JPS62236493A - ＨＢウイルスのＰｒｅ Ｓ領域を含むＨＢｓＡｇの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞に作用させて形質転換させるのに適し
たＨＢウィルスのＰｒｅ　Ｓ領域（Ｐｒｅ　Ｓ）を含む
Ｂ型肝炎つィ″ルス表面抗原（ｈＢｓＡｇ）遺伝子を組
みこんだ組換えＤＮＡを用いて形質転換を行った動物細
胞によるｐｒｅ　５−ＨＢｓＡｐ蛋白質の製造方法に関
する。

（従来技術） Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は人の肝臓に感染し、肝炎
、肝硬変、肝癌を誘起するウィルスであり、その予防に
は、ＨＢＳＡ（ＩＩのワクチンがもっとも有効であるが
、培養細胞への感染実験が成功していないために、主に
人血清より精製したＨＢＳＡ（Ｊがワクチンの材料とし
て用いられている。最近では、Ｈ８５ＡＧを組換えＤＮ
Ａ技術を用いて、酵母や動物細胞で発現させる方法が試
みられている。　　　　　　　１人血清由来のＨＢｓＡ
ｇ粒子のペプチドはＰ２４（分　　：子量２４，０００
）とＰ２４に糖鎖の付加したＰ２７（分子［２７，００
０）が主であるが、その他にＰ３１（分子量３１，００
０）とＰ３４（分子量３４．０００）が含　　！まれで
いる。このＰ３１とＰ３４にポリマー化人血清アルブミ
ン（ｐＨ３Ａ）と結合する部位すなわち１）ＩＳＡレセ
プターが存在することをマチダら（ＧａＳｔｒＯ−ｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｙ、　８５．２６８−７４．１９８３）
　　が報告し、ＨＢＶ　　　　′。

の向肝性の仮説を提示している。。

ＨＢＶ遺伝子には、Ｐ２４をコードするＨＢＳＡ（ＩＩ
領領域５′側にＰｒｅ　Ｓ領域と呼ばれる部分が存在し
、この領域にはサブタイプによって異なるが、２つない
し３つの翻訳開始コドンＡＴＧが必る。

このうちもっとも３′側のＡＴＧからＨＢｓＡｇ遺伝子
までの領域の５５アミノ酸部分にｐＨ３Ａレセプターが
存在することが指摘されている（マチダら、Ｇａｓｔｒ
ｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ旦９１０〜９１８．１９８４）
。

したがって感染防御ワクチンとしては、Ｐ２４ヤＰ２７
からなるＨＢＳＡＱよりも、Ｐｒｅ　Ｓまで含めたｌＢ
ｓＡｇの方が有効である可能性が考えられる。

ド実、Ｐｒｅ　Ｓ含量の多いＨＢＳＡ（］粒子の方が、
マウスに免疫した場合、免疫原性が高くなることが報５
されている（コーセイジら、Ｌａｎｃｅｔ、　ｉ、　１
１５２−１１ｉ３．１９８５）ａ 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明では、Ｐｒｅ　Ｓ遺伝子領域の中で、ｐｌ（ＳＡ
結）活性を有する最小単位、すなわちＰｒｅ　Ｓ領域の
窮３番目のＡＴＧからＨＢＳＡＯ遺伝子までを含むＨＢ
Ｖ−ＤＮＡの上流に適当なプロモーター及びエンハンサ
−を接続した新規な組換えＤＮＡを作成し、このＤＮＡ
を所望の形質転換細胞を用いることにより、人血清由来
のＨＢｓＡｇ蛋白質と同等か、それ以上の免疫学的活性
を有するＨＢＳＡＩ；１粒子を産主することを見い出し
、本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の組換えＤＮＡ及び形質転換細胞の製造方法、及
び形質転換細胞によるｐｒｅ　５−ＨＢＳＡＯ蛋白質の
生産についてさらに詳細に説明する。

