CN100415895C

CN100415895C - gp350/220的非剪接变异体

Info

Publication number: CN100415895C
Application number: CNB031454984A
Authority: CN
Inventors: R·施佩特; W·T·杰克曼
Original assignee: Aviron Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2015-04-13
Also published as: EP0769056B1; JP4317786B2; RU2178807C2; JP2003230396A; SK134396A3; PT769056E; DK0769056T3; JP3447743B2; KR100380953B1; JPH10501687A; DE69524415D1; SK283446B6; CN1152940A; LV11803A; CZ292283B6; TW496897B; JP2005333990A; US6458364B1; BR9507473A; EP0769056A4

Abstract

提供了含有gp350 DNA和氨基酸序列的组合物，以及含有所述序列的载体和宿主细胞。也提供了在没有gp220蛋白质产生的情况下用于重组制备gp350蛋白质的方法，提供了含有所述蛋白质的药物组合物及其预防应用。

Description

gp350/220的非剪接变异体

技术领域

本申请是1995年4月13日提交的中国专利申请95193673.5(发明名称： gp350/220的非剪接变异体)的分案申请。

背景技术

疱疹病毒组的一个成员，非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)，引起人的传染性单核细胞增多。该疾病侵袭90％以上的人群。健康分析者估测在美国每年该疾病的花费是100百万。该病毒主要是通过与排出该病毒的个体交换唾液而传播的。被EBV感染的儿童大多数无症状或者有非常微弱的病状，而青少年和成年人感染后发展成为典型的传染性单核细胞增多，特征为发烧，咽炎和腺病。已经感染过病毒的人群在其余中保留抗EBV抗体，并且因此对进一步的感染有免疫力。目前没有商品EBV疫苗出售。

除了感染特性以外，已经证明EBV将淋巴细胞转化为快速分裂细胞因此牵涉几种不同的淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤和口腔毛细胞粘膜白斑病中。已经在鼻咽肿瘤的组织样本中检测到EBV。据估测世界范围内有80,000例鼻咽癌发生并且在中国的少数民族人群中更流行。

对于EBV的活的，减毒疫苗的研制已经并且仍然是个问题。由于存在与EBV相关的潜在的致癌特性，研究者难于得到使用活疫苗的方法。本发明通过创制制备亚单位疫苗的方法和组合物而克服了与活疫苗研制有关的问题，所述方法和组合物不需要使用潜在的致癌活疫苗。亚单位疫苗使用一种或多种来自于激发免疫应答和授予免疫性的病毒的抗原蛋白。

两种较重要的抗原性EBV蛋白是糖蛋白gp350/300和gp220/200，它们构成了病毒包膜部分和通过与细胞膜蛋白CD21发生作用允许病毒颗粒结合到并且加入人靶细胞。参见奈麦如，病毒杂志61·1416(1987)。长期来已经将它们选出作为亚单位疫苗候选物但是难于从天然来源获得有抗原性的活性蛋白以及由于重组生产的产量较低妨碍了研究者和疫苗研制者的工作。在文献中这些蛋白质有不同的分子量范围(其中一种蛋白质的分子量为350或300千道尔顿(kD)和另一种蛋白质的分子量为220或200kDs)。在本文中将gp350或300蛋白质称作为gp350蛋白质和将gp220或200蛋白质称作为gp200蛋白质。总之，两种蛋白质在本文中称为gp350/220蛋白质。

可选择一种经剪接的单基因编码并且导致产生gp350和gp220mRNA转录产物；已知没有天然存在的在gp350/220基因剪接位点处的变异体该基因产生两种表达产物，gp350和gp220蛋白质。gp350/220DNA序列的开放读框是2721碱基对。该整个阅读框架编码gp350的907个氨基酸。参见授权给凯夫的U.S.专利No.4,707,358(1987)。剪接形式的阅读框架具有2130个碱基并且转译为gp220蛋白质，一种710个氨基酸的序列。gp350蛋白质和gp220蛋白质的理论分子量是分别为95kD和70kD。经检测，表达的gp350蛋白质和gp220蛋白质的分子量是不定的并且分别为约350千道尔顿和220千道尔顿(kD)。该蛋白质的广泛糖基化是预测的和实际的分子量有差异的原因。对于任何一个细胞，以约6∶1到1∶1的摩尔比产生gp350蛋白质和gp220蛋白质。例如，对于由EBV持久感染的B95-8细胞，该比例似乎是不定的并且有时接近于6∶1的范围。参见，米勒，美国国家科学院院报，69：383(1972)。

类似地，至今为止重组生产的这些蛋白质通常得到所产生的gp350蛋白质和gp220蛋白质的混合物。迄今为止，已经在大鼠垂体，中国仓鼠卵巢VERO(非洲绿猴肾)细胞，以及酵母细胞中表达了gp350/220蛋白质。参见王，J.Virol.61：1796(1982)，Motz，Gene 44：353(1986)和艾米尼，病毒学166：387(1988)。已经利用牛乳头瘤病毒表达系统在鼠成纤维细胞中制备gp350/220蛋白质。参见，Madej，Vaccine 10：777(1992)。还已经利用痘苗病毒的实验室和疫苗株表达gp350/220蛋白质。经修饰的重组形式的EBVgp350/220DNA和蛋白质是本领域内已知的。特别是已经制备了失去跨膜序列的gp350/220基因的截短的重组构建体。所述构建体仍产生两种gp350和gp220的混合物，但是失去了允许蛋白质分泌的跨膜区域。参见，费纳提，基因病毒学杂志73：449(1992)和梅者，疫苗10：777(1992)。也已经在大肠杆菌中制备和表达了含有gp350/220的各种重组生产的限制性片段和融合蛋白。参见1991年7月24公开的EP专利公开0173254。

因此，迄今为止涉及gp350/220的对EBV的研究已经集中于使天然gp350/220序列获得有效表达或者集中于失去跨膜区的经修饰的序列，结果产生两种不同剪接形式的天然或失去跨膜区的蛋白质的混合物，或集中于生产与β半乳糖苷酶融合蛋白形式的抗原决定族片段序列。

部分纯化的gp350/220制剂是已知的。参见，Finerty，J.Gen.Virology 73：449(1992)(重组生产的，部分纯化的)。对于天然gp350/220蛋白质，在大多数情况下，纯化步骤导致蛋白质的抗原性失活，使之不适合用于亚单位疫苗中。但是，在科学文献中已经报道了从天然(即非重组)来源获得的高度纯化的具抗原活性的gp350/220蛋白质制剂。参见，Dvaid，J.Immunol.Methods 108：231(1988)。将其它的重组疫苗病毒表达的gp350/220蛋白质用于接种于cottontoptamarin，使之抵抗EBV诱导的淋巴细胞瘤。参见，Morgan，J.Med.Virology 25：189(1988)，Mackett，EMBO J.4：3229(1985)和Mackett，VACCINES’86，pp293(Lerner RA，Chanock RM，Brown FEds.，1986，Cold Spring Harbor Laboratory)。但是，目前还没有对病毒gp350/220DNA序列进行工程化以便能够表达该基因的两种剪接方式的任何一种，从而能够并且确保生产纯化的gp350或gp220蛋白质。还没有制备出能表达gp350或gp220蛋白质的任何一种的重组病毒或突变病毒。

通常，剪接位点有利于使前mRNA分子加工为mRNA。对于多瘤病毒，要求剪接位点有利于有效地积累晚期mRNA。多瘤病毒转录物中的3’或5’剪接位点的变更降低或完全阻碍mRNA的积累。参见，Treisman，Nature 292：595(1981)。在SV40病毒中，可切除的间插序列有利于从核中输出mRNA和mRNA在核中的稳定性。并且由于这些内含子/外显子连接序列有利于小的，核的，RNP颗粒结合，因此认为剪接前的mRNA不能正确地与加工途径相连接。已经证明在外显子/内含子剪接位点处的点突变降低了外显子/内含子裂解和可以干扰前-mRNA加工，核运输和稳定。参见，Ryn，病毒杂志63：4386(1989)和Gross，Nature 286：634(1980)。

