插入的。用BalⅡ和SalⅠ酶解含Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区/mg-PAS-t的质粒，再1%琼脂糖凝胶电泳测定分裂两个片段（2.95千对碱基和3.05千对碱基）。再用PvuⅠ酶解3.05千对碱基的片段，产生两个较小的片段（1.08和1.98千对碱基），纯化含融合的Pre S₁-Pre S₂-S的编码区/mg-PAS-t片段的2.95千对碱基BglⅡ-SalⅠDNA片段，将其保留。

将例1得到的6.65千对碱基片段连接生成的质粒pMMT-neo，A部分（见图9）再用BglⅡ和SalⅠ酶解得到两个片段（4.23和2.42千对碱基）。除去含新霉素选择标记的2.42千对碱基片段和SV40PAS-t片段。用0.8%琼脂糖凝胶电泳纯化残留的4.23千对碱基片段。然后将它与BglⅡ-SalⅠ2.95千对碱基的Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区/mg-PAS-tDNA片段连接，形成一个7.15千对碱基的重组质粒;它按顺序排列含有MMT-启动子，Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区和mg-PAS-t聚腺苷酰化终止序列，该质粒称作pENDO-1。该质粒不含非HBV病毒基因组部分（见图9）。

B.制备重组质粒pENDO-2：

参照图10，pDM2包括MMT-启动子，Pre S₂-S蛋白编码区和蛋白×编码区。将它用内切酶SpeⅠ和SalⅠ酶解。SpeⅠ限制点位于Pre S₂-S蛋白编码区的S蛋白区，只有一个SpeⅠ切点。在该基因下游有SalⅠ切点。用这两种酶，将质粒分成两个DNA片段（1.58千对碱基和4.88千对碱基），而含有Pre S₂-S蛋白编码区和X蛋白编码区的羧基的1.58千对碱基片段被除去，将4.88千对碱基片段纯化并保留。

用SpeⅠ和SalⅠ酶解pENDO-1质粒，将其分成两个片段（1.9和5.25千对碱基）。将含Pre S₂-S蛋白编码区S蛋白区的羧基端及mg-PAS-t区的1.9千对碱基片段纯化并保留。

将上述保留的两个DNA片段（1.9和4.88千对碱基）连接，产生一个新的重组质粒（6.8千对碱基），命名为pENDO-2，它含MMT-启动子，Pre S₂-S蛋白编码区和mg-PAS-t序列。质粒pENDO-2不含非HBV病毒基因组部分（见图10）。

C.制备重组质粒pENDO-0：

第三个新质粒，称作pENDO-0（见图11），含一个新霉素选择标记，它是用限制内切酶SmaⅠ（产生平整末端）和BamHⅠ酶解例1，A部分得到的6.65千对碱基片段连接形成的质粒pMMT-new生成的。质粒被分成两个DNA片段（5.5和1.15千对碱基）。将含MMT-启动子的5.5千对碱基的片段和从pMMT-neo质粒骨架得到的新霉素选择标记保留。将后者与上述含BalⅠ-BglⅡmg-PAS-t序列的DNA片段（1.6千对碱基）连接。得到的7.2千对碱基重组质粒pENDO-0含有MMT-启动子，新霉素选择标记和mg-PAS-t序列及非毒DNA序列（见图11）。

D.将质粒载体pENDO-0，pENDO-1和pENDO-2通过联合转染引入哺乳动物细胞：

将重组质粒载体pENDO-0，pENDO-1和pENDO-2联合转染到诸如小鼠L-细胞，非洲绿猴Vero细胞，CHO细胞和3T3小鼠成纤维细胞，采用的是标准联合转染程序。分离杭G418转染体，用RIA法筛选生产的本发明颗粒。

E.制备转染细胞系的pENDO-0，pENDO-1，pENDO-2质粒DNA混合多联体：

质粒pENDO-2和pENDO-0含一个PvuⅠ切点，它位于抗氨苄青霉素基因内，顺时针朝向EcoRⅠ限制点（见图9.10和11）。用PvuⅠ分别酶解每个质粒，使其成线性。然后用不同比例的各种质粒聚合成混合多联体。例如：用如T₄DNA连接酶等连接酶聚合线性质粒pENDO-1和pENDO-0，当反应物比例为pENDO-1∶pENDO-0＝10∶1时可形成一个pENDO-1∶pENDO-0＝10∶1的混合多联体。将得到的pENDO-1/PENDO-0混合多联体转到真核细胞，例如：哺乳动物细胞，再用G418筛选它们。平均每抗G418的新转染细胞中每个neo基因拷贝含大约十个Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的拷贝。

