CN100406472C - 一种眼镜蛇神经毒素蛋白的融合可溶表达、重组毒素的酸解释放及其生产纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种眼镜蛇神经毒素蛋白的融和可溶表达、重组神经毒素的酸裂解释放及其生产纯化方法，包括天然毒素的理化性质及序列的测定、神经毒素基因的克隆和以融合方式的可溶表达、重组蛋白的融合位点的改造以及重组毒素的酸裂解释放以及纯化；采用本发明所述的用基因工程的方法表达生产重组神经毒素可获得大量可用于临床的重组神经毒素，可以使毒素的来源不受自然条件的制约。

Description

一种眼镜蛇神经毒素蛋白的融合可溶表达、重组毒素的酸解释放及其生产纯化方法

发明领域

本发明涉及的是一种眼镜蛇神经毒素蛋白的融合可溶表达、重组神经毒素蛋白的酸解释放及其纯化方法，属生化领域。

背景技术

蛇毒神经毒素依它们与神经肌肉接头关系的不同分为突触前神经毒素和突触后神经毒素。突触后神经毒素是被研究的最多的一种神经毒素。眼镜蛇突触后神经毒素为一类烟碱样受体的蛋白阻断剂，主要作用于尼克酰胺乙酰胆碱受体(外周N受体)和神经元α7受体。近年来，纯化的眼镜蛇神经毒素蛋白在临床上用于镇痛取得良好的效果，在戒毒治疗方面也展现了良好的应用前景。因此克隆得到眼镜蛇突触后神经毒素基因，研究重组神经毒素的表达有重要的意义。

突触后神经毒素有许多共同点：

1)在结构上十分相似，都具有“三指结构”，二硫键含量高；

2)理化性质相近，全是碱性蛋白，性质稳定，对热及许多化学试剂有抗性，没有酶活性；

3)与受体结合方式相似，专一性强，只能特异结合于尼克酰胺乙酰胆碱受体。

突触后神经毒素根据它们的氨基酸序列和与受体的结合特点可以分为长链和短链神经毒素二种类型。短链神经毒素含有60-62个氨基酸和4对二硫键，它仅与肌型尼克酰胺乙酰胆碱受体有较强的结合力(图1a)。长链神经毒素含有71-74个氨基酸和5对二硫键，它与肌型和α7神经元尼克酰胺乙酰胆碱受体都有很高的结合力(图1b)。长链和短链神经毒素中有4对二硫键的配对是相似的，长链毒素中的第5对二硫键在29-33位氨基酸之间。

突触后神经毒素一级结构的共同特点是分子由60-75个氨基酸组成，含有4-5对二硫键(图1)。一级结构中有一些高度保守的氨基酸，在短链神经毒素中，除8个Cys的位置不变外，Ser-8，Lys-27，Trp-29，Arg-33，Arg-36在大部分毒素中也是保守的。而在长链神经毒素中，除10个Cys外，Lys-23，Trp-25，Asp-27，Arg-33也都是保守氨基酸。

神经毒素的二级结构中不含α螺旋，主要由5条反平行的β-折叠构成，β折叠通过大量的氢键维系在一起，含量达到40％(图3)。

X射线和NMR结构测定的研究结果表明，在晶体和溶液状态的许多神经毒素都具有相似的结构，都是由4个二硫键形成一个疏水核心，从此核心伸出3个由二硫键限定的环(图2，黄色表示Cys及二硫键)，这种结构形象地被称之为“三指结构”(threefingers)，与其他一些具有相似结构的蛋白一起被称为“三指蛋白”。长链神经毒素在中间环的尖端还有一个由第五对二硫键构成的小环(图2b)。它们构象的最主要特点为整个分子是由中间环II的两条片断和环III的片断形成的三链β折叠片层结构(图3)。长链和短链神经毒素结构的最大差别在于长链毒素的环II的环中间有一对额外二硫键，在顶部形成一个小环。