因此，直到本发明，剪接位点的修饰对有EBVgp350/220序列编码的蛋白质的功能表达和抗原性的影响充其量是未知的并且是不可预测的

其它的背景文献包括如下所达。在Straus，Annal of Int.Med.118：45(1993)中总体上评述EBV生物学和疾病。在Baer，Nature310：207(1984)中描述了EBV BLLFI开放读框。由Beisel，病毒杂志54：665(1985)和Biggin，EMBO J.3：1083(1984)d的论文和在Kieff等人(1987)的美国专利No.4,707,358中描述了非洲淋巴细胞瘤病毒gp350/220DNA和氨基酸序列。在Lees，Virology 195·578(1993)中公开了非洲淋巴细胞瘤病毒A型和B型编码gp350/220糖蛋白的DNA序列的比较结果。在Thorley-Lawson，Proc Natl.Acad.Sci.77：5307(1980)中公开了展示抗EBV的gp350/220糖蛋白的中和活性的单克隆抗体。最近，在Mount，NucleicAcids Res 10·459(1982)中公开了供体和受体剪接位点的剪接位点共有序列。

发明内容

一方面本发明提供了EBV gp350/220DNA序列的非剪接变异体。本发明的DNA序列包括一种编码表达的同源gp350蛋白质的分离的DNA序列。编码gp350蛋白质的DNA序列的特征在于含有相同于或基本相同于图1的核苷酸序列，其中供体和受体剪接位点处的天然核苷酸被非天然核苷酸或其片段取代。该DNA序列包括编码序列两侧的5’和3’非编码序列以及进一步包括氨基末端信号序列。附图1描述了非编码序列和用星号指出了假设的信号序列。但是，应该明白本发明的DNA序列可以排除一些或所有侧翼或信号序列。通过在编码gp350/220蛋白质的基因DNA序列的供体和受体剪接位点处导入突变可产生本发明的非剪接变异DNA序列。这种方法排除了gp220蛋白质的生产以便仅生产gp350蛋白质。

因此，另一方面本发明包括均一的gp350蛋白质，和通过在合适的表达控制序列控制的条件下在合适的原核或真核宿主细胞中表达EBVgp350/220DNA序列的非剪接的变异体而制备蛋白质的方法。对于本文中使用的术语gp350蛋白质，均一是没有或基本上没有gp220蛋白质。我们注意到在哺乳动物或昆虫细胞中重组产生的均一gp350蛋白质在迄今为止的科学文献中没有报道过。

在另一方面，提供了另外具有导致产物分泌的缺失的均一gp350蛋白质。所述缺失包括去除跨膜区或去除跨膜区和保留C-末端的gp350。所述附加修饰的DNA序列和由其编码的蛋白质是本发明的又一方面。

还提供了一种重组DNA分子，包括载体DNA和编码均一gp350蛋白质的DNA序列。该DNA分子提供了与合适的调节序列可操作结合的gp350序列，所述调节序列能够在选定的宿主细胞中指导均一gp350的复制和表达。本发明还提供了用于表达重组均一gp350的用所述DNA分子转化的宿主细胞。

本发明的另一方面涉及所述的DNA分子和转化的宿主细胞，涉及用于生产重组均一gp350蛋白质或其片段的新方法。在该方法中在合适的允许所述重组DNA表达的条件下培养用一种与能控制该蛋白质表达的合适调节或表达控制序列可操作连接的DNA序列(或如上文中描述的重组DNA分子)转化的细胞系，所述DNA序列编码均一gp350蛋白质或其片段。然后采用合适的常规手段从宿主细胞或培养基中收集所表达的蛋白质。该方法可以使用该多已知的细胞作为宿主细胞；目前优选的是哺乳动物细胞和昆虫细胞。

本发明的DNA序列和蛋白质可用于生产具有EBV抗原决定簇的治疗和免疫原化合物。所述化合物可用于亚单位疫苗，用于预防治疗和预防EBV相关的疾病，例如传染性单核细胞，伯基特淋巴瘤或鼻咽癌。因此，另一方面本发明包括用于预防和治疗人的EBV相关状况疾病例如传染性单核细胞，伯基特淋巴瘤或鼻咽癌的治疗和/或免疫原的药物组合物。所述治疗和/或免疫原的药物组合物包括与药物学上可接受的载体例如氢氧化铝，盐水和磷酸缓冲盐水(如本发明已知的)混合的能有效诱导免疫原性量的一种或多种本发明的均一gp350蛋白质。“诱导免疫原性的”是指其量足以刺激哺乳动物产生抗EBV的抗体。另一种可选择的方法，活性形式可以以含有脂质体的聚合体的形式给药。对于预防应用，所述药物组合物可以配制成为施用于人患者的亚单位疫苗。可以用足于刺激病人形成抗体的剂量免疫接种患者；并且在六个月或一年之后再接种。

因此本发明的又一方面是通过给患者特别是人患者施用与合适载体结合的能有效诱导免疫原性量的均一gp350蛋白质而治疗EBV相关疾病和状态的方法。本发明的又一方面是通过给患者施用与合适载体结合的能有效诱导免疫原性量的均一gp350蛋白质而刺激抗EBV的免疫应答。

附图说明

附图1描述了gp350/220的DNA和氨基酸序列(Besiel，病毒杂志54665(1985))。指明了供体和受体剪体位点。用水平箭头描述跨膜区并且用星号表示假设的信号序列的末端。在左边显示核苷酸的编号；在右边显示氨基酸的编号。

附图2描述了gp350缺失和定点突变的结构。标明为pMDTM和pMSTOP的质粒图谱用于举例说明本发明的非剪接的gp350/220变异体。在(A)部分中，近似地按比例显示了gp350蛋白质的线性模型以及与编码克隆，BLLF1(见下文)。指明了蛋白质上的N-末端信号肽序列(SS)和跨膜区(TM)并且在基因图上指明了重要的限制性图谱。将gp350基因克隆于两个片段，HindIII/Bfal BLSH1片段和BanI/HindIII BLSH2片段中。利用聚合酶链反应从所指明的BLLF1区制备SCYT。在(B)中，显示了pDTM，pSTOP，pMDTM，和pMSTOP的克隆方案(质粒未按比例显示)。实施例1和2详细描述了克隆步骤。用相应的限制性位点，使用的克隆载体和gp350基因片段标记质粒图谱。用星号显示pMDTM，和pMSTOP的剪接位点。

附图3描述了由SDS-PAGE分析的由pMDTM克隆产生的均一gp350蛋白质的免没沉淀的结果。分泌截短形式的gp350/220蛋白质的阳性对照(GH3Δ19)细胞和阴性对照细胞以及几种pMDTM克隆用³⁵S-甲硫氨酸在代谢过程进行标记5.5小时；从得到的组织培养上清液免疫沉淀出均一的gp350蛋白质。对于每一种细胞类型，在5％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)上将标记的组织培养上清液(S)和gp350/220沉淀(Ip)样品进行电泳。在左边指示分子量标记物的位置。

附图4描述了来自CHO细胞表达的pMDTM克隆的蛋白质，如实施例3.4的Northern印迹分析结果。

具体实施方式

公开了包含编码非剪接的gp350蛋白质变异体的克隆的EBV DNA序列组合物和方法。正如所解释的，本文中所述非剪接变异体是指均一gp350蛋白质。通常，当gp350/220基因在哺乳动物细胞中表达时由于基因的RNA剪接作用产生两种基因产物gp350和gp220。本发明仅允许产生一种基因产物gp350。本发明涉及从gp350基因中去除一些或整个RNA剪接位点信号并且在合适的宿主细胞中表达该基因。当在哺乳动物细胞中表达gp350/220基因时在该基因中导入突变以便阻止产生该蛋白质的220kD形式。结果仅产生编码gp350的mRNA转录物。通过利用gp350/220基因非剪接变异体而去除gp220的表达导致相对gp220而言gp350的产生增加。gp220的产生不是生产有效抗EBV疫苗所必须的，因为gp350含有在gp220中发现的所有有效的抗原位点。