同样可通过诸如T₄DNA连接酶将pENDO-0和pENDO-2片段以10∶1比例聚合，生成pENDO-0/PENDO-2混合多联体。用该多联体转染真核细胞，如：哺乳动物细胞。用G418筛选转染细胞，平均每个本例的抗G418细胞将含大约10个拷贝。

也可用诸如T₄DNA连接酶以10∶10∶1的比例聚合pENDO-1，pENDO-2和pENDO-0。用所得混合多联体转染真核细胞，如哺乳动物细胞，再用G418筛选转染细胞。平均每个抗性细胞含10个pENDO-1和pENDO-2拷贝和1个pENDO-0拷贝。

得到具抗性的细胞能高产含由Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区编码蛋白的颗粒。

应用包括在转染的真核宿主细胞中表达其它蛋白的小鼠金属硫因启动子的非复制载体：

本发明用任何机能性DNA序列在转染的真核宿细胞中产生人或大鼠生长激素的重组DNA转移载体。

术语“功能性DNA序列”的意思是任何从某来源直接或间接得到的DNA不连续区，它可在一个用本发明载体转染的真核宿主细胞中，作为一个完整的基因表达单位，一个结构基因，一个启动子或调节区。

完整的基因表达单位是一个结构基因，它的启动子转录和转译需要的调节区。

启动子是结构基因的上游区，它使RNA聚合酶结合，开始转录。

调节区是调节结构基因转录效率的区。

结构基因是作为合成信息RNA模板的编码区。

优选的结构基因包括药物学上重要的多肽编码的，诸如：一个病毒，抗原，胰岛素，干扰素和淋巴因子，大鼠或人生长激素，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，α-1-抗胰蛋白酶等等的结构基因。最好是大鼠或人的生长激素。

本发明涉及到包含功能DNA序列和一个MMT-启动子的重组DNA载体。MMT-启动子可在原有天然启动子基础上加入DNA载体，也可代替天然启动子的位置。最好将DNA载体中的MMT启动子恰好加在该DNA顺序蛋白编码区的上游。最好这种载体也包括转录中止顺序和一个选择标记。选择标记也是好是一个药物抗性的标记，比如：新霉素抗性基因。优选转录中心顺序是一个SV40中止区（SV-PAS-t），最好是小鼠球蛋白基因的DEF区（mg-PAS-t）。可以通过常规重组DNA和其它分子生物学技术可制备这些载体。在最佳实施例中，用mg-PAS-t区，载体不含任何病毒DNA片段，因此也不是致癌基因，就是说该载体不会将引进它的宿主细胞转化。如果它不含一个能在用它能转染的宿主中行使机能的自主复制序列（复制子），这样的载体转染到宿主后整合到宿主染色体中，用宿主基因组被动复制。

本发明优选的重组DNA载体应包括下列特点：

1）一个有意义的DNA序列。

2）恰好位于有意义的DNA序列上游的一个MMT启动子。

37该载体应能在它转化的细菌或其它原核宿主中复制，生长，扩增及制备出大量重组载体，从而，这些载体应包括一个细菌或其它原核细胞复制子，即携带自主复制所需全部机能和在它转化的原核宿主细胞如：细菌细胞染色体内稳定保存的一个DNA片段，这种复制子在先有技术中已知。

4）该载体复制子应较小（即可能小于6-8千对碱基），使得人们能容易地在遗传学及分子生物学领域复制和利用它。

5）该载体携带一个选择标记，用于它转化的细菌宿主细胞，优选的是一个药物抗性标记。

6）该载体应携带一个第二选择标记，在用于它转化的原核宿主细胞时，优选的是一个诸如新霉素的药物抗性标记。

7）该载体应含便于克隆化的限制内切酶位点。

8）该载体应含一个转录中止区和聚腺苷酰化序列。

9）基因表达单位不含任何病毒片段，而且不是致癌的。

该载体最好不包括能在它转染的原核细胞中自主复制的顺序（复制子）。在真核宿主细胞中用一个非复制载体系统的首要原因是因为所有能自主复制和在它转染的哺乳动物宿主细胞染色体复制的载体系统都包括由致癌病毒得来的复制子。而人们希望的是用包含不是从致癌病毒得到的DNA的载体来表达为药物学重要的多肽编码的DNA顺序。