最近的研究表明这对二硫键形成的小环对于长链神经毒素与α7神经元受体的结合是必需的(Servent，D.et al.2000)。

基因工程技术的发展使得通过培养细菌或者真细胞的方法大量生产稀有蛋白成为可能，用基因工程的方法表达生产重组神经毒有两个目的：

1)对神经毒素进行定点突变，研究尼克酰胺乙酰胆碱受体与激活剂和拮抗剂的作用方式，作用位点；同时对长链和短链神经毒素的功能位点与受体结合的功能位点进行研究。

2)获得大量可用于临床的重组神经毒素，可以使毒素的来源不受自然条件的制约。

对蛇类神经毒素的表达主要有两种方式：分泌表达和形成包涵体融合蛋白。分泌表达得率较低，纯化过程复杂，并且一些突变体不能分泌表达；而包涵体表达需进行复性，而后BrCN除去N端融合部分。

Erabutoxin a(Ea)的分泌型融合载体表达融合蛋白ZZ-Ea分泌进入培养基，离心去除菌体，上清0.2μm滤膜过滤，10,000Dalton膜超滤，IgG-Sepharose亲和纯化，融合蛋白冻干溶于0.1N盐酸中，500倍过量BrCN裂解后，依次反向柱纯化，离子交换纯化。最终重组蛋白得率为每升培养液为0.025～0.5mg。用该方法生产Erabutoxin的系列突变体，详尽研究短链神经毒素与nAChR受体结合的功能位点(Trēmeau，o.et al.1995)。

对a-cobratoxin的表达是将基因克隆入pCP载体中，由E.coli菌株BL(DE3)融合表达，融合蛋白由IgG-Sepharose亲和纯化，BrCN裂解，复性，反向C4柱纯化。重组蛋白得率为每升培养液为0.5～1.2mg。生产表达的重组α-cobratoxin和它的突变体，用以研究长链神经毒素的功能位点(Antil，S.et al.1999；Servent，D.et al.2000)。

Cobrotoxin用pET20b(+)表达后，形成包涵体，用变性剂溶解，复性，高效液相纯化，但于BrCN同时裂解融合肽，导致重组的神经N端不均一，用带的N端融合肽的重组神经毒素研究Cobrotoxin的异构化(Chang，L-S.et al.1999)。

三种同源的眼镜蛇神经毒素用pET28b+进行表达，表达的重组蛋白形成包涵体，用盐酸胍溶解，经两步透析复性，将带有融合肽的重组蛋白冻干浓缩，用于测定毒素的小鼠的致死毒性(Zhong，X-Y.et al.2000)。

为了具体进行本发明的后续工作，研究人员首先对本发明涉及的天然眼镜蛇神经毒素的理化性质及序列进行测定。

在上述测定中，眼镜蛇神经毒素冻干粉由济南军区药品生物制品研究提供。乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水(18.2MΩ)。毛细管电泳柱75μm×57cmFS为Supleco公司产品。福氏佐剂(Freund`s Adjuvant)为Gibcol公司产品。TFA，TEMED，过硫酸铵，丙烯酰胺和N，N′-甲叉双丙烯酰胺购自Sigma公司。SDS-PAGE低分子量蛋白标准购自上海丽珠东风生物技术有限公司。

所使用的电泳仪为Amersham Pharmacia公司产品，Mini proteinII型电泳槽及制胶模具为Bio-Rad产品。蛋白测序仪为PE公司ABI 337Sequencing，质谱仪为英国Autospec-UltimaETOF。毛细管电泳仪为Beckman P/ACE System 5000。高效液相色谱HPLC为Shimazu公司产品。反向色谱柱为ZORBAX 300SB-C8。GDS-8000凝胶图像处理系统为UVP公司产品。

具体的实验方法如下：

SDS-PAGE电泳

溶液配制：丙烯酰胺溶液(30％)：取丙烯酰胺60g与N，N′-甲叉双丙烯酰胺1.6g，加水溶解，定容至200ml，滤纸过滤，棕色瓶中避光保存。

分离胶缓冲液：取Tris 36.3g，加水70ml溶解，盐酸调pH至8.8，定容至100ml。

浓缩胶缓冲液：取Tris 6.0g，加水70ml溶解，盐酸调pH至6.8，定容至100ml。

电极缓冲液：取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，加水800ml溶解后，定容至1000ml。