因此，本发明的一方面提供了编码基本上相同于gp350的多肽的DNA序列，所不同的是通过用非天然核苷酸取代天然核苷酸已经修饰了编码氨基酸501的供体剪接位点密码子和编码氨基酸698的受体剪接位点密码子。优选地是用非天然核苷酸取代天然核苷酸以便保留相同的氨基酸序列。特别是，在该实施例中，在供体剪接位点的天然核苷酸AAGT(核苷酸1500到1504)和GG受体剪接位点侧翼的天然核苷酸A和T(核苷酸2091和2094)分别用核苷酸GTCA和T和A取代。因此，在供体位点取代的结果保留第500位的氨基酸谷氨酸和第501位的丝氨酸是相同的。另外，在受体位点取代的结果保留第697位的氨基酸苏氨酸和第698位的甘氨酸是相同的。

类似地，采用本领域内已知的在下文中将详细描述的接受可以方便地完成除特别列举以外的取代。

因此，本发明一方面包括均一的gp350蛋白质。均一gp350蛋白质的进一步的特征在于其氨基酸序列基本上相同于附图1显示的氨基酸1-907位，氨基酸1-862位或氨基酸1-907位并且除去氨基酸863-881位的序列，各带有或没有N-末端的18个氨基酸的信号序列。另外，提供了均一的gp350蛋白质的类似物并且包含突变体，其中氨基酸序列发生变异但是保留了抗原活性并且与均一的gp350蛋白质的相应区域相比优选的是具有至少80％，更优选的是具有90％，最优选的是具有95％的同源性。实施例包括与附图1的氨基酸序列相比具有最小变异特别是保守的氨基酸取代的蛋白质和多肽；保守的取代是那些与其侧链相关的氨基酸族之内发生的取代。通常遗传上编码的氨基酸可划分为四个族：(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)未带电荷的极性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。有时将苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸一起划分为芳香族氨基酸。例如，有理由预期用结构相关的氨基酸隔离地取代亮氨酸或类似的保守取代一种氨基酸对抗原活性或功能特性没有巨大影响。

本发明具有gp350的纯化较简单的优点。由于gp350和gp220具有类似的生化特性，在gp350制备时经常共纯化gp220。仅表达gp350/220基因的非剪接变异体的细胞使蛋白质的纯化简单化。这将降低生产gp350的费用。本发明也使对用于gp350纯化的起始材料进行生化定性变为简单。由于仅存在一个品种，可在不考虑存在第二个品种的情况下完成蛋白质含量分析和氨基酸序列分析。

另外本发明具有增加gp350产生的优点。阻止gp350基因剪接可将细胞从双重产生gp350和gp220变为仅产生gp350。在一些细胞中，估测gp220的浓度为gp350浓度的30％-100％。由于去除了基因的剪接，gp350的产生随着gp220产生的损失而提高。

由Beisel，病毒杂志54：665(1985)和Biggin，EMBO J.3：1083(1984)描述了gp350/220基因的DNA序列并且描述于附图1中。该基因是2721碱基的开放读框，编码907个氨基酸并且产生约95kD的一级转译产物。预定的和实际的值之间的差异代表该蛋白质被广泛地糖基化。将591个碱基(编码197个氨基酸)剪接以便产生gp220。gp350/220基因产物的表观分子量随着所使用的检测系统的类型，不同类型的细胞中使用的糖基化位点，转译后的不同加工方法或选择性基因的突变而变化。对于不同的gp350/220基因非剪接位点变异体的产物，所测定的值是不同的，但是术语“均一gp350蛋白质”包括非剪接位点变异体的基因产物，非强制性地含有其它的缺失或突变例如C-末端缺失和/或本文中公开的跨膜区修饰。术语“gp220蛋白质”是指具有分子量约220kD的另一种剪接的gp350/220基因产物。通过将gp350/220基因与基于其它基因，主要是真核生物体的基因的共有的供体和受体剪接序列进行比较可识别gp350/220基因中的剪接位点。由Mount，Nucleic Acids Res.10：459(1982)从研究其它基因的剪接位点得出的共有序列是：

供体：

\frac{A}{C} AG / G * T * \frac{A}{G} AGT

受体：

\frac{T}{C} N_{11} \frac{C}{T} A * G * / G

上述带星号的碱基代表在所有的剪接位点100％出现的碱基(高度保守)。有两个碱基或一个碱基的位置代表保守位置(非强调的位置)。斜线位置表示实际的剪接位点。

在gp350/220基因中通过对gp350/220基因的DNA序列测序(Biggin，EMBO J.3：1083(1984))显示供体剪接位点出现于核苷酸1501之后，受体剪接出现于核苷酸2092之后。(本文中使用的和附图1使用的编号对应于Biggin的编号)。在EBV的B型菌株该剪接位点出现于相应的基因区(供体剪接位点出现于A₁₅₀₁之后，受体剪接出现于A₂₀₂₉之后)。本发明包括利用A或B菌株或另一种EBV菌株的剪接位点以便从gp350/220基因产生单一的mRNA而制备的组合物。在该实施例中使用了B95-8菌株的A型病毒形式的DNA序列，尽管使用B型菌株的DNA序列是相同的，因为A和B型菌株的转译基因产物98％是相同的。B菌株失去了507-520位的氨基酸和570-576位的氨基酸。由于A型菌株含有所有可能的gp350抗原位点因而使用A型菌株。另一种方法，根据本文的观点使用具有菌株特异性序列的EBV gp350/220以便产生EBV菌株特异性的均一gp350蛋白质，它具有特异于特定菌株的免疫特性并且因此用于免疫和/或治疗组合物中以便预防或治疗菌株特异性EBV相关疾病。表1显示供体和受体剪接位点的野生型核苷酸和氨基酸序列。

为了预防gp350/220基因的RNA剪接，将突变导入到gp350/220基因的核酸序列以便取代RNA剪接位点的有关碱基对。为了使剪接位点失去功能，优选地，在形成供体或受体位点框架的两个高度保守碱基中的至少一个碱基应该被非保守碱基取代，更优选地至少两个高度保守碱基应该被突变为非保守碱基。其它保守碱基，剪接位点之外的两个以上碱基也可以被非保守剪接位点碱基取代以便进一步降低剪接位点的识别。将供体和受体位点改变以便破坏剪接机理。优选地，供体和受体在四个高度保守剪接位点碱基位置之一至少各含有一种变化，并且优选地，至少在四个高度保守剪接位点碱基位置之二各含有两种变化。如果期望一个剪接位点没有突变以便保持野生型氨基酸序列，那么优选地将至少两个突变导入到其它剪接位点。

在gp350/220剪接位点的突变可以使随后表达的氨基酸序列发生变化优选地所述变化应该是保守的氨基酸取代。与氨基酸序列中非保守的取代相反，保守的氨基酸取代将帮助保存抗原位点可以制备保守的氨基酸变化，只要该碱基的变化(几个碱基变化)导致非变异的供体/受体碱基发生合适的变化。例如，利用除GGU以外的特异于Gly的密码子可以在供体剪接位点以Gly取代Ser₅₀₁(利用GGU会保存G核苷酸并且不会在剪接信号产生所需的GT取代)。另外，在受体剪接位点，以Gly₆₉₈取代Ala将是保守的变化，但是由于所有的Ala密码子是以高度保守的G核苷酸起始的，这不会产生所需的取代。虽然脯氨酸也可能是一种保守的氨基酸变化，但是不能用脯氨酸取代野生型氨基酸，因为它会导致蛋白质的三级结构发生修饰，从而掩饰一个或多个gp350抗原位点。表1显示野生型序列中的可接受的保守的氨基酸取代。在表1的底部是用保守的氨基酸序列突变的实施例。

表1

Donor AcceptorWild-type Sequencessplice spliceGAA A|GT ACA G|GTGlu Ser501 Thr Gly692↓ ↓ Conservative a.a ↓ ↓changesAsn Ala Ala SerAsp Gly Gly ThrGln Thr Serex.：GAC ACA TCG TCTAsp Thr501 Ser Ser693