本发明还涉及用含本发明的功能DNA序列的一个重组DNA载体转化一个转染的真核宿主细胞。较好的宿主是一个哺乳动物细胞，最好是一个中华仓鼠卵巢（CHO）细胞系，一个Vero细胞系，一个L-细胞系或一个小鼠或大鼠成纤维细胞系。用常规技术本发明的重组DNA载体转染一个真核细胞即可制备出这样的宿主。

本发明也涉及到一种制备含有意义DNA序列编码蛋白颗粒的方法，蛋白之中至少一种是与包括下列条件的有意义DNA序列编码的多肽相应的：（a）′在能使该宿主表达所需要蛋白培养条件下培养本发明转染的宿主，和（b）分离这种颗粒。优选的转染宿主是能分泌构成培养基中该颗粒的蛋白。优选的是将重金属离子或类固醇生长激素如：地塞米松，加到培养基中，诱导MMT-启动子，从而加强这些编码区的表达。最好用诸如镉或锌等重金属离子。可用常规技术测定培养基中所含重金属离子或类固醇生长激素的最优浓度。

本发明也涉及用上述方法制备的颗粒。如果本发明的转染宿主细胞直接将这种颗粒分泌到培养基，就用常规的蛋白分离技术将它们与转染宿主培养基分离开。如果本发明转染宿主细胞不分泌这种颗粒，用培养物溶胞技术从宿主培养物溶胞物中得到这些颗粒。

例3：人生长激素的表达

制备为人生长激素码的重组DNA载体，该载体包含金属硫因启动子。

A.分离含人生长激素基因，不含天然转录启动子的DNA片段：

将为人生长激素编码含2千对碱基EcoRⅠDNA插入体的重组质粒pBR322（以顺时方向插入）用限制内切酶BamHⅠ酶解，反应在总体积500微升含100微克质粒DNA，240单位BamHⅠ，的BamHⅠ（高盐）缓冲液中进行。生成两个片段，一个约5.6千对碱基，另一个0.8千对碱基。用0.8%制备性琼脂糖凝胶电泳分离各片段。从凝胶上用电泳法洗脱出含人生长激素结构基因，不含天然启动子的较大片段，两次苯酚/氯仿萃取再两次氯仿萃取纯化之，再用酒精沉淀两次。将DNA沉淀重悬在20微升10毫摩尔的Tris，pH8.0。

B.分离含金属硫因启动子和pML2载体主链的DNA片段：

用限制内切酶BglⅡ和BamHⅠ酶解质粒pMMT-neo（见图5），得到一个含MMT-启动子和pML载体主链的4.5千对碱基片段和另一个含与SV-PAS-t偶联的neo基团。约2.15千对碱基的片段。为防止自身连接，在总体积100微升含25微克DNA片段和28单位碱性磷酸酯酶的反应液中，用该酶处理线性DNA。将反应混液在37℃温育20分钟，加10微升50m MEDTA并在68℃加热10分钟中止反应。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离各片段。如上所述，用电泳法从凝胶中将4.5千对碱基片段洗脱出，再用两次苯酚/氯仿萃取和两次氯仿纯化之，最后用酒精沉淀两次。将DNA沉淀重悬在20微升10m MTris，pH8.0中。

C.将在A和B步中分离出的DNA片段连接：

取15微克A步中分离的5.6千对碱基片段，与0.3（10）15.耍虏降玫降钠段混合，反应液总体积为10微升，内含0.9单位T₄DNA-连接酶和1×连接缓冲液，再加100mMATP。将反应混液在15℃温育1小时，再在4℃过夜。然后将连接混液用上述方法（见材料与方法）引入菌株HB101。将转化混液的细胞涂散在LB-氨苄青霉素琼脂平皿，筛选分离出含10.1千对碱基质粒的菌落，可用限制酶BamHⅠ将其线性化。用EcoRⅠ酶解测定方向。以正确方向加入插入体的质粒酶解后得到两个EcoRⅠ片段，一个3.5另一个6.6千对碱基。大量培养这些命名为PMMT-hGH的质粒，并如上提纯它们。

D.将所述C步得到的重组DNA载体引入哺乳动物细胞，建立生产人生长激素的细胞系：

根据标准的联合转染技术用载体pMMT-hGH转染真核宿主细胞（哺乳动物），得到能合成人生长激素多肽的转染体。根据RIA技术，用人生长激素抗体鉴定这样的转染体。用联合转染技术将能分泌人生长激素的转染体连成细胞系。