SDS溶液(20％)：取SDS 20g，加水70ml溶解，定容至100ml。

过硫酸铵液(10％)：取过硫酸铵1g，加水8ml溶解，定容至10ml。

溴酚蓝溶液(0.1％)：取0.1g溴酚蓝100ml容量瓶中，加水溶解，定容至刻度。

2X样品缓冲液：取浓缩胶缓冲液2.5ml，20％SDS溶液2.5ml，0.1％溴酚蓝溶液1.0ml，甘油3ml，巯基乙醇1.0ml，混匀，密闭，4℃保存。

固定液：取冰乙酸400ml，甲醇100ml，加水500ml混匀。

脱色液：取冰乙酸100ml，加水900ml，混匀。

染色液：取考马斯亮蓝G-250  0.1g，溶于500ml脱色液中，充分溶解后，过滤除去不溶物，密闭保存。

凝胶制备：16％分离胶制备：安装垂直板制胶模具，将分离胶液(丙烯酰胺溶液：分离胶缓冲液：SDS溶液：过硫酸铵溶液∶水∶TEMED＝5.0∶1.52∶0.08∶0.1∶5.3∶0.01)灌入模具内，至玻璃顶部约3cm处。用水封顶，聚合完毕，倾去水层。

浓缩胶的制备：在分离胶上灌入浓缩胶液(丙烯酰胺溶液∶浓缩胶缓冲液∶SDS溶液∶过硫酸铵溶液∶TEMED∶水＝0.83∶1.25∶0.025∶0.05∶0.005∶2.37)，插入样品梳，聚合完毕，小心取出样品梳。

样品制备：取样品溶液适量，加入等体积的2X样品缓冲液，95℃水浴5分钟，冷却后，离心，备用。

上样及电泳：上下电泳槽加入电极缓冲液，每个样品分别加入20μl样品和分子量标准蛋白，设起始电压为80V，待溴酚蓝带出浓缩胶后，调电压至120V，继续电泳至溴酚蓝距玻璃板边缘为1cm时，停止电泳。

固定，染色及脱色：电泳结束后，取下玻璃板，凝胶加入适量固定液，室温固定30分钟。倒掉固定液，加入适量染色液，染色1小时后，倒掉染色液，用脱色液脱色至背景透明。换水浸泡，停止脱色。

图象处理：用图象处理系统对凝胶进行成像，蛋白纯度分析和定量。

反向液相色谱：

流动相A：0.1％TFA有水溶液；B：含0.1％TFA，80％乙腈的水溶液

色谱柱：ZORBAX 300SB-C8

柱温：36℃

流速：1.0ml/min

进样体积：50μl

洗脱方式：起始用100％A平衡色谱柱15分钟后，以1％B/min增加B至60％，维持10分钟，然后100％B洗柱10分钟后。恢复初始状态，二级管阵列全波长检测。

毛细管自由区带电泳：以0.1mol/L的pH2.5磷酸盐缓冲液为电极液，毛细管为75μm×57cmFS，柱温设为25℃，运行电压为1.4kV，进样：压力0.5psi，5秒，紫外检测器波长为210nm。

N端氨基酸序列测定：对蛋白中的Cys进行衍生化处理后，依仪器标准操作程序进行，采用PVDF膜固相Edman测序法。

质谱：经脱盐的样品溶于含50％甲醇，0.1％的乙酸的水溶液中，依仪器标准程序电喷雾进样，正离子检测。

实验所得到的眼镜蛇神经毒素分子量，纯度及紫外光谱特征如下：

SDS-PAGE电泳测定的神经毒素表观分子量为16，500daltons，其纯度大于95％(图4)。而电喷雾质谱测定其分子量为6946daltons(图5)。Chang，L.S.等(1996)认为cobrotoxin的23-28位氨基酸之间的片断与其他残基的相互作用导致这类神经毒素电泳的异常。