虽然本发明的一方面包含gp350/220的非剪接变异体，但是其它的gp350/220的编码序列的突变体也是令人满意的。为了生产可溶性gp350蛋白质(“可溶性蛋白质”是在溶液中游离的或与膜结合但是不与膜整合)，例如，以便避免由于表达整合膜蛋白形式的全长gp350而产生的细胞毒性问题，通过缺失整个或部分其DNA编码序列而对gp350的膜跨越区(已知也称为跨膜区)进行修饰。gp350/220的膜跨越区包含861位(甲硫氨酸)-881位(丙氨酸)氨基酸。参见，Beisel，病毒杂志54：665(1985)。优选地，缺失跨膜区的至少8个氨基酸，更优选地缺失至少12个氨基酸，最优选地缺失18和21之间的氨基酸。因此，另一方面，本发明提供了gp350/220 DNA的非剪接变异体和/或gp350均一蛋白质，特别是在gp350/220DNA和/或gp350均一蛋白质的跨膜区至少有一个缺失，从而导致可溶性均一gp350蛋白质的表达。

除了缺失整个或部分非剪接gp350/220变异体的跨膜区，如本文描述的根据本发明也可以缺失跨膜区后面的含有881-907位的氨基酸的C-末端序列。因此另一方面本发明包含进一步由缺失整个或部分DNA编码序列和/或氨基酸序列(gp350/220的跨膜区)，并且甚至进一步由缺失其余的C-末端DNA和/或gp350/220的氨基酸序列而修饰的gp350/220DNA的非剪接变异体和/或gp350均一蛋白质。

因此，另一方面本发明包含编码本发明的均一gp350蛋白质的非剪接的DNA序列变异体。所述DNA序列包含编码1-907位氨基酸的附图1的DNA序列并且进一步含有本文所述的核苷酸取代以便去除供体和受体剪接位点。所述DNA序列非强制性地含有截短的DNA序列，其中缺失了编码整个或部分跨膜区和包含861-881位的C末端的核苷酸，并且含有缺失变异体，其中缺失了编码含有861-881位的整个或部分跨膜区的核苷酸。编码均一gp350蛋白质的本发明的DNA序列也含有能在合适的严谨条件下，或要不是遗传密码子简并能在所述条件下与附图1的分离出的DNA序列杂交的DNA。因此，基于等位变异，种变异或故意修饰，本发明的DNA序列在非编码序列，信号序列或编码序列中可以含有修饰。

利用本领域内已知的方法可以构建本文中公开的这些非剪接变异gp350/220DNA序列。可以采用重组方法，或者利用已知方法表达本发明的修饰DNA序列以便生产本发明的均一gp350蛋白质。可将所述重组蛋白质纯化并且掺入到药物组合物中用于预防治疗和防止EBV相关疾病。

可利用本领域内已知的合适表达控制系统在不同的细胞类型中重组表达本发明的非剪接的变异gp350/220DNA。本领域内已知和可行的合适的细胞包括但不限于酵母细胞例如啤酒酵母，细菌细胞例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌和哺乳动物细胞例如GH3，CHO，NSO，MDCK和C-127细胞。根据与所使用的细胞类型和表达控制系统的相容性选择适应于细胞类型的载体。优选地，使用表达gp350/220基因的分泌产物的细胞和载体。通常例如，利用已经用常规技术修饰而含有表达所需蛋白质的DNA序列的pBR322的衍生物转化大肠杆菌，在本发明中其中所述的DNA序列是有或没有编码C-末端和/或膜跨越区的序列的EBV gp350的非剪接变异体。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性的基因，用作为标记物。参见，Bolivar，Gene 2：95(1977)。通常使用的表达控制序列即用于转录起始的启动子和非强制性包括的操纵基因或加强子，包括β-内酰胺酶和lac启动子系统(参见Chang，Nature198：1056(1977))，色氨酸启动子系统(参见Goeddel，Nucleic AcidsRes.8：4057(1980))和λ衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(参见Shimatake，Nature 292：128(1981))。但是，可以使用与原核宿主细胞相容的可行的启动子系统或表达控制系统。在授权给Itakura(1982)的美国专利No.4,356,270，授权给Riggs(1984)的4,431,739和授权给Rutter(1984)的4,440,859中列举了其它的宿主细胞，质粒和表达载体。

也可以将昆虫细胞用作为宿主细胞以便利用昆虫细胞进行表达。对于在昆虫细胞表达的情况，通常表达系统的成分包括经常为细菌质粒的转移载体和一种具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的野生型杆状病毒(从而允许异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)以及合适的昆虫宿主细胞和生长培养基，所述转移载体含有杆状病毒基因组的一个片段和用于插入异源基因的或待表达便利的限制性位点。

目前，将外源基因导入到AcNPV中的最常用的转移载体是pAc373。也已经设计了许多本领域内技术人员已知的其它载体。例如包括pVL985(它将多角体蛋白起始密码子ATG改变为ATT，并且在ATT的下游的32碱基对处导入了BamHI克隆位点；参见Luckow和Summers，Viorlogy(1989)17：31)。

通常该质粒还含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人(1980)Ann.Rev.Microbiol.，42：177)和原核的氨苄青霉素抗性(amp)基因和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的复制原点。

杆状病毒转移载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够结合杆状病毒RNA聚合酶并且启动编码序列(例如结构基因)下游(5’-3’)转录成为mRNA的任何DNA序列。启动子具有转录起始区，通常置于接近编码序列5’末端。通常该转录起始区包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒转移载体也可以具有称为加强子第二结构域，如果存在该加强子，通常远离结构基因。表达可以是被调节的或组成型的。对于昆虫细胞表达技术，参见EP专利公开155 476。-酵母，例如酿酒酵母亦可用作宿主细胞。能得到并使用多种细胞株。另外，适应于酵母表达的质粒载体是已知的，启动子和表达控制系统也是已知的。参见例如，Myanohara，Proc.natl.Acad.Sci.80：1(1983)(PHO5启动子)，EP专利公开012873(引导序列)，Kurtz，Mol.Cell.Biol.6：142(1986)，Ito，J.Bacteriol.153：163(1983)和Hinnen，Proc.natl.Acad.Sci.75：1929(1979)(转化程序和合适载体)。

当然也可以将来自多细胞生物体的真核细胞用作为表达编码所需蛋白质和多肽的基因的宿主细胞。有用的宿主细胞系包括VERO和HeLa细胞，和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。与所述细胞相容的表达载体也是可用的并且典型包括启动子和表达控制序列，例如SV4的早期和晚期启动子(参见，Fiers，Nature273：113(1978))和来自多瘤病毒，腺病毒2，牛乳头状瘤病毒或鸟肉瘤病毒的启动子。在授权给Mather(1992)的美国专利申请No.5,122,469，授权给Axel(1983)的4,399,216，授权给Axel(1987)的4,634,665，授权给Levinson(1987)的4,713,339，授权给Ringold(1987)的4,656,134，授权给Kellems(1989)的4,822,736，授权给Fiers(1989)的4,874,702中列举了宿主细胞，启动子，选择性标记和技术。

利用适合于所述细胞的标准技术，例如在CohenProc.Natl.Acad.Sci.69：2110(1972)中公开的用于原核细胞的CaCl₂处理法和在Graham，Virology 52：546(1978)公开的用于哺乳动物细胞的CaPO₄沉淀法可完成合适的宿主细胞的转化。按照在Hsiao，Proc.Natl.Acad.Sci.76：3829(1979)或如在Klebe，Gene25：333(1983)公开的方法完成酵母的转化。

