乙型肝炎病毒是引发人类肝脏疾病主要的传染病毒。许多乙型肝炎患者,经过一个急性阶段后恢复,也有不少人转为慢性,成为慢性肝炎。乙肝病毒携带者在我国多达一亿以上。
普遍接种乙肝疫苗是控制传染的重要措施。血源疫苗是由病人血清中的乙肝表面抗原颗粒分离制成,由于来源困难,成本昂贵,安全性差,发达国家已不再生产。利用基因工程手段,在酵母,哺乳动物细胞,重组痘苗等体系表达乙肝表面S抗原,用作基因工程疫苗,具有更安全,经济,有效的优点,但就其免疫原来讲与血源疫苗基本相同。尚有一些不足之处,如:(1)有10%左右的人群无应答或反应低下。(2)所需用量较大。(3)无法对付免疫逃逸变异株。因此,国外已经在研制高效经济的新型乙肝疫苗。
乙肝表面抗原有三种蛋白组成,主蛋白(S),中蛋白(M),和大蛋白(L),三种蛋白均由HBV中同一个阅读框架的DNA编码,从不同的起始码ATG翻译。M蛋白与S蛋白的区别在M蛋白氨端多55个氨基酸,即前表面抗原2(preS2)区,而L蛋白比M蛋白在氨端又多了108或119个氨基酸,即前表面抗原1(preS1)区。M和L蛋白主要存在于病毒颗粒的外壳。
PreS1区含有与S不同的抗原性。具有T细胞和B细胞的免疫决定簇,其中氨端第21-47的肽段,具有与肝细胞受体结合的位点(Neurath A.R等,Cell 1986,46,429-436)。具有诱导产生中和病毒能力的抗体,从而阻断病毒与肝细胞的结合,以保护机体不受感染。L蛋白还能激活对preS1特异的T细胞,以克服对S蛋白和M蛋白的不反应性。但L蛋白不易从细胞中分泌出来,同时也抑制了S蛋白的分泌。(Persing P.H.等,Science 1986:234,1388)。另外,由于L蛋白上含有多个蛋白酶的敏感位点,易被降解,因此要大量获得L蛋白用作疫苗存在一定困难。
用合成的preS1(21-47)多肽研究证实,该区域含有HBV与肝细胞结合所必需的位点,抗preS1单抗MA18/7和F35.25能有效地抑制HBV与肝细胞的结合,具有中和病毒的能力(Petit M.A等Virology 1990:180,483-491)。免疫猩猩能使其抵制HBV的攻击(Neurath A.R.等Vaccine 1989,7,234-236)。但是,若用合成多肽作疫苗,因免疫原性低,距离实用还有很大距离。
preS2区也含有与S不同的抗原性,preS2(120-132)区含有T细胞免疫的识别位点,preS2(133-143)含有主要的B细胞免疫的识别位点。其中第136-147位的多肽含有肝细胞多聚白蛋白受体结合的位点(Krone B.等Hepatalogy 1990,11,1050-1056)。HBV病毒可能通过与肝脏白蛋白的结合造成对肝细胞的感染。利用合成的具高免疫原性的多肽preS2(120-145)免疫动物产生的抗体也具有中和HBV病毒的作用(Neurath A.R.等Vaccine 19864:35-37)(Milich.D.R.et al.,J.EXP.Med,1986,16:532)。Neurath等和Agata等报道preS2(120-145)很有可能是肝细胞受体的另一个识别位点(NeurathA.R.et al.,Cell,1986,46:429-436;Agata B.et al.,J.Virol.,1995,69,840-848)。用合成多肽作疫苗,免疫原性差,距离实际应用也有距离。但天然的M蛋白也极不稳定,要大量获得也有一定困难。近来研究表明,preS2区含有多个对蛋白酶的敏感位点,以至在制备过程极易被蛋白酶所降解。研究还表明,preS2中的第1-13位和第20-46位两个氨基酸区域(即按preS1序列开始计算的第120-132和139-165)含有利于M蛋白由细胞内分泌到细胞外的穿膜结构(Von Heijne,Eur.J.Biochem 1988,103,431-438)。
近来利用乙肝表面抗原作载体蛋白,成功地将外源基因片段如,人单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1(Valenzuela P.等Bio/Technology 1985,3,323),人免疫缺损病病毒HIV(Michel M.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.198885,7957),脊髓灰质炎病毒Polio(Delpeyroux F.等Science 1986,233,472)插在PreS2区,分别在酵母或哺乳动物细胞中得到表达。
