CN1058525C - 表达乙肝病毒表面抗原中蛋白的转基因哺乳动物细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含乙肝病毒表面抗原中蛋白(Pre2+S)基因的重组质粒PSV2DHBWS2S和含有该质粒并能高效分泌乙肝病毒表面抗原中蛋白的哺乳动物细胞系MX，在本发明的质粒结构中，二氢叶酸还原酶基因及乙肝病毒表面抗原PreS2+S基因分别受SV40早期启动子的调控，用该质粒转化的CHO-dhfr细胞能高效分泌乙肝病毒表面抗原。

Description

表达乙肝病毒表面抗原中蛋白的转基因哺乳动物细胞系

本发明涉及一种含有编码乙肝病毒表面抗原中蛋白(PreS2+S)的DNA的表达质粒，用所说表达质粒转化的哺乳动物细胞系以及培养所说的转化体高效表达乙肝表面抗原中蛋白。

乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常见病因，我国是乙型肝炎高发区，有50-70％的人群感染过HBV，8-10％的人群(约1亿人)为带毒者，目前还没有治疗乙肝的有效方法，接种乙肝疫苗是预防肝炎的有效措施。

血源疫苗国内外已投入生产使用，但不能满足普遍的预防接种，由于血源疫苗存在着一些问题，如血源有限，带有肯定的潜在性危险(如丙肝，艾滋病毒等)，为此需要急切研制乙肝基因工程疫苗，国内外对乙肝基因工程疫苗的研究得到较快的发展，美国的MSD公司应用酵母系统生产乙肝基因工程疫苗已获准生产许可证，我国用哺乳动物细胞生产的乙肝基因工程疫苗也获准生产，它们和血源疫苗一样，是由乙肝表面抗原的主蛋白组成。

近来的研究表明，HBV的PreS-S2(前S2)区域中蛋白特异性决定簇比S区更为丰富，中蛋白免疫能激刺T细胞的功能，PreS2抗体出现早于S抗体，并具有保护野毒攻击的作用，这进一步表明中蛋白在免疫中有着重要作用。

1984年M.L.Michel报导[1]，用ay亚型的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白构建重组质粒(PSVSdhfr9.1kb)。

其特点是：乙肝表面抗原大蛋白受SV40早期启动子的调控，而dhfr(二氢叶酸还原酶)基因受MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)启动子的调控。

表达系统，他们采用二氢叶酸还原酶阴性的中国地鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)，作为其表达系统经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳显出22 KD 26KD的主蛋白及34KD的中蛋白条带，未显出大蛋白条带。

用AUSRIA II试剂盒测细胞培养液中蛋白表达量＝1ug/10⁶细胞/每天。

T.Lee等人[2]用HBV(adr亚型)2.8kb的Bgl II片段插到PSV2-dhfr载体质粒的Bgl II-BamH I位点构建质粒，其中HBsAg基因的转录方向与SV40早期启动子方向相反，用构建的重组质粒转化CHO细胞，其表达产物HBsAg表达量平均为1ug/10⁷cell/每天。

蛋白印迹实验：用PreS1及PreS2单克隆抗体时分别测出40KD的PreS1及33kd，36kd的PreS2带。

1986 yasuaki Itoh and yukio Fujisaua等人[3]

质粒构建：用adr型乙肝表面抗原中蛋白(此中蛋白是经修饰即去掉第Ser⁴⁴-Thr⁴⁹ 6个氨基酸，同时在氨基端增加了人工合成的三个氨基酸残基)构建成10.8kb的pGLDP31-RC重组质粒。

该质粒是由GLD启动子(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶启动子)下游连接乙肝表面抗原修饰后的中蛋白，PBR322片段(含氨卞抗性基因及复制起点)，酵母菌的ars1(自主复制系列)、LEU2(亮氨酸基因)及LR(反向重复序列)所构成。

表达系统：酵母

表达产物的检测：

1)经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳显示出34kd，37kd的中蛋白条

  带。

2)镜下观察到20nm颗粒。

1986年P.Dehoux et al等报导[4]

质粒构建：将ayw亚型HBV大蛋白1312bp的Bgl II-Bgl II片段插到含有PHO5启动子的酵母载体质粒PPV2的Hind III位点，其下游有URA3基因(转录终止信号)构成PPV2/S55重组质粒。

该质粒的特点是：乙肝表面抗原大蛋白基因在PHO5(强的酵母启动子)调控下。

表达系统：酵母。

表达的蛋白产物，免疫沉淀后，经聚丙烯酰氨凝胶电泳电显出39KD的带条。蛋白分泌量为25ug/L(0.1-0.2ug/ml总蛋白)。

T.Yoneyana et al等报导[5]