利用本领域内已知的常规连接法和限制性技术可构建含有非剪接变异gp350序列(有或没有在本文中公开的导致C-末端和/或膜跨越区的其它修饰)的合适的载体。通过在标准条件下，特别是通常由限制性酶制造商提供的条件下用合适的限制性酶处理而进行位点特异性DNA裂解。利用标准技术进行聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳以便按大小将切割的片段分离，并且通过在四个脱氧核苷酸三磷酸存在下用大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段处理使片段的末端成平齐末端。用S1核酸酶处理将单链部分水解。利用例如本领域内已知的氨基亚磷酸二乙酯(diethyl phospho anidite)方法合成寡核苷酸。参见，美国专利No.4,415,732(1983)。在标准条件和温度下利用T4 DNA连接酶完成连接，通过用连接混合物转化大肠杆菌或COS细胞证实正确的连接。利用氨苄青霉素，四环素或其它抗菌素或利用本领域内已知的其它标记选择成功的转化体。

在文献中对所述重组DNA技术进行详细解释。参见，例如，

萨姆布鲁克等，分子克隆：实验室手册，第二版(1989)；DNA克隆，第I及II卷(DN，格拉夫编1985)；寡核苷酸合成(MJ.盖特编1984)；核酸杂交(BD海姆斯编1984)；转录和转译(BD海姆斯编1984)；动物细胞培养(RI弗莱施尼编1986)；B.坡堡，分子克隆实施指南(1984)；哺乳动物基因转运载体(JH米勒编1987，冷泉实验室)；斯科普，蛋白纯化：原则和实践，第二版(1987斯普林格-沃拉登NY)和免疫学实验手册Vols I-IV(DM Weired 1986)。

本文中提及的所有出版物引入本文作参考。

因此另一方面本发明包含含有非剪接变异gp350/220DNA序列的载体和宿主细胞和进一步包含通过在能使均一gp350蛋白质表达的培养条件下培养所述宿主细胞制造非剪接变异gp350/220蛋白质的方法，所述宿主细胞含有携带与表达控制序列连接的非剪接变异gp350/220DNA序列的载体。

利用常规的糖蛋白纯化技术例如但不限于超滤，自由流动的电泳，凝胶过滤层析，亲和层析，SDS-PAGE，差示NH₄SO₄沉降，凝集素柱，离子交换柱和本领域内已知的疏水柱，从细胞和培养基成分中纯化表达的均一gp350。利用SDS-PAGE或凝集素亲和柱最容易纯化gp350的小批量的分析制剂，利用液体层析最容易纯化用于疫苗或免疫应答试验的所述小批量制剂。对于用于疫苗组合物的商品显著量的gp350的大批量生产，允许的是将超滤，凝胶过滤，离子交换，和疏水作用层析结合应用。

可将本发明的纯化，均一gp350蛋白质用于治疗和/或免疫组合物中，用于治疗和预防EBV相关的状况和疾病例如，传染性单核细胞增多，伯基特淋巴瘤，鼻咽癌。所述药物组合物包含与药物学上可接受的载体例如助剂/抗原呈递系统例如铝混合的能有效诱导免疫原性量的一种或多种本发明的均一gp350蛋白质。也可以使用其它的助剂/抗原呈递系统例如MF59(Chiron Corp.)，QS-21(Cambridge Biotech Corp.)，3-DMPL(3-脱酰基-单磷酰脂A)(RibiImmunoChem Research.Inc.)，临床级的不完全弗氏助剂(IFA)，fusogenic脂质体，水溶性聚合体或Iscoms(免疫刺激复合物)。其它的典型的药物学上可接受的载体或溶液是氢氧化铝，盐水和磷酸缓冲盐水。该组合物可以是全身给药，优选地以可接受的皮下或肌内溶液形式皮下或肌内给药。通过表皮划破或体腔接种也可完成接种。所述溶液的制备，包括pH，等渗性，稳定性等等是本领域内已知的技术。所使用的剂量由医生考虑已知可改变药物作用的各种因子决定的，例如身体状况，体重，性别，食物，疾病的严重性，给药时间和其它临床因子。典型的剂量范围包括约1μg-约1000μg之间的蛋白质。

在实施本发明的治疗方法时，给需要治疗或预防的人患者施用诱导免疫原性有效量的均一gp350蛋白质。所施用的每剂量含有约1μg-约1000μg范围内的诱导免疫原性有效量的本发明的组合物。所施用的剂量的数目随着上面介绍的因子而变化。在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例是为了描述本发明而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

gp350/220跨膜区和跨越C末端的跨膜区的缺失以便制备pDTM和pSTOP

来自EBV B95-8菌株(Miller，等人，1972)的gp350/220基因以称为BLLF1的开放读框形式存在于BamHI文库中(Baer，Nature310：207，1984)。为了制备所需的构建体(显示于附图2B中)，将gp350/220分两个部分克隆：1)BLSH1，2.3kb的HindIII/BfaI3’片段和2)BLSH2，337b.p.BanI/HindIII 5’片段(附图2A)。将这些片段克隆到中间载体以便实现C-末端胞质和/或转膜编码区的缺失。由于在编码gp350转膜(TM)区的区域的5’末端存在BfaI位点，可将其用于构建TM区的缺失和带有邻近的C末端缺失的TM区缺失。利用BfaI，可以制备仅保留TM区的两个氨基酸的缺失(表2)。

1.从pSTG1和pSTG3构建pDTM

质粒pDTM由失去了整个TM编码区的gp350/220核酸序列组成。利用两个中间载体pSTG1和pSTG3可制备该构建体。利用BLLF1克隆靶序列可制备450bp PCR产物，SYCT，它在TM区的3’末端导入了BfaI位点(附图2)。所使用的PCR引物如下：

BfaI

Pnmer 1：GG ATC CTA GAC TGC GCC TTT AGG CGT A

BLLF1： ...GAC TGC GCC TTT AGG CGT A..

A.A.： ...Asp Cys Ala Phe Arg Arg...

↑____End of TM Region

Pnmer 2：GGA TCC TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG

BLLF1：......TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG

引物1的BfaI位点用于将SCYT的BfaI/XmaI片段克隆到pSTG1。引物1的其余部分对应于由克隆BLLF1编码的氨基酸序列。引物2对应于gp350/220开放读框之外的该基因3’端的区域。用BfaI和XmaI切割SCYT PCR片段以便产生136碱基对片段，该片段与第二个片段，BLSH1 HindIII/BfaI片段一起克隆到pTM11以制备pSTG1。跨越BfaI位点的测序分析结果显示整个TM氨基酸编码区被缺失，仅留下氨基酸Met和Leu(参见表2)。将第三个BLLF1片段，BLSH2克隆到pTM11以制备pSTG3。将gp350/220基因编码序列之外的16碱基对BanI/XbaI

寡核苷酸接头用于将BLSH2BanI/HindIII片段克隆到pSTG3。将2.4HindIII/XmaI pSTG1片段与0.3XbaI/HindIII pSTG3片段一起克隆到pEE14载体(Celltech，England)得到整个pDTM构建体。

2.利用载体pSTG2和pSTG3构建pSTOP

质粒pSTOP含有失去了TM区和带有邻近的C末端胞质区的TM区的gp350/220基因。为了制备该构建体，制备一个相当于BfaI粘性末端16碱基对的BfaI/EcoRI寡核苷酸接头，它在三个框架中带有终止密码子(底下划线)如下所示：

TAT AGA CTA GTC TAG G

A TCT GAT CAG ATC CTT AA

上排序列的5’延伸臂(TA)是一个BfaI限制性位点的粘性末端并且下排序列的5’延伸臂(TTAA)是EcoRI粘性末端。将该16碱基对接头用于将BLSH1 HindIII/BfaI片段克隆到pTM11以制备pSTG2。将2.3kb pSTG2HindIII/EcoRI片段和pSTG3 0.3kb XbaI/HindIII片段克隆到pEE14以制备pSTOP。

3.野生型，pDTM和pSTOP序列的TM区域的比较

野生型，pDTM和pSTOP3’末端的gp350DNA的寡核苷酸序列和转译的氨基酸序列以及氨基酸序列显示于下文表2中。箭头表示野生型跨膜区(TM)的起始点和末端。仅来自跨膜区的两个氨基酸保留于pDTM和pSTOP中，即Met₈₆₁和Leu₈₆₂(也参见附图1)。在pSTOP中终止密码子紧接Leu₈₆₂之后，在pDTM中缺失的跨膜区的前面位置标记为“ΔTM”。(在该表中，显示了天然氨基酸)。

表2

3’End of gp350 Wild-Type Sequence

...AAC CTC TCC ATG CTA GTA CTG.....GTC ATG GCG GAC TGC GCC

...Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂Val Leu.....Val Met Ala Asp₈₈₂Cys Ala

↑ ↑

TM start TM end

3’End of pSTOP

...AAC CTC TCC ATG CTA TAG ACT AGT TCT AGG...

...Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂STOP

3’End of pDTM

...AAC CTC TCC ATG CTA GAC TGC GCC...

...Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂ Asp₈₈₂Cys Ala...

ΔTM

实施例2

去除gp350/220基因供体和受体剪接位点以便制备pMDTM和pMSTOP

为了获得均一产生的gp350蛋白质，将gp350/220剪接位点的高度保守和保守碱基改变。在供体剪接位点改变四个碱基，包括在100％的所有剪接位点中出现的高度保守GT对。两个保守的供体位点碱基，AA，被GT取代。将高度保守的(不变)供体剪接位点碱基从GT改变为CA。在受体剪接位点，仅将高度保守的受体剪接位点碱基之一改变以便保存氨基酸序列。如表2显示的将第二个保守的受体剪接位点碱基改变。表3概括了在gp350/220基因的供体和受体剪接位点改变的碱基。

表3EBV gp350/220基因剪接位点的变化供体剪接

donor donor

Wild-type： GAA A↓GT mutant：GAG^*T^*C^*A^*

Glu Ser₅₀₁ Glu Ser₅₀₁

Acceptor Splice slle：

acceptor acceptor

Wild-type： ACA G↓GT mutant：ACT^*GGA^*

Thr Gly₆₉₈ Thr Gly₆₉₈

在突变序列中用星号标记由寡核苷酸碱基诱变改变的碱基。有箭头表示实际的剪接位点，并且显示了所编码的氨基酸。注意没有由于核苷酸取代改变该氨基酸序列。

利用寡核苷酸介导的诱变可完成对野生型gp350/220供体剪接位点和受体剪接位点DNA序列的这些核苷酸取代。按照Zoller，M.E.和Smith，M.(1983)Methods of Enzymol.100：468的方法利用一种修饰的噬菌体载体，M13TAC产生突变。利用多接头上的Asp718和BamHI限制性位点，与含有Asp718和粘性末端的19bp寡核苷酸接头一起将gp350/220核苷酸序列的BamHI/XhoI片段克隆到质粒M13TAC的多接头。利用实施例1的质粒M13DTM和M13STOP(附图2)进行诱变。

将两个42-聚体寡核苷酸，Pr供体1和Pr受体1用于诱变。将每个设计成为与供体或受体剪接位点中间的gp350/220基因序列互补。不与gp350/220基因互补的唯一寡核苷酸区域是代表所需突变的碱基。诱变的寡核苷酸如下：

PrDonorl

PrAcccptorl

将诱变寡核苷酸序列标记为“引物”，而跨越gp350/220基因剪接位点的DNA序列标记为“EBV”。用星号表示由诱变改变的碱基。长划线表示剪接位置。

将寡核苷酸Pr供体1和Pr受体1与单链克隆的M13DTM和M13STOP杂交。将T4DNA聚合酶全酶用于生产双链M13DNA并且用双链DNA转化大肠杆菌。利用载体M13TAC，在X-gal和异硫丙基半乳糖存在下根据颜色从白色变化为蓝色可鉴别含有所需突变的任何克隆。挑取蓝色噬菌体并且使之生长，将跨越剪接接头的DNA测序结果用于最终鉴别突变克隆，称为M13-MDTM和M13-MSTOP。

在鉴别出含有所需突变之后，从M13-MDTM和M13-MSTOP中切割出BamHI/XhoI片段并且连接到pDTM或pSTOP主链以便分别制备pMDTM和pMSTOP构建体。按照实施例3描述将这些构建体转染到CHO细胞以便表达非剪接的变异gp350/220DNA序列。

实施例3

gp350在CHO细胞中的表达

1.gp350/220基因构建体的转染

用于从哺乳动物细胞生产高含量本发明的均一gp350蛋白质的方法涉及构建含有多拷贝异源gp350DNA序列的细胞。将异源DNA序列可操作连接到可控制的标志上，在本实施例中该标志是谷氨酰胺合成酶基因，细胞利用甲硫氨酸sulphoximine可扩增该基因。

按照下文讨论，根据Crockett，Bio/Technology 8：662(1990)和在Celltech Instrution Munual描述的用于谷氨酰胺合成酶基因扩增的系统可将实施例2中制备的pMDTM和pMSTOP载体转染到CHO细胞中。

将CHO-K1细胞(ATCC CCR61)保持于补充了10％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100mg/ml链霉素，MEM(改良的伊格尔氏培养基)非基本氨基酸，和1mM丙酮酸钠(都来自于JRH Biosciences)的无谷氨酰胺的EMEM(伊格尔氏基本必要培养基)。该培养基也补充了60mg/ml谷氨酸，60mg/ml天冬酰胺，7mg/ml腺嘌呤，7mg/ml乌嘌呤，7mg/ml胞嘧啶，7mg/ml尿嘧啶，和2.4mg/ml胸腺嘧啶(都从Sigma获得)。在整个转染期间使用该培养基配方，以及按照该配方制备的衍生物

转染前一天，将3×10⁶CHO-K1细胞播种到10-cm培养皿中。在转染当天，每个培养皿用10ml无血清培养基洗涤细胞。利用常规的CaPO₄沉淀技术得到的质粒DNA。在37℃将各种质粒DNA沉淀个10μg与CHO-K1细胞和2ml无血清培养基一起培养4.5小时。四个质粒DNA转染子个制备三个重复。然后用溶于HEPES-缓冲盐水中的15％甘油将细胞休克1.5分钟。在用无血清培养基洗涤之后，用含有血清的培养基喂养细胞并且培养24小时。

第二天将培养基改变使之含有10％渗析过的胎牛血清(JRHBioscience)并且通过加入25μM甲硫氨酸sulphoximine(Sigma)进行扩增。每隔3-5天再用含有甲硫氨酸sulphoximine的培养基喂养细胞，直到大约13-14天之后扩增的克隆大到足于挑取。通过用一个200μl无菌的移液管嘴从培养皿中刮下菌落而挑取克隆并且转移到96孔平板的一个孔中的没有甲硫氨酸sulphoximine的培养基中。1-2天之后用加了25μM甲硫氨酸sulphoximine的培养基替代孔中的培养基。4天之后收集培养上清液利用ELISA检测法分析蛋白质产物，如下文中讨论的。

还用pEE14对照载体(不含有EBV序列)单独转染CHO细胞，也挑取24个CHO-pEE14并且转移到平板上用作为对照。(基于在甲硫氨酸sulphoximine上能生存而鉴定对照克隆)。

2.ELISA检测

转染之后，挑取241个CHO-pMDTM克隆和158个CHO-pMSTOP克隆并且使之生长。检测这些克隆的上清液中产生的gp350蛋白质。用在50mM硼酸钠缓冲液，pH9中稀释2000倍的亲和纯化的兔抗gp350/220抗体(抗体MDPE；Andrew Morgan赠送)包被96孔平板。将该平板在37℃培养3-4小时并且利用一个Nunc Immuno洗涤器用PBS+0.05％吐温20洗涤3次。在吸干之后，在37℃用溶于PBS+0.01％Thimerosal中的2％BSA培养封闭该平板半小时并且再次洗涤。将转染细胞和对照细胞的上清液加到这些孔中并在37℃培养2小时。然后在37℃用在PBS洗涤缓冲液中稀释的1mg/ml的一级检测抗体，一种抗gp350/220的鼠单克隆抗体(抗体#C65221M：BiodesignInternational)培养该平板1小时。洗涤之后在37℃用溶于PBS+0.05％BSA和0.01％Thimerosal中的0.7μg/ml抗鼠免疫球蛋白的辣根过氧化物酶结合的羊F(ab)₂片段(人Ig吸附的；BiosourceInternational)二级抗体培养该平板1小时。在室温下用溶于稳定的过氧化物底物缓冲液(Pierce Chemicals)的ABTS(Pierce Chemicals)洗涤该平板并且显色半小时。用1％SDS终止反应，利用MolecularDevices Vmax ELISA平板计数器在405和650nm波长处对该平板进行计数。24个pMDTM和18个pMSTOP克隆检测为分泌gp350的阳性。将显示最强ELISA信号的克隆转移到24孔平板上并且进一步在Western Blot和放射免疫沉淀分析中检测。