但是,至今还没有在S基因的5′端和3′端同时融合有不同抗原决定簇基因的报道。
本发明的目的在于提供一个能阻断乙肝病毒感染的全新结构的乙肝重组抗原。该新型抗原可通过一个含有乙肝表面抗原S基因与含肝细胞受体结合位点的preS1抗原决定簇基因和同时含有T细胞和B细胞表位的preS2抗原决定簇融合基因的重组痘苗病毒(Vaccinia Virus),稳定地表达并分泌乙肝S表面抗原与preS1,preS2的融合颗粒。颗粒同时具有乙肝HBsAg和preS1及preS2的三重抗原性和预计的良好的免疫原性。本发明可通过一个重组痘苗病毒大量分泌产生HBsAg和preS1及preS2的融合颗粒,经过分离纯化,可制得更为安全、高效的新型基因工程颗粒疫苗,该重组痘苗病毒也可用于制备成新型乙肝活疫苗。
我们采用PCR技术,人工合成了preS1中对应氨基酸第21-47位的核苷酸顺序,去除了可能影响S抗原分泌的preS1氨端的20个氨基酸。在乙肝S表面抗原基因3′端,在对应氨基酸223位与合成的preS1核苷酸片段相融合。
另外,用PCR方法,人工合成了preS2基因对应氨基酸第120-146位的核苷酸顺序,尽可能去除蛋白酶敏感位点,保留了同时含有T细胞和B细胞表位和有利于乙肝S表面抗原分泌的顺序。在乙肝S表面抗原基因5′端,对应氨基酸顺序第1位处与合成的preS2核苷酸片段相融合。获得了含有乙肝表面抗原S基因5′端与preS2(120-146)融合同时在3′端与preS1(21-47)融合的融合基因。通过构建含有该融合基因的重组痘苗病毒,成功地表达了带有HBsAg和preS1和preS2的三重抗原性颗粒。实验证明,这一设计方案,既没有影响乙肝表面抗原颗粒的形成和从细胞的分泌,也不影响HBsAg的抗原性。相反却更有利于从细胞中分泌出来,形成的颗粒同时还带有preS1,preS2的抗原性。
该融合基因也能在哺乳动物细胞(如CHO)、酵母等真核系统中表达,其表达产物的基本性质应和在重组痘苗中的表达产物相同。
本发明提供了将HBsAg主蛋白氨端与preS2抗原决定簇融合,羧端与preS1抗原决定簇融合的新型结构的乙肝表面抗原。该新型抗原可通过组建一个重组痘苗病毒,稳定分泌表达而获得,即HBsAg主蛋白和preS1,preS2蛋白的融合颗粒。具体方法包括:
1.同时含有T细胞和B细胞表位的preS2抗原决定簇对应第(120-146)位的核苷酸片段和S基因的PCR合成及其融合克隆。(pWR/S2S)
2.含肝细胞受体结合位点的preS1抗原决定簇对应(第21-47位)的核苷酸片段的PCR合成并与PWR/S2S融合的克隆。(pWR/S2SS1)
3.含三重融合基因的重组痘苗表达质粒的构建。(pGJP/S2SS1)
4.含乙肝S基因与preS1(21-47),preS2(120-146)基因的重组痘苗病毒的构建与筛选。(vS2SS1)
5.重组痘苗病毒的增殖与带preS1,preS2的乙肝表面抗原的表达和产物的鉴定。(pS2SS1)
本发明优点
天然的含preS1,preS2和S的L蛋白乙肝表面抗原分泌困难,并易被降价,而很难获得。本发明利用基因工程技术构建了含前表面抗原1和2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因,可在重组痘苗,哺乳动物细胞,酵母中表达获得,具有分泌性、颗粒性,同时具有S1、S2和S三重抗原性。实验证明,本发明的设计方案,既没有影响乙肝表面抗原颗粒的形成,并可从细胞直接分泌至培养液中,也不影响HBsAg的抗原性。相反却更有利于从细胞中分泌出来,形成的颗粒同时还带有preS1,preS2的抗原性。
本发明的内容在以下实施例中具体叙述:
材料和方法:
a.基因重组所用的限制酶,连接酶等皆为Boehringer产品。细胞培养基,DMEM/HG高葡萄糖培养液,胎牛血清(FCS)等皆为GIBCO产品。5-溴脱氧尿苷(BUdR)为Fluka产品。PCR用试剂盒和Taq DNA聚合酶为Promega产品。