例4：表达大鼠生长激素

制备包含为大鼠生长激素编码的重组DNA载体，该载体含金属硫因启动子。

A.将pMMT-neo中的BglⅡ限制内切酶点转换为XhoⅠ切点：

在总体积1，000微升的含氯化钠缓冲液反应液中加入500单位的限制酶BglⅡ酶解200微克的pMMT-neo。首先将6.65千对碱基线性质粒DNA末端变平整。用前述方法，加DNA聚合酶Ⅰ（生成Klenow碎片）和四种dNTP′S在Bgl末端填充，再将其附加到含XhoⅠ限制酶识别区和切点的人工合成DNA连接体片段上（PL Biochemical，Milwaudee，Wisconsin 53205）：

5′-CCTCGAGG-3′

3′-GGAGCTCC-5′

填充反应在总体积30微升反应液中进行，内含2.5微克6.65千对碱基片段，200mM四种dNTP′S，3微升NT-缓冲液，1微升Klenow片段。将混液在室温下温育30分钟。加2微升0.25MEDTA中止反应。用等体积的苯酚/氯仿洗一次，再用等体积的氯仿单独洗一次。通过两次酒精沉淀纯化水相的DNA。将DNA沉淀重悬在10微升10毫摩尔Tris，pH8.0，其浓度为50纳克/微升。

将连接体片段溶在50微升10毫摩尔Tris中，pH8.1，浓度为1微微摩尔/微升。在含2微微摩尔连接体片段，0.5微克6.65千对碱基片段，9单位T₄DNA-连接酶（Boehringer Mannheim公司产品）总体积为20微升混液，再加，30微升2×平整末端连接缓冲液，100毫摩尔ATP，将平整末端的6.65千对碱基片段连接到连接体片段上。连接反应是在15℃进行1小时，再在4℃下过夜。

用该连接混液转化可感受的HB101菌株。将转化细胞涂散在LB-氨苄青霉素琼脂平皿。将能在氨苄青霉素平皿生长的菌落取出，再置于2毫升培养基培养，作为如上述制备质粒的材料。

从12个菌落中取出4个（OK3，OK4，OK11，OK12）经鉴定证实含一个期望大小质粒，鉴定是在用XhoⅠ单独或与BamHⅠ和EcoRⅠ一起酶解后进行的。将OK3和OK11的质粒DNA在HB101中大规模制备质粒。

B.分离含金属硫因启动子和pML载体主链的DNA片段：

用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ分别酶解OK3和OK11各100微克，得到一个带有接近XhoⅠ末端MMT-启动和BamHⅠ末端pML2一部分的5.8千对碱基片段和另一个含SVPAS-t序列的0.85千对碱基的片段。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离各片段。电泳洗脱5.8千对碱基片段，再两次苯酚/氯仿萃取和两次氯仿单独萃取纯化片段，最后两次酒精沉淀。DNA沉淀再重悬到50微升10毫摩尔Tris中，pH8.0。

C.分离含大鼠生长激素基因的DNA片段：

将含为大鼠生长激素基因编码的基因组BamHⅠ插入体（以顺时针方向插入）的质粒pBR322，r GH用BamHⅠ和XhoⅠ酶解。将含其结构基因的基因组BamHⅠ-XhoⅠ片段从0.8%制备性琼脂糖凝胶中分离出来。

D.连接步骤B和C分离出的片段：

将步骤B和C分离片段彼此连接，如将MMT启动子通过其XhoⅠ“粘性”末端直接与结构基因的XhoⅠ“粘性”末端以正确方向连接。

用连接混液转化菌株HB101。取出在LB-氨苄青霉素琼脂平皿上形成110转化体，将其置于2毫升培养基中生长，小量制备质粒。将用BamHⅠ和XhoⅠ酶解所得期望大小两个片段的质粒大量培养，用来转染哺乳动物细胞。

E.将步骤D得到的重组DNA载体引入哺乳动物细胞，建立产生大鼠生长激素的细胞系：

根据标准联合转染技术，用载体pMMT-rGh转染真核宿主细胞（哺乳动物），得到合成大鼠生长激素多肽的转染体。根据RIA技术用大鼠生长激素的抗体鉴定这种转染体。用常规技术将分泌大鼠生长激素的转染体建成细胞系。

虽然引用了一系列实施例叙述本发明，本领域专业人员都认识到在不超出本发明的构思和范围内，形式和细节上的改变都被认为在本发明之中。

Claims

1、一种重组DNA载体，该载体包括：

一种编码Pre S₁-Pre S₂-S编码区的DNA序列；和金属硫因基因的启动子。

2、权利要求1的载体，其中所述的金属硫因基因启动子是掺入到包括DNA序列的载体中取代或不取代天然启动子，优选的是在紧靠Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区的上游处掺入。