3.Western Blot和放射免疫沉淀分析中检测

在开始筛选时，在Western Blot中分析pMDTM转染的组织培养上清液的活性。在5％SDS-PAGE凝胶上纯化CHO细胞上清液，转移到硝酸纤维素膜过夜，并且用抗gp350抗体探测。发现7个pMDTM克隆在Western Blot分析中显示gp350阳性。

进一步采用存在gp220的放射免疫沉淀方法检测在Western Blot分析中显示阳性的pMDTM克隆。在6个平板孔中将选出的转化pMDTM细胞，pEE14对照和GH3Δ19对照细胞(下文描述)培养过夜以便在试验当天有3/4的细胞汇合。每个孔大约含有5×10⁶细胞。为了进行标记，从每个孔中除去培养基并且用0.7ml添加了100μCiS³⁵甲硫氨酸的无甲硫氨酸MEM(10％胎牛血清)替代。在37℃将细胞培养5.5小时，然后以4000rpm微离心5分钟。通过加入10μlSepharose-蛋白质A(Sigma)和20μl单克隆抗gp350/220(抗体#C65221M：Biodesign International)在4℃旋转过夜而将上清液中的均一gp350蛋白质免疫沉淀。然后在室温下微离心机中以2000rpm沉淀该混合物2分钟，用数倍体积的磷酸缓冲盐水洗涤4次。在最后洗涤之后从沉淀中除去所有的液体并且用50μl蛋白质凝胶样品缓冲液替代。将含有沉淀的免疫复合物的样品煮沸5分钟并且在5％SDSPAGE上电泳。免疫沉淀物相当于与蛋白质样品缓冲液以1∶1混合的组织培养上清液的凝胶样品。将该凝胶干燥并且用Hyperfilm β-Max(Amersham)放射自显影。

附图3显示放射免疫沉淀的SDSPAGE分析的放射自显影结果。用作为阳性对照的细胞系是GH3Δ19(Elliot Keiff赠送：Whang，等人，1987)。GH3Δ19细胞分泌失去了转膜和C末端胞质区的截短形式的gp350/220蛋白质。为了用作为阴性对照，单独用pEE14载体转染CHO细胞并且同时用pMDTM转染通过甲硫氨酸sulphoximine选择。在附图3，奇数泳道显示上清液(“S”)，偶数泳道显示免疫沉淀(“Ip”)。在对照泳道2，来自GH3Δ19对照细胞的沉淀产生约220和350KD的两个强蛋白质谱带，表明以1∶1的比例产生截短的剪接变体gp350和gp220蛋白质。正如所期望的在泳道1这些免疫沉淀谱带集中了放射标记的组织培养上清液(非免疫沉淀样品)。也正如所期望的由于pEE14载体不含有gp350/220构建体，在阴性对照没有显示任何谱带(泳道4)。

在泳道6，8和10来自pMDTM克隆上清液的免疫沉淀的SDSPAGE分析结果显示有一个约350KD的单一强谱带，相当于对照泳道2中的GH3Δ19对照的较高分子量种类。但是与GH3Δ19对照泳道相反，泳道6，8和10没有另一个约220KD的强谱带，虽然泳道8显示迁移在稍微较低分子量的一个较微弱的谱带。这可能代表一种降解产物，一种共沉淀的细胞产物或者由于错翻译或突变产生的少量gp220蛋白，所述突变将缺失的供体和受体剪接位点返回到天然的核苷酸或氨基酸序列。在其它5个所检测的MTDM重复中发现约350KD处的强单谱带(资料未显示)。

在泳道6和泳道10完全没有220KD的谱带是由于来自MDTM上清的无效沉淀是不可能的，因为在S³⁵-标记的GH3Δ19对照泳道(2)容易观察到220KD的谱带。利用含有野生型剪接位点的实施例1的pDTM构建体进行另一个分析结果显示在350和220KD处有两个强谱带。因此这些结果证明剪接位点的缺失导致产生没有gp220蛋白的gp350蛋白。

对在CHO细胞系，或其它的哺乳动物或非哺乳动物细胞系中表达的均一gp350蛋白质进一步测量，利用本领域内已知的方法包括例如凝集素亲和层析，反相HPLC，FPLC，凝胶过滤等等技术从细胞系的限制性培养基分离或纯化均一gp350蛋白质。参见Dayid，J.Immunol.Methods 108：231(1988)和Madej，Vaccine 10：777(1992).

4.pMDTM蛋白质的Northern Blot分析法

在该试验中我们采用Northern Blot分析法证明MDTM-1细胞制备gp350 RNA和不制备gp220RNA，在另一个水平上证实剪接位点突变阻碍了gp220产生。

从pDTM制备与gp350互补的DNA探针，参见实施例1.分离464bp XhoI/PstI pDTM片段形式的gp350/220探针模板XP464。XP464识别gp350和gp220。为了制备gp350特异性探针AN537，用NcoI和NdeI切割pDTM，分离两个重叠的580bp片段，用XmnI切割该混合物以去除污染片段并且用AluI切割产生位于gp350/220剪接位点内部的一个537bp Alu/NdeI片段。AN537特异于gp220之外的剪接区，因而特异于gp350信使。利用DNA片段XP464和AN537采用³²P-dCTP缺口转译(Amersham)标记DNA探针。

基本上按照Chomczyunski和Sacchi，Anal.Biochem.，162：156-59(1987)的方法制备总细胞RNA.从CHO-pEE14(阴性对照细胞系，参见实施例1)，CHO-MDTM-1和CHO-DTM-7细胞，90％铺满，各两个T-250培养瓶吸取培养基，裂解细胞并且刮入到变性缓冲液(10ml 4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7，0.5％sarkosyl，100mM 2-巯基乙醇)。10ml裂解液中各补充1ml 2M乙酸钠，pH4，10ml饱和酚，pH4.5，和2ml氯仿/异戊醇；将裂解液在冰上放置15分钟，在4℃以10000×g旋转20分钟，除去上层水相。通过加入1倍体积的异丙醇在4℃从水相沉淀RNA 1小时，在4℃形成沉淀，重悬于变性缓冲液并且再沉淀。在70％乙醇中将RNA洗涤1次，在Speed-Vac中干燥并且重悬于DEPC处理的水中.