b.所用胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因缺陷型细胞,human TK-143细胞(由美国NIH B.Moss教授提供),在含25μg/ml BUdR和5%胎牛血清的DMEM培养基中培养。痘苗病毒天坛株(Vaccinia Virus,Tian Tan)和Vero细胞,由卫生部北京生物制品所获得。
c.细胞的转染;Vero细胞经痘苗病毒天坛株感染2小时后用磷酸钙共沉淀的DNA(含10μg质粒和10μg鱼精DNA)转染。37℃培养5小时,吸去转染液,加入新鲜培养液,继续培养48小时后收获细胞。
d.质粒DNA的制备。用碱变性法经Sepharose2B柱层析纯化。
e.质粒的重组和细菌转化。参照Sambrook J.等人的"分子克隆"一书上的常规方法进行,所用受体菌为TG-1。
f. 重组痘苗病毒的筛选和病毒DNA的抽提。痘苗DNA的制备参见文献(Esposto J.等J.Vivol.Meth:1980,2,175)方法进行。TK-重组病毒按照Weir等人的方法(Weir J.P.等,Proc.Natl.Acd.Sci.U.S.A.1982,79,1210),在BUdR存在下选择空斑,并进行分析鉴定。
g.HBsAg,preS1,preS2抗原的测定。HBsAg的测定,用Auszyme药盒(Abbott公司产品)或上海科华实业的检测药盒,样品1∶10稀释。preS1抗原测定,采用本所阿尔法公司的酶联检测试剂盒,用双夹心法,先以抗HBsAg多抗包板,样品1∶10稀释,用preS1(21-47)单抗酶联结合物作用。preS2抗原测定,原理同preS1双夹心法,抗preS2单抗Q19/10包板,用抗HBsAg酶联结合物检测。所用preS2单抗(Q19/10)由德国W.H.Gerlich博士提供。分泌至培养液中的抗原可直接用培养液测定。测定细胞内抗原:细胞经PBS悬浮后,用液氮冻融四次,离心后的上清为冻融细胞裂解液样品,取样进行测定。
h.表达产物的蛋白电泳分析。采用SDS聚丙烯酰胺电泳,参照Laemmli法进行(Laemmli U.K.等,Nature,1970,223,680)。
i.ECL非放射性标记检测用于Southern blot和Western blot。试剂和标记操作方法采用Amersham公司提供的操作步骤进行。
在Western blot分析中所用的一抗,分别是抗HBsAg单抗(H166,德国马普生化所Hofschneider教授提供)1∶300稀释。抗preSl单抗(125E11,上海生化所张祖传教授提供),1∶1000稀释。抗preS2单抗(25-19,德国马普生化所Hofschneider教授提供),1∶6000稀释。
下面分步描述实施的具体步骤:
实施例1 同时含有T细胞和B细胞表位的preS2(120-146)抗原决定簇基因和S基因的PCR合成及其融合克隆构建
选定adr亚型乙肝病毒同时含有T细胞和B细胞表位的preS2抗原决定簇,氨基酸序号第120-146位,用含preS2的重组质粒pADR-1(吴祥甫等,中国科学,B辑,1983,2:162-167)作模板,用PCR法扩增了含有第120-146位的preS2 DNA片段。所用5′端引物为:
5′GTCATCCTGGATCCATGCAGTG3′
BamHⅠ
共长22个核苷酸,其中划线部分为在preS2 5′端设计引入的一个BamHⅠ酶切位点。3′端引物为:
5′GTCCCGGCCATGGAGCCACC3′
NcoⅠ
共长20个核苷酸,其中划线部分为在preS2 3′端设计引入的一个NcoⅠ酶切位点。PCR及反应体系参见Promega公司提供的方法。PCR合成的产物用BamHⅠ和NcoⅠ双酶解得到含有preS2(120-146)核苷酸片段后备用。为了使preS2与S基因融合后阅读框架正确,同时我们也用PCR法合成了含adr亚型S基因的核苷酸顺序,对应氨基酸序号第1-226位。所用5′端引物为:
5′GCACCGACCATGGAGAGCAC3′
NcoⅠ
共长20个核苷酸,其中划线部分为在S基因5′端设计引入的一个NcoⅠ酶切位点。所用3′端引物为:
5′GGAGGTGTGGATCCGAGAGAG3′
共长21个核苷酸。