3、权利要求1的载体，该载体进一步包括选择识别物，优选抗药识别物，如新霉素抗性基因，和/或转录终止位点，如SV40终止位点或小鼠珠蛋白基因的DEF区。

4、权利要求1的载体，该载体不含任何病毒基因碎片和/或不是致癌性的。

5、一种重组DNA多联体，该多联体包括权利要求1的载体作为第一载体和至少一种附加载体，该附加的载体包括下述编码区中的一种：Pre S₁- Pre S₂- S蛋白编码区，Pre S₂- S蛋白编码区或S蛋白编码区，和金属硫因基因的启动子。

6、权利要求5的多联体，其中的金属硫因基因启动子掺入到附加的载体之中，并且优选在紧靠Pre S₁- Pre S₂- S蛋白编码区的上游处掺入。

7、权利要求5的多联体，其中第一和/或附加载体包括转录终止位点，如小鼠珠蛋白基因的DEF区，以及/或选择识别物。

8、权利要求5的多联体，其中的DNA载体不含病毒碎片。

9、一种被转染的真核细胞，该细胞是被权利要求1至4中任一权利要求的重组DNA载体或权利要求5至8中任一权利要求的多联体转染的。

10、一种被联合转染的真核细胞，使用的被称作第一重组DNA载体的是权利要求1至4的重组DNA载体，和第二重组DNA载体，第二重组DNA载体包括Pre S₂-S蛋白编码区或S蛋白编码区和金属硫因基因的启动子。

11、一种被联合转染的真核细胞，其中使用权利要求1至4的重组DNA载体，被称为第一重组DNA载体，第二重组DNA载体包括Pre S₂-S蛋白编码区，第三重组DNA载体包括金属硫因基因的启动子和选择识别物，第三载体中的金属硫因基因启动子优选定位于紧靠选择识别物的上游处。

12、权利要求10或11的细胞，其中的金属硫因基因启动子掺入到第二载体中并且优选定位于紧靠Pre S₂-S蛋白编码区的上游处。

13、权利要求10或11的细胞，其中的第二和/或第三载体包括转录终止位点如小鼠珠蛋白基因的DEF区，和/或其中的第二载体包括选择识别物。

14、权利要求10或11的细胞，其中的第二和/或第三DNA载体不含病毒DNA碎片。

15、权利要求10或11的细胞，其中的DNA载体包括不同的选择识别物。

16、权利要求11的细胞，其中的第一，第二和/或第三载体包括复制子。

17、权利要求9至16中任何一项所述的细胞，其中的真核细胞是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢细胞，vero细胞，L-细胞，小鼠成纤维细胞和大鼠成纤维细胞。

18、一种制备权利要求9的真核细胞的方法，该方法包括：

用权利要求1至4中任何一项所述的重组DNA载体或权利要求5至8中任何一项所述的多联体转染真核细胞。

19、制备权利要求10的真核细胞的方法，该方法包括：

用权利要求1至4中任何一项所述的重组DNA载体或权利要求10和12至15中任何一项所述的第二重组DNA载体联合转染真核细胞。

20、制备权利要求11的真核细胞的方法，该方法包括：

用权利要求1至4中任何一项所述的重组DNA载体和权利要求11至16中任何一项所限定的第二和第三重组DNA载体联合转染真核细胞。

21、权利要求20所述的方法，其中的DNA载体以成双结合的形式转染，或一起联合转染，或以一系列步骤转染。

22、一种用重组DNA技术制备的颗粒，它包括至少一种由整个Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区所编码的蛋白质。

23、权利要求22的颗粒，它含有至少一种与Pre S₁- Pre S₂-S编码区所编码之多肽相对应的蛋白质，优选糖基化的和不含病毒成分的多肽。

24、权利要求22的颗粒，其中的颗粒衍生自不含血清的来源。

25、一种制备颗粒的方法，该颗粒包括有由乙型肝炎表面抗原的Pre S₁- Pre S₂-S编码区所编码的蛋白质，其中至少一种这样的蛋白与由整个Pre S₁- Pre S₂-S编码区所编码之多肽相对应，该方法包括：