在15％甲酰胺和6％甲醛中，65℃将DTM-7和MDTM-1总细胞RNA变性15分钟，在1％琼脂糖/6.6％甲醛凝胶上电泳，并且通过毛细作用转移到硝酸纤维素膜上并且用标记的XP464和AN537探测，通过煮沸5分钟使DNA探针变性，在65。C的5×SSPE中杂交过夜，在高严谨条件下洗涤硝酸纤维素膜。利用Bio-Rad磷光体成象仪(phospho image)进行放射自显影。

来自CHO-MTDM细胞的总细胞RNA的Northern印迹显示剪接突变在阻碍gp220特异性RNA产生中的效果。正如对于gp350特异性探针预期的，gp350特异性探针，AN537仅结合到MDTM-1和DTM-7细胞中的一种类型的RNA上(附图4，泳道1和2)。特异于gp350和gp220RNA的XP464探针识别DTM-7的两个类型和MTDM-1的单个较高分子量谱带(附图4，泳道4和3)，正如所预期的，如果剪接突变阻碍，MTDM中产生gp220信使。即使对于gp350特异性RNA，MTDM泳道过载，没有清晰的gp220RNA观察到。MTDM-1和DTM-7泳道中gp350信使的表观移动有差异的原因尚不知。与DTM-7相比，MTDM-7类型过载，影响其在凝胶上的迁移。在凝胶上gp350信使迁移在靠近大核糖体RNA谱带处，这可能影响了表观分子量。或者存在与gp350DNA序列互补的单一类型的情况表明该信号代表gp350RNA。因此，供体和受体剪接位点中的突变有效地阻碍gp220信使的产生，正如Northern印迹判断的。该结果进一步由利用特异于gp350/220的单克隆抗体进行的放射自显影证实，也可以以MDTM-1和DTM-7上清液的Western印迹分析证实。

实施例4

检测均一gp350蛋白质的免疫原活性

将纯化的均一gp350蛋白质掺入到用于给药的合适的赋形剂中并且按照如下所述给药。

根据David，J.Immunol.Methods 108：231(1988)和Allison，J.Immunol.Methods 95：175(1986)的方法，将溶于0.4％(v/v)吐温80Pluronic L121和角鲨烯和(Thr¹)MDP在磷酸缓冲盐水中混合制备2×助剂-赋形剂溶液.

在给药当天通过加入等体积的蛋白质和助剂-赋形剂制备给药组合物.其蛋白质含量应该在5mg-50mg/剂量范围内。

在0，21和42天用3次0.1ml肌内注射免疫接种BALB/c。每次注射10天之后从retro-orbital sinus获取预免疫接种的血或连续取血。

根据实施例3描述的方法采用ELISA测定血清抗体水平。根据Moss，J Gen.Virol.17：233(1972)和De Schryver，Int.J.Cancer 13：353(1974)的方法由其体外抑制EBV转化胎心脏淋巴细胞的能力对血清中的EBV中和抗体进行定量测定。

另一种方法，在0，21，42，63和84天给新西兰白兔肌内注射接种5剂量的在前面所述助剂中乳化的蛋白质。每次接种的剂量应该在约5μg-50μg的范围内。末次剂量注射之后两星期取血清，检测抗体对该抗原的效价，检测对来自B95-8细胞的病毒gp350/220的交叉反应抗体和根据Emini.Virology 166：387(1988)的方法检测体外EBV中和活性

由于已经确立EBV gp350/220蛋白质能够在EBV感染的动物模型中诱导保护性免疫作用，参见Epstein，Clin，Exp.Immunol 63：485(1986)，预期通过以均一gp350蛋白质组合物给药可获得类似的阳性结果。

本文中应用的所有出版物引入本文作参考。前面的详细描述是为了更清楚地了解，不应该认为限制本发明，因为对本领域内技术人员而言，本发明内的修改是显而易见的。

序列表

5(1)一般资料：

(i)申请人：Spaete，Richard and Jackman，Winthrop，T.

(ii)发明名称：gp350/220的非剪接变异体

(iii)序列数：19

(iv)相应地址：

(A)收件人：Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum

(B)街道：5 Palo Alto Square

(C)城市：Palo Alto

(D)州：California

(E)国家：USA

(F)ZIP：94306

(v)计算机可读形式

(A)媒体类型：Floppy disk

(B)计算机：IBM PC Compatible

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release #1.0， ersion#1.25

(vi)现在申请资料

(A)申请号：08/229,291

(B)申请日：April 18，1994

(C)分类：

(Viii)代理人/律师资料

(A)姓名：Luann Cserr

(B)登记号：31,822

(C)档案号：AVIR-003/00US

(ix)电讯资料

(A)电话：415-843-5163

(B)传真：415-857-0663

(C)电传：380816 CooleyPA

(2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单

(D)拓朴：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1

GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA

(2)SEQ ID NO：2的资料

(i)序列特征：

(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单

(D)拓朴：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)SEQ ID NO：2序列描述

GACTGCGCCT TTAGGCGTA

(2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓朴：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3

Asp Cys Ala Phe Arg Arg

1 5

(2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓朴：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4

GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG

(2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5

TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G

(2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6

TATAGACTAG TCTAGG

(2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7

ATCTGATCAG ATCCTTAA

(2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8

AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC

(2)SEQ ID NO：9的资料

(i)序列特征：

(A)长度：13氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9

Asn Leu Ser Met Leu Val Leu Val Met Ala Asp Cys Ala

1 5 10

(2)SEQ ID NO：10的资料

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10

AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG

(2)SEQ ID NO：11的资料

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11

Asn Leu Ser Met Leu

1 5

(2)SEQ ID NO：12的资料

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12

AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC

(2)SEQ ID NO：13的资料

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13

Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂ Asp₈₈₂ Cys Ala

1 5

(2)SEQ ID NO：14的资料

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14

GGTCATGTCG GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG

(2)SEQ ID NO：15的资料

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15

GGTCATGTCG GGGGCCTTAC TTTCTGTGCC

GTTGTCCCAT GG

(2)SEQ ID NO：16的资料

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基

(B)类型：核酸

(C)链：单

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：寡聚体DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16

CTGTGTTATA TTTTCACCTC CAGTTGGGTG

AGCGGAGGTT AG

(2)SEQ ID NO：18信息

(i)序列特征：

(A)长度：3833碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：未知

(ii)分子类型：cDNA

(xi)特点：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：1014..3734

(xi)序列描述

(2)SEQ ID NO：19

(i)序列特征

(A)长度：907氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链：单

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述： SEQ ID NO：19

Claims

1. 生产用于药物组合物的gp350蛋白的方法，包括：

(a)培养用编码非洲淋巴细胞瘤病毒gp350蛋白的DNA序列转化的宿主细胞，所述蛋白具有跨膜区缺失、剩余的羧基末端和/或信号序列缺失，所述DNA序列在一个或多个剪接位点具有突变，防止gp220mRNA转录物的形成；并且

(b)由细胞和培养基中分离表达的均一的gp350。

2. 权利要求1的方法，其中均一的gp350还通过超滤、凝胶过滤、离子交换和疏水相互作用层析分离。

3. 权利要求1或2的方法，其中均一的gp350与可药用载体混和配方。

4. 权利要求3的方法，其中可药用载体是佐剂/抗原呈递系统。

5. 权利要求1的方法，其中所述一个或多个剪接位点的突变是供体剪接位点突变。

6. 权利要求1的方法，其中所述一个或多个剪接位点的突变是受体剪接位点突变。

7. 权利要求5或6的方法，其中至少一个编码SEQ ID NO：18中密码子501的丝氨酸的天然核苷酸被非天然核苷酸取代，至少一个编码SEQ ID NO：18中密码子698的甘氨酸的天然核苷酸被非天然核苷酸取代。

8. 权利要求6的方法，其中所述DNA编码截短形式的EBV gp350，它在跨膜区具有至少8个氨基酸的缺失，产生分泌产物。

9. 权利要求8的方法，其中所述一个或多个剪接位点的突变是供体剪接位点突变。

10. 权利要求8的方法，其中所述一个或多个剪接位点的突变是受体剪接位点突变。

11. 一种含有非洲淋巴细胞瘤病毒gp350蛋白的组合物，其中该gp350蛋白在跨膜区和C末端均具有缺失，该组合物基本不含gp220蛋白。

12. 权利要求11的组合物，其中该组合物与可药用载体混和。

13. 权利要求11的组合物，其中缺失包括SEQ ID NO：18的氨基酸863到907。

14. 权利要求11的组合物，其中gp350蛋白包括SEQ ID NO：18的氨基酸19到862。

15. 权利要求11的组合物，其中gp350蛋白包括SEQ ID NO：18的氨基酸1到862。

16. 一种非洲淋巴细胞瘤病毒疫苗，其中该疫苗由权利要求11、13、14或者15的组合物与药用载体混和制得。

17. 权利要求11、13、14或者15的组合物在制备用于预防非洲淋巴细胞瘤病毒相关疾病或病征的药物中的用途。