（１）　Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ蛋白質の発現組換えＤ
ＮＡの調製 本発明で用いられる発現ベクターの一態様はｐｓＶ−Ｇ
２（図１〉であり、これはＳＶ４０ウィルスのエンハン
サ−（Ｓ　Ｖ　＋Ｏｅｎｈａｎｃｅｒ）、プロモーター
（ＳＶ４０　　ｅａｒｌｙｐｒｏｍｏｔｅｒ＞、スプラ
イシングジャンクション（Ｓ−Ｊ）、ポリＡシグナル（
ＳＶ４０　　ｐｏｌｙ−Ａ）を有し、動物細胞内で有用
物質を発現させるのに必要な要素を含んでいる。このベ
クターのスプライシングジャンクションとポリＡシグナ
ルの間にＰｒｅＳ−１１ＢｓＡ（ｌ遺伝子を正方向に挿
入し、動物細胞に導入することによって、Ｐｒｅ　Ｓ−
ＨＢｓＡｇを発現ざぜることが可能である。Ｐｒｅ　Ｓ
−ＨＢｓＡｇ　”４伝子のうち、ｐＨ３Ａ結合活性を有
するＰｒｅ　Ｓ領域の第３番目のＡＴＧからＨＢｓＡｇ
遺伝子までの７ラグメントを切り出し、該フラグメント
を発現ベクターｐｓｖＧ２に接続したｐｓＶ−３ｒｄを
調製する（図１）。このほかにも、プロモーターとエン
ハンサ−の組み合わせとして、図３に示したプラスミド
、　ｐＳＨｌ、ＤＳＨ２，ｐＳＨ３も好適に用いられる
。つまりＳＶ４０のエンハンサ−とＨＢＶのプロモータ
ー、ＨＢＶのエンハンサ−とＳＶ４０のプロモーター、
ＳＶ＜ＯのＬンハンサービＳＶ侶ρの７０ロモーターが
。

ルＪ−ｉ、′″！ａＺ、　Ｌ％　ＰｒｅＳ４ｑｘ”Ｑｔ
＞’４２番ｎｔ　（＜　＋２　’ｔ−３番Ｒａ　Ａ丁ｑ
　４〜＞　ＨＢｓＡ、７４１Ｌ’ｒ−Ａｚ−リフラグメ
ンＥ！用爪１（す・１用τ・′ヲ３゜（Ｊｌイリ （２）動物細胞の形質転換 宿主細胞としては、好適にはチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞が用いられる。培養液は１０％胎仔牛
血清を含むハムのＦ−１２培地（ギブコ社製）を用いる
。組換えＤＮＡの細胞への導入方法は、リン酸カルシウ
ム沈澱法（ストレインら、ＢｉＯＣｈｅｍ、　Ｊ、　、
　２１８．４７５−４８２．１９８４）が行われる。水
洗では、組換えＤＮＡを含む、リン酸緩衝液に塩化カル
シウム溶液を滴下することによって、ＤＮＡリン酸カル
シウムの微小沈澱を形成させ、その微小沈澱を細胞に吸
着させ、細胞内にとりこませる方法である。ｐｒｅ　５
−ＨＢＳＡＱ遺伝子が発現している細胞を選択するため
には、同時に薬剤耐性遺伝子を導入して、薬剤耐性株を
選択する方法が用いられる（スブラマニら、Ａｒａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１３５．１−１５．１９８３　）　
。本発明では、動物細胞内でＧ−４１８に耐性を示すＮ
ｅ０ｒ遺伝子（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　　３−
−　　ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｒａｎｓｒｅｒａｓｅ　ｎ　
）を用いる。Ｎｅｏ　　Ｍ伝子発現プラスミドは、Ｐｒ
ｅ　５−ＨＢＳＡ（Ｊの発現と同様、ＳＶ４０のプロモ
ーター、スプライシングジャンクション、ポリＡ付加シ
グナルを有するベクターにＮｅｏ　　遺伝子を接続した
ｐＳＶ−ＮＥＯを用いる（図２）、　ｐＳＶ−３ｒｄと
ｐｓｖ−ＮＥＯをモル比１００　：　１の割合でコトラ
ンスフエクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　
）すると、Ｇ−４１８耐性株には、ｐｓｖ−３ｒｄもく
みこまれている確率が高く、ｐｒｅ　Ｓ−１１ＢｓＡ（
Ｊ蛋白質を発現する頻度が高い。すなわら、Ｇ−４１８
耐性株を選択することによってＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ
蛋白質発現細胞を得ることができる。動物細胞としても
、その他正常肝細胞も好適に用いられる。