PCR反应体系与上述preS2的合成相同。PCR产物经NcoⅠ和HindⅢ(S基因3′端外含HindⅢ酶切位点见图1)双酶解后得到含有S(1-226)的核苷酸片段。另外将前述的BamHⅠ--NcoⅠ酶解的含preS2(120-146)的核苷酸片段同时克隆到经过BamHⅠ和HindⅢ双酶解的质粒pWR13上,得到含有preS2(120-146)和S(1-226)融合基因的质粒pWR/S2S(见图1)。融合克隆经DNA顺序测定验证,证明融合后阅读框架正确后备用。
实施例2 含肝细胞受体结合位点的preS1(21-47)抗原决定簇基因的PCR合成和pWR/S2S融合克隆的构建
我们选定带有adr亚型的乙肝病毒肝细胞受体结合位点的preS1抗原决定簇,氨基酸序号为第21-47位,用含preS1基因的重组质粒pADR-1作模板,用PCR扩增了含有对应第21-47位preS1的DNA片段。所用5′端引物为:
5′CTTTCTGTTGTATACCCTCTGGG3′
AccⅠ
共长23个核苷酸,其中划线部分为在preS1 5′端设计引入的一个AccⅠ酶切位点。3′端所用引物为:
5′CCAGTGATAAGCTTAGGGGTGG3′
HindⅢ
共长22个核苷酸,其中划线部分为在preS1 3′设计引入的一个HindⅢ酶切位点和一个TAA终止码。PCR及各方法同实施例1。PCR产物经AccⅠ和HindⅢ双酶解后备用。先将实施例1中含preS2(120-146)和S的融合克隆pWR/S2S经AccⅠ和HindⅢ双酶解打开,(S基因第223位含有一个AccⅠ酶切点),插入上述经PCR合成的含preS1并含有TAA终止码的片段,得到含preS2,S,preS1三重融合的克隆pWR/S2SS1(见图2)。融合克隆经DNA顺序测定,证明阅读框架正确后备用。
实施例3 含preS2(120-146)+S(1-223)+preS1(21-47)融合基因的重组痘苗表达质粒pGTP/S2SS1的构建
将重组质粒pWR/S2SS1经BamHⅠ和HindⅢ双酶解后分出含preS2(120-146)+S(1-223)+preS1(21-47)的三重融合基因片段,直接插入经同样双酶解打开的质粒pWR33上过渡,得重组质粒pWR33/S2SS1,再用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶解后分出上述长约0.8kb的融合基因片段,插入经同样双酶解的重组痘苗表达质粒pGJP-5,得含preS2(120-146)+S(1-223)+preS1(21-47)三重融合基因在重组痘苗表达质粒上的克隆pGJP/S2SS1(见图3)。
该重组质粒由上游起,依次为TK基因,痘苗启动子P7.5,ATG码+preS2(120-146)+ATG码+S(1-223)+preS1(21-47)+TAA终止码,多克隆位点,TK基因。重组质粒pGJP/S2SS1还有Apr耐药标记。可在大肠杆菌中转化(如TG-1),选择和扩增,以制备重组质粒DNA。含重组质粒pGJP/S2SS1的大肠杆菌Escherichia Coli TG-1/pGJP/S2SS1。存放标记CCTCCNo.M96003。
实施例4 含有preS2(120-146)+S(1-223)+preS1(21-47)融合基因的重组痘苗病毒的筛选和vS2SS1的鉴定
重组的痘苗是通过重组痘苗表达质粒pGJP/S2SS1和天坛病毒在CV-1细胞体内发生重组而产生,再通过感染TK-143细胞,在BUdR存在下选择重组痘苗空斑。由于表达质粒TK基因中插有P7.5启动子和融合基因,TK已失去活性,即TK-,在发生体内重组后,重组痘苗也是TK-的,也即BUdR存在下,只有发生重组的TK-才能存活下来,经过2次空斑纯化并经HBsAg,preS1和preS2抗原表达测定为阳性后,选择得到重组的痘苗病毒vS2SS1。
对重组痘苗病毒vS2SS1在DNA水平上进行了Southern blot鉴定。制备vS2SS1病毒DNA,并以天坛株病毒DNA和含融合基因的表达质粒pGJP/S2SS1为对照,都先经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶解,电泳后,再移至硝酸纤维素膜上。用S基因片段作探针进行杂交,结果如图4所示。已知重组表达质粒pGJP/S2SS1包含有preS2(120-146)+ATG码+S(1-223)+preS1(21-47),融合基因长约0.8kb,而重组痘苗病毒VS2SS1经BamHⅠ和EcoRⅠ酶解的片段能与S基因杂交的也是0.8kb大小的片段,而天坛株对照则呈阴性,这表明,融合基因已正确地插在重组痘苗病毒DNA中。