1.质粒构建：用HBV(adr亚型)表面抗原2.8kb Bgl II片段(含

  PreS1，S2+S基因)插到PdBpv-MMt neo的BamHI的位点。

  该质粒含有：BPV DNA(牛乳头瘤病毒)载体，PML 2

  DNA，SV40剪接位点及多聚腺苷位点，小鼠摄金蛋白启

  动子和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。

2.表达系统：小鼠C127细胞

3.表达产物检测：

1)电镜下观察到22-27nm颗粒。

2)SDS-PAGE电泳：显示22kd 26kd和35kd的蛋白带，无大

  蛋白带。

3)细胞的免疫荧光：用HBsAg的免血清及PreS2单克隆抗体

  分别测出HBsAg及PreS2抗原，用PreS1单抗未测出PreS1

  抗原。

L.Kutinova等人报导[6]的质粒构建：包括用完整的前S2+S基因，插到含有痘苗TK的PGS20载体质粒P1.4HEP，该质粒特点是HBsAg抗原PreS2+S基因在痘苗病毒7.5k启动子调控下。

蛋白分泌量的检测：

HBsAg Elisa滴度为HBsAg 24-34；PreS2 161。

M.W.Yu et al[7]报导用表面抗原PreS2+S基因插到大肠杆菌表达载体pTrpLE质粒，构成PLE PreS2质粒。

表达产物是融合蛋白。

上述介绍的含乙肝病毒表面抗原前S基因的重组DNA质粒的构建及其表达产物的生物学活性的研究中，或因表达载体的构建不佳或因表达系统的选择不利，因而都不能高效生产出免疫原性好的抗原，其中表达系统选择的局限表现为：用大肠杆菌为表达系统，其得到表达往往是融合蛋白，由于表达水平低，产物不稳定，而未获成功；以痘苗为载体表达乙肝表面抗原，最初是用此载体研制亚单位疫苗，虽然有成功的报导，但由于不适于大规模的生产，给广泛使用前景带来困难，现进一步用此载体来研制含乙肝表面抗原的重组病毒活疫苗；酵母是一个较好的表达系，但有其不足之处。

1)酵母表达的乙肝表面抗原不能分泌，给分离纯化带来许多

  困难。

2)HBsAg中蛋白在酵母系统中过度糖基化而且稳定性差，影

  响其免疫原性；用哺乳动物细胞C127，小鼠LTK^-及小鼠3T3

  细胞作为表达系统，虽有获得乙肝表面抗原的表达的报导，

  但上述细胞不是世界卫生组织认可的用于基因工程疫苗生

  产的哺乳动物细胞

要想获得更好的基因工程苗需从二方面考虑，一是高效表达质粒的构建，二是表达系统的选择，为此我们构建了含乙肝表面抗原PreS2+S中蛋白质粒pSV2DHBWS2S，本质粒的结构明显地不同于现有报导的PreS的质粒，并选用哺乳动物细胞作为表达系统，目的是为进一步研制免疫性好，表达量高的乙肝基因工程疫苗奠定基础。

在本发明的实施方案中，我们采用的是乙肝表面抗原完整的中蛋白结构(2.0kb的Saul-Bgl II片段)，乙肝表面抗原中蛋白是具有丰富的抗原决定簇，免疫原性好，能与人多聚白蛋白结合，又能分泌的区域，采用的HBV adw亚型，这是我国南方流行的重要亚型，南方又是乙型肝炎的高发区，所采用的启动子也与上述文献报道不同，即我们采用二个SV40早期启动子，SV40早期启动子是较强的启动子，SV40的DNA复制起点和早期启动子区域中含有72个核苷酸的重复序列能强化邻近的基因的表达[8、9]。

质粒结构中的dhfr基因在前，乙肝表面抗原基因在后，而且我们构建的与Michel等所构的质粒正好相反。

其优点是：dhfr基因是一个扩增基因，由于它的扩增而带动下游的HBsAg基因扩增，从而增强基因HBsAg的表达。

此外用哺乳动物细胞即缺失二氢叶酸还原酶基因的中国地鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)，为表达系统是较理想的细胞系，哺乳动物细胞表达的外源基因产物较原核及酵母系统更接近于天然，哺乳动物细胞系具有更适于大规模连续培养的优势。