例えばｃｈａｎａ　１ｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　（チャン肝
細胞ＡＴＣ示される。

（３）　Ｐｒｅ　５−ＨＢＳＡ（Ｊ蛋白質の生産動物細
胞への組換えＤＮＡの導入により、形質転換細胞を選択
し、培養することにより、培養液中にＨＢＳＡｇが放出
される細胞株が得られる。

ｔ（ＢｓＡｇ陽性細胞は、ｐＨ３Ａ結合活性も有してお
り、人血清由来のＨＢＳＡ（Ｉｔと同等あるいは、それ
以上の免疫原性を有していることが期待され、ＨＢＶワ
クチンとして利用し得る。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げ、本発明の組換えＤＮＡ形質転換細
胞、Ｐｒｅ　５−ＨＢＳＡＩＪ蛋白質の生産について具
体的に説明する。

実施例１ （１）ｐｓｖ−３ｒｄ組換えＤＮＡの作製Ｐｒｅ　Ｓ−
ＨＢｓＡｇ構造遺伝子全体がｐＢＲ３２２の旧ｎｄ［ｌ
サイトに挿入されているプラスミドｐＰＳ４１１から、
ｐｒｅ　ｓ領域の３番目（７）ＡＴＧからＨＢｓＡｇ　
遺伝子領域までを含んだ１．２ＫｂｐフラグメントをＨ
ｓｔ　ＩＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩにより切り出し、動物細
胞発現ベクター１）ＳＶＧ２のＥｃｏＲＩサイトに正方
向に挿入したプラスミドｐＳＶ−３ｒｄを作製する。

ｐＰＳ４１１　１０μ９を）ｌｓｔＩＩ　　１２Ｕ。

ＨｉｎｄＩ［Ｉ　１２　Ｕで３７℃５時間反応させ、フ
ェノール抽出を２回行い、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収する。このＤＮＡは４０ＴｒＬＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，２＞　、８７７？、Ｍ硫酸マグネシウム、
８０μＭジチオスレイトール、２ｍＭｄＮＴＰ存在下、
ＤＮＡポリメラーゼエクリノウフラグメントＩＯＵによ
り室温で３０分反応させ、突出末端を平滑末端にし、ざ
らに５０７７ＬＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，２＞で牛
小腸由来アルカリホスファターゼ１Ｕにより３７℃１時
間反応し、５′末端を脱リン酸化したのち、クロロホル
ム、フェノール抽出を２回行いエタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収する。このＤＮＡ４μ９に６６ＴｒＬＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６＞６．６７７１Ｍ塩化マグネ
シウム、１０ｍＭジチオスレイトール、１．０ｍ、Ｍ　
　ＡＴＰ、ＥｃｏＲＩリンカ−（ｐＧＧＡＡ丁ＴＣＣ）
　２μＪ存在下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ５．６Ｕを１６°
Ｃ−晩反応させ、ＥｃｏＲニリンカーを接続する。この
ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、ＥｃｏＲＩ　５
０　Ｕで３７℃５時間反応させ、０．８％低融点ゲル電
気泳動を行い、１．２Ｋｂｐフラグメントをゲルから切
り出し、フェノール抽出を２回行い、エタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収する。

ＳＶ？−０のエンハンサ−、プロモーター、スプライシ
ングジャンクション、ＳＶ４０のポリＡシグナルを有す
る動物細胞発現ベクターｐＳＶＧ２のＥｃｏＲｌサイト
に、ＥｃｏＲＩリンカ−の接続したＰｒｅ　Ｓ−１＋Ｂ
ｓＡ（］　１　、２Ｋｂｌ）フラグメントを挿入スル。