a.在使宿主细胞表达该颗粒的培养基条件下培养权利要求9至17中任何一项所述的转染的或联合转染的宿主细胞;和

b.分离这样的颗粒。

26、权利要求25的方法，其中向培养基中加入重金属如镉和锌或类固醇激素如地塞米松以诱导金属硫因基因启动子。

27、权利要求25的方法，其中的颗粒从宿主细胞培养物的溶胞物中分离出。

28、一种检测乙型肝炎病毒感染的方法，该方法包括：

对人血清样品用权利要求22至24中任何一项所述的颗粒进行免疫分析，定性测定所存在的抗体量，并将其数值与已知标准相比较。

29、制备人抗乙型肝炎病毒感染疫苗的方法，该方法包括：

将免疫防护量的权利要求22至24中任何一项所述的颗粒与常规的载体物质结合。

30、制备人抗乙型肝炎病毒感染疫苗的方法，该方法包括：

将多肽由权利要求22至24中任何一项所述的颗粒上解离下来;并将该多肽重新结合到液泡上。

31、测定哺乳动物血清样品中乙型肝炎表面抗原Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区所编码之蛋白质的抗体的方法，该方法包括：

a.将由权利要求22至24中任何一项所述的未标记颗粒所包被的固相底物与样品相接触;

b.温育并冲洗所述的接触过的样品;

c.将所述的接触过的样品与权利要求22至24中任何一项所述的标记过的颗粒相接触，从而产生标记接触样品;

d.温育并冲洗所述的标记接触样品;

e.测定标记接触样品中标记颗粒的含量。

32、测定哺乳动物血清样品中由Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区所编码的蛋白质的方法，该方法包括：

a.产生包括抗体的组合物，该抗体是由包括权利要求22至24中任何一项所述颗粒的免疫原所产生的;

b.将样品与第一部分组合物及标记的免疫原相接触，温育并冲洗该第一部分;

c.将不含抗原的对照物与第二部分组合物和标记的免疫原相接触，温育并冲洗该第二部分;

d.向上述步骤b和c中所述的组合物中加入等量的葡萄球菌所携带的蛋白质A，温育这些组合物并将液体与固体相分离;

e.对步骤d中所获的各种组合物均测定其标记免疫原的含量。

33、测定哺乳动物血清样品中Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区所编码之蛋白质的抗体的鉴别药盒，其中包括：

a.附着于固相支持物上的权利要求22至24中任何一项所述的颗粒的未标记蛋白;

b.用人Ig G或Ig M标记的抗体。

34、测定哺乳动物血清样品中Pre S₁-Pre S₂-S蛋白编码区所编码之蛋白质的鉴别药盒，其中包括：

a.附着于固量支持物上的由权利要求22至24中任何一项所述的颗粒产生的抗体;

b.由权利要求22至24中任何一项所述颗粒产生的，并经过标记的抗体。

35、测定HBV感染动物血清中含有Pre S₁- Pre S₂-S蛋白编码区所编码蛋白质的HBV抗原的方法，该方法包括：

a.对其上含有结合位点的固相底物提供权利要求22至24中任何一项所述颗粒之抗体;

b.冲洗包被的珠粒以去除多余的抗体;

c.将该珠粒与含蛋白质溶液相接触以减少非特异性结合;

d.冲洗该珠粒以除去多余的含蛋白溶液;

e.将该珠粒与悬浮有HBV或HBV表面抗原的血清样品相接触;

f.用混有标记抗体的溶液冲洗该珠粒;

g.测定标记抗体的含量。

36、在给定样品中测定HBV表面抗原蛋白之Pre S₁-Pre S₂-S区的抗体的方法，该方法包括：

用其上含有结合位点的固体底物吸附权利要求22至24中任何一项所述的颗粒;

将该底物与一种物质相接触以饱和其上的非特异性结合位点;

用缓冲溶液冲洗底物并除去缓冲液;

向底物添加样品;

温育并冲洗含底物的样品;向底物加入用人Ig G或Ig M标记的抗体;

温育并冲洗该底物;

测定标记抗体的含量。

37、根据权利要求1至4中任何一项所述的重组DNA载体，其中包括：

金属硫因基因的启动子，用编码不同的有用基因产物的DNA序列取代编码Pre S- Pre S-S编码区的DNA序列，和另外的非病毒DNA。

38、权利要求37的载体，其中的DNA序列编码生长激素。

39、用权利要求37或38中任何一项所述的重组载体转染的真核细胞。

40、制备由权利要求37至39中任何一项所述的功能性DNA序列所编码之蛋白质的方法，该方法包括：

a.在宿主细胞能表达该颗粒的培养条件下来培养具有相关DNA序列的转染宿主细胞;

b.分离这样的颗粒。