下面对本发明进行详细说明。(一)含乙肝表面抗原中蛋白重组质粒

质粒构建：

PSVDHBW-1质粒(adw亚型)[12]经Hind III及Saul酶切后回收6.3kb大片段，Klenow酶补平，T4DNA酶连接构成中间质粒PSVHBWS2S再用Bgl II及PVU II酶切后制取2.3kb片段，插入载体质粒PSV2dhfr(美国梁伟材教授赠)的Bgl II位点处构成PSV2DHBWS2S，该重组质粒的特点是HBV PreS2+S基因及二氢叶酸还原酶(dhfr)酶基因分别置于SV40早期启动子调控下，见图1。图1说明本发明的重组质粒PSV2DHBWS2S的构建方法。

乙肝病毒adw亚型的序列见图2。(二)转基因细胞系MX

MX细胞系的筛选：将重组质粒DNA 15ug和等量的鲑鱼精子DNA按常规沉淀技术[10，11]加到约80％成片的CHO-dhfr^-细胞(该细胞是美国哥伦比亚大学Chasin教授惠赠)瓶中，8小时后第一次换生长液(含次黄嘌呤和胸苷)，2天后消化稀释(此时生长液不再加次黄嘌呤和胸苷)，于CO₂孵箱中培养约2周，待单个细胞集落出现时，挑单细胞集落于96孔板，增殖后依次逐渐转到24孔板及方瓶，逐渐加MTX(氨甲喋呤)其浓度由1×10^-7到5×10^-6M以此筛出高效分泌HBsAg阳性的克隆细胞系。(三)表达产物检测：

1.HBsAg的表达量：反相血凝滴度为64-128；放射免疫(RIA)

  为2248-2558ng/ml。

PreS2表达量：反相血凝为：128-192

             酶联免疫试验：(Elisa)为160-320

2.初纯品经SDS-PAGE电泳，显出24KD，27KD的主蛋白带

  及33KD，36KD中蛋白带，经蛋白印迹试验证明，中蛋白

  是特异性条带。

3.免疫电镜观察到：22nm大小的颗粒。

4.动物实验：免疫小鼠及家兔后Elisa可测出1∶8 PreS2抗体，

  PreS2抗体产生比S抗体产生早，而S抗体产生较高持续

  时间较长(1∶10稀释的血清其RIA的P/N值为104-190)。

              表1.在MTX加压下转基因细胞HBsAg的表达

                  HBsAg分泌量        增高倍数       前S2的分泌量克隆细胞系  氨甲喋呤

                  反相血凝    放免   (反相血凝)   反相血凝  酶联免疫试验M5            -         1∶4

          10^-6M    1∶64     2248.3    16        1∶128    1∶160M6            -         1∶4

          10^-6M    1∶128    2558.9    32        1∶192    1∶320M9            -         1∶4

          10^-6M    1∶64     2391.3    16        1∶128    1∶160表2 M6细胞分泌乙肝疫苗免疫小鼠后前S2抗体的反应

           Elisa检测前S2抗体的P/N值鼠种

                    血清稀释

              1∶1     1∶2     1∶8CBA               5.1      6.2      2.4C57               5.9      5.0      2.2C3H               5.4      7.0      2.0615               5.0      5.3      2.2NIH               3.8      2.8      2.1Balb/c            4.0      2.1      未做ICR               -        未做DBA/C             -        未做1. M.L.Michel et al(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7708-7712，1984)2. T.Lee，et alArch virol 106：151-158，19893. Yasuaki Itoh and yukio FujisawaBiochemical and Biophysical Research Communications141(3)：942-948，19864. P.Dehoux et alGene 48：155-163，19865. T.Yoneyama et alJ.gen Virol 69：1931-1939，19886. L.Kutinova et alArch Virol.112：181-193，19907. M.W.Yu et alJ.of Medical virology 30：7-13，19908. Fiers.W.R.et alNature 273：113，19789. Banerji J.et alCell 27：299，198110.Wigler M.et alProc.Natl.Acid.Sci USA 76：1373，197911.Wigler M.et alCell 16：777，197912.张一鸣等病毒学报1(3)：32-38，1985

Claims (2)

1.一种含有乙肝病毒adw亚型表面抗原中蛋白PreS2+S基因的重组质粒，其特征是：复制方向是从左至右，其排列顺序是PBR322的复制起点→SV40的复制起点，早期启动子→扩增基因dhfr→SV40的复制起点，早期启动子→乙肝表面抗原中蛋白基团PreS2+S→SV40的多聚A位点；质粒结构中的二氢叶酸还原酶dhfr基因在前，乙肝病毒表面抗原PreS2+S基因在后，它们是分别在SV40早期启动子的调控之下；PreS2+S基因是乙肝病毒表面抗原的SalI-BglII片段。

2.一种分泌乙肝表面抗原中蛋白的细胞系MX，其特征是用权利要求1所述组质粒转化到哺乳动物细胞CHO-dhfr^-中所获得的细胞系。