ｐＳＶＧ２３μ９をＥｃＯＲｌｌｏｕで３７°Ｃ６時間
反応させ、ざらに５０ＴｒＬＭトリス塩酸（ｐＨ８，２
＞緩衝液中で、牛小腸由来アルカリフォスファターゼ２
０Ｕで３７°Ｃ１時間反応させ、５′末端を脱リン酸化
した後、０．８％低融点ゲル電気泳動を行う。泳動後、
フラグメントを切り出し、フェノール抽出２回、エタノ
ール沈澱によりＤＮＡを回収する。ＥＣＯＲＩ消化ｐＳ
ＶＧ２１μ９とＰｒｅ　５−ＨＢｓＡ（］　１　、　２
ｋｂｐフラグメント０．５μ９を６６ＴｒＬＭトリス塩
酸緩衝液（ＰＨ７，６）、６．６ＴｒＬＭ塩化マグネシ
ウム、１０７１１？、Ｍジチオスレイトール、１．０７
７ＬＭＡＴＰ反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ８．４Ｕ
により１６°Ｃ−晩反応させ、大腸菌ＨＢＩＯ１に形質
転換し、アンピシリン耐性形質転換体を得る。形質転換
体のなかから、ＥｃｏＲＩ　、ＢａｍＨＩ　、Ｓａ、Ｉ
Ｊ　■＋Ｘｂａ　Ｉの切断パターンを分析することによ
り、Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇフラグメントが正方向に入
ったｐｓｖ−３ｒｄを得る。

（２）動物細胞の形質転換 ＣＨＯ細胞の形質転換は、リン酸カルシウム沈澱法によ
り行う。２倍濃度のへペス緩衝液（２ｘＨＢＳ＞　　１
０ｙ／、１１　へベス（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジン−Ｎ−−２−エタンスルホン酸＞６ｇ／ｊＪ
ＮａＣＬ　　ＰＨ７，１にＡ１００μ、１１．組み換え
ＤＮＡ　［１）ＳＶ　−３ｒｄ　１０μ９．ｐｓＶ−Ｎ
Ｅ○（図２＞０．１μｇ１１００μｍをチューブに加え
、滅菌水で全ｔｉ４．７ｄにしたＢ液を調製する。この
Ｂ液にＡ液（２Ｍ　　ｃ６−ｃｌｔ）　　３００μｐを
加える。

Ｂ液に空気を送りながら攪拌し、Ａ液をゆっくり滴下す
る。Ａ液を加え終った後、１〜２分空気を送りつづけ、
均質な沈澱を形成させ、１０分間静置する。ＣＨＯ細胞
は、トランスフェクションの前日に、１００ｍシャーレ
に５Ｘ１０５個まき、２４時間ＣＯ２インキュベーター
で培養する。培養液は１０％胎仔牛血清を含むハム９Ｆ
−１２培地を用いる。この培養シャーレに、微小沈澱液
１ｄを滴下し、均一に拡散させる。

１０分間の静置により、ＤＮＡ−リン酸カルシウム微小
沈澱を細胞に吸着させた後、再びＣＯ，Ｓインキュベー
ターで培養する。トランスフェクションの１８時間後に
、培地交換を行い、さらに４８時間後Ｇ−４１８含有培
地と交換する。

Ｇ−４１８の濃度は４００μＪ／威である。Ｇ−４１８
含有培地で生育した集落をシリンダー法で分離し、Ｇ−
４１８耐性形質転換細胞を得る。

（３）　Ｐｒｅ　５−ＨＢｓＡ（］の生産上記のＧ−４
１８耐性細胞の培養液中のＨＢｓＡｑ活性をＲＰＨＡ法
（アンティへブセル：ミドリ十宇製）及びＥＩＡ法（オ
ースザイム■、ダイナボット社製）により検討した。Ｇ
−４１８耐性株のなかから、ＨＢＳＡ（］陽性株が高頻
度に得られる。さらに１）Ｈ３Ａ結合活性を１）Ｈ３Ａ
のＤＮＡ法（レンケイら、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）ｌｅｔ
ｈｏｄｓ、１６．２３−３０．１９７７）により検討し
、ＨＢｓＡｇ陽性細胞上清にｐＨ３Ａ結合活性が認めら
れ、Ｐｒｅ　Ｓ領域が発現していることを、確認した。