实施例5 重组痘苗病毒VS2SS1表达产物具有preS2,S,preS1三重抗原性的Western blot分析
重组痘苗病毒vS2SS1及仅含S基因的重组痘苗病毒vTH-2为对照,分别感染Vero细胞后,收集培液,就其中的表达产物进行了Western blot分析。经过PAGE电泳后,转移至硝酸纤维膜上。分别用抗HBsAg单抗(H166),抗preS1单抗(125E11)及抗preS2单抗(25-19)与之杂交。用vTH-2及痘苗病毒作对照,结果见图5。
用S单抗杂交,由图5A中2列可见vTH-2表达HBsAg的24KD和27KD(糖化带)蛋白条带,而vS2SS1表达的S2SS1其蛋白比S为大,可见27KD,29KD,31KD和33KD等不同糖化程度的蛋白(图5中A3列)。若用抗preS1单抗杂交,因vTH-2中无preS1,故呈阴性(图5中B2列),而在vS2SS1同样可见27KD,29KD,31KD及33KD的不同糖化程度的蛋白(图5中B3列)。若用抗preS2单抗杂交,同样因vTH-2中无preS2也呈阴性(图5中C2列),而vS2SS1则可见31KD和33KD蛋白条带。由于vS2SS1基因结构中含有由S2起始和由S起始的两个起始码。只有产物从S2起始的31KD和33KD含有preS2成分与preS2单抗杂交呈阳性。若产物从S起始,则在27KD和29KD蛋白位置上,因为没有preS2成分,故不能与preS2单抗杂交而呈阴性。实验中所有痘苗病毒对照都呈阴性。这一结果清楚地表明,vS2SS1表达的S2SS1蛋白具有除了含HBsAg外还同时含有preS1和preS2三重抗原性。
实施例6 重组痘苗病毒vS2SS1表达产物S2SS1蛋白的抗原性和分泌性
用重组痘苗病毒vS2SS1感染Vero细胞,同时用仅含S基因的重组痘苗病毒vTH-2作对照,对感染后的培液(细胞外m)和感染细胞裂解物(细胞内c)。按上述材料和方法g中所述ELISA方法分别测定了其中的HBsAg,preS1和preS2抗原表达水平。由表1可以看出,vS2SS1的表达产物无论是培液中和细胞裂解物中,都能明显地检测到HBsAg,preS1和preS2抗原的存在,同时所有三种抗原分泌到细胞外的抗原蛋白分别占表达抗原蛋白总量的约60%左右。在对照vTH-2中,因为只有S基因,因而没有preS1和preS2抗原的产生。同时vTH-2分泌至培液中的S蛋白约占表达的抗原蛋白总量的50%左右。由此可见vS2SS1与vTH-2相比表达三重抗原性的S2SS1蛋白比S蛋白具有更好的分泌性。
表1重组痘苗病毒vS2SS1表达三重抗原的ELISA测定
重组病毒
|
HBsAg
|
preS1
|
preS2
|
vS2SS1
|
m
|
c
|
m
|
c
|
m
|
c
|
1.044
|
0.581
|
0.870
|
0.692
|
0.311
|
0.231
|
vTH-2
|
1.000
|
1.068
|
0.034
|
0.034
|
0.013
|
0.027
|
m--培养液;c---细胞裂解液;数值为OD490nm值。
实施例7用密度超离心和电镜观察对重组痘苗病毒vS2SS1表达的S2SS1蛋白的颗粒性分析
用重组痘苗病毒vS2SS1感染Vero细胞96小时后,收集感染后培液,经氯化铯密度梯度超离心分析测定,按材料和方法g中所述ELISA方法对其中HBsAg,preS1和preS2抗原性进行了测定。首先测定其中HBsAg抗原性,可以发现一个密度为1.22g/ml的ELISA阳性峰(见图6)。同时测定了preS1和preS2的抗原性。它们的ELISA阳性峰与前者的阳性峰完全重合,也同处于密度为1.22g/ml峰处。这表明,表达的S2SS1融合蛋白具有密度为1.22g/ml的颗粒,并同时具有HBsAg,preS1和preS2的三重抗原性。收集高峰所含抗原蛋白,经过负染在电镜下观察,可见直径约为22nm的S2SS1抗原颗粒。该抗原颗粒与通常的S抗原颗粒在大小形状(22nm)和密度(1.20/ml)上没有十分明显的差别(图7)。