この上清を塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いて精
製した。この精製サンプルをＳＤＳ　ＰＡＧＥによって
分子量を求めたところ約３５．０００．約２７．０００
．約２４．０００の３本のバンドを確認した。このこと
により形質転換した細胞がＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇペプ
タイドを産生じていることを確認した。なお本発明で得
られたＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの粒子を電子顕微鏡で観
察したところ直径約２２ｎｍの球形粒子であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＳＶ４０エンハンサ−とＳＶ４０プロモーター
を担持するＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ産生用のプラスミド
の作成を説明する図、第２図は、二にう〉スフエクショ
ンに用いた選択プラスミドｐＳＶ−ＮＥＯの制限酵素地
図、第３図はｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ産生用プラスミド
の具体例の制限酵素地図と作成法。 符号の説明 ］、Ａｐ　ｒ　＝＝ファンシリン耐性遺伝子２．０ＩＰ
＝牛小腸由来アルカリホスフアターゼ ３．５−Ｊ＝スプライシングジャンクション４、Ｎｅｏ
＝ネオマイシン耐性遺伝子 ５．３Ｖ４０Ｆ）ＯＩＶ−Ａ＝ＳＶ４０のポリＡ付加シ
グナル （以下余白） ＳＶ４０エンハノサ− 手続ネＦ）ｉ　、ｌＩＥ書 昭和６１年　６月２６日 昭和６１年特許願第７９０８６号 名称　株式会社ミドリ十字 ６、　補正により増加する発明の数二　〇７、　補正の
対象二　図　面 ８、　補正の内容： 適正に描いた第３図（別紙の通り）。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロモーターとしてＳＶ４０又はＨＢＶ、エンハ
   ンサーとしてＳＶ４０又はＨＢＶ、宿主としてＣＨＯ細
   胞又は正常肝細胞を用いてなる形質転換細胞によるＨＢ
   ウィルスのＰｒｅ　Ｓ領域を含むＨＢｓＡｇ（Ｐｒｅ　
   Ｓ−ＨＢｓＡｇ）の製造方法。
2. （２）Ｐｒｅ　Ｓ領域が、該領域の第３ＡＴＧ部位から
   始まる少なくとも５５個のアミノ酸よりなる特許請求の
   範囲第（１）項記載のＰｒｅ　Ｓ−ＨＭＢｓＡｇの製造
   方法。
3. （３）５５個のアミノ酸が、以下の配列よりなる特許請
   求の範囲第（２）項記載のＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製
   造方法。 【アミノ酸配列があります】
4. （４）ＨＢｓＡｇがａｄｙｗ型である特許請求の範囲第
   （１）項または第（２）項または第（３）項記載のＰｒ
   ｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法。
5. （５）ＳＶ４０プロモーター、ＨＢＶエンハンサー、チ
   ャン肝細胞（ｃｈａｎｇ　ｌｉｖｅｒ　Ｃｅｌｌ）もし
   くはチンパンジー肝細胞（ｃｈｉｍｐ　ｌｉｖｅｒ　ｃ
   ｅｌｌ）の組み合せよりなる特許請求の範囲第（１）項
   記載のｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法。
6. （６）ＨＢＶプロモーター、ＳＶ４０エンハンサー、Ｃ
   ＨＯ細胞もしくはチャン肝細胞（ｃｈａ−ｎｇ　ｌｉｖ
   ｅｒ　ｃｅｌｌ）、もしくはチンパンジー肝細胞（Ｃｈ
   ｉｍｐ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ）の組み合せよりなる特
   許請求の範囲第（１）項記載のＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ
   の製造方法。
7. （７）ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０エンハンサー、
   チャン肝細胞（ｃｈａｎｇ　ｌｉｖｅｒ　Ｃｅｌｌ）も
   しくはチンパンジー肝細胞（ｃｈｉｍｐ　ｌｉｖｅｒ　
   ｃｅｌｌ）の組み合せよりなる特許請求の範囲第（１）
   又は第２項項記載のＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ）製造方法
   。