自由区带毛细管电泳纯度大于98％(图6)。反向高效液相色谱测定纯度大于98％(图7a)，主峰保留时间在24.3min，主峰的全波长扫描(190-800nm)特征吸收在202nm和276nm(图7b)。

眼镜蛇神经毒素的N端序列：测定的神经毒素N端15个氨基酸序列为Leu-Glu-Cys-Hi s-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Thr-Pro-Thr-Thr-Thr(序列1)。

本发明所采用的天然眼镜蛇神经毒素为从湖南产中华眼镜蛇蛇毒中提取纯化的，为白色无定形冻干粉末，易吸湿潮解，在-20℃密闭保存。

对它从三方面进行纯度及性质分析：SDS-PAGE，RP-HPLC和毛细管自由区带电泳。用不同方法测定的纯度均大于95％，蛋白序列测定要求纯度大于95％，符合蛋白序列测定的要求。同时获得了在C8柱的色谱保留特征和毛细管区带电泳的迁移特征。在276nm有特征吸收，说明蛋白有芳香族氨基酸。由于神经毒素异常的电泳行为，进行电喷雾质谱测定其确切分子量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种眼镜蛇神经毒素蛋白的融合表达、重组眼镜蛇神经毒素蛋白的酸解释放及其生产纯化方法。

以下是本发明所述方法的详细内容，通过以下内容并结合图及其说明，可以清楚地了解本发明。

一、一种眼镜蛇神经毒素基因的克隆及其在三种不同E.coli载体中的表达研究

基于蛋白质个性的丰富多样，没有一种载体对所有蛋白的表达是通用的，适用于表达某种蛋白的载体对另一种蛋白则未必适合，所以本发明通过以下实验寻找适合本发明所述目的蛋白的表达载体。

1、材料及仪器

1.1试剂及耗材

总RNA(核糖核酸)提取试剂盒RNeasy Mini Kit为德国QIAgen公司产品，反转录PCR(聚合酶链反应)试剂盒SUPERSCRIP^TM ONE-STEP^TM RT-PCR System购自Gibcol公司。小量及大量质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司。DNA PCR System和AP偶联羊抗兔抗体为华美生物工程公司的产品。引物由上海生工生物工程公司合成。内切酶购自美国New England Biolab公司。T4DNA连接酶购自德国Boehringer Mannheim公司。pGEM-T Easy Vector System为Promega公司产品。PVDF膜购自Gelman公司。酶标板为Nunc 96孔平底板。

1.2菌株及质粒

E.coli BL21购自Amersham Pharmacia公司。E.coli菌株TOP 10，pBAD/gIII载体为Invitrogen公司产品。融合表达载体pThioHis C由本所疫苗二室提供，载体pBV220和E.coli菌株DH5α，HB101由军事医学科学院八所提供。

1.3仪器

PCR仪为英国Techne公司Cyclogene Thermal Cycler，Multiphor II电转装置为Amersham Pharmacia公司产品。

2、实验方法

2.1眼镜蛇毒腺总RNA(核糖核酸)提取

蛇毒腺提取：湖南产中华眼镜蛇平皿法采蛇毒液后，断头法处死，迅速摘取两侧毒腺，去掉附带肌肉后投入液氮中，速冻。液氮中保存。

总RNA(核糖核酸)提取依RNeasyMini Handbook进行。

2.2PCR(聚合酶链反应)引物设计

根据测定的神经毒素N端15个氨基酸的序列，用Blast Search检索同源蛋白。分析同源蛋白序列，找出保守氨基酸及相应核苷酸序列，由同源蛋白cDNA两侧保守区，设计RT-PCR引物，应用Primer Calculator软件对引物进行评估。选取最佳的一对引物进行合成。

引物1：5’ATG CTG GAA TGT CAC AAC CAA C(序列2)

引物2：5’CTA ATT GTT GCA TCT GTC TGT T(序列3)

根据评估结果设定PCR(聚合酶链反应)反应常数。

2.3RT-PCR

按试剂盒说明依次加入25μl反应缓冲液，正向及反向引物各1μl，1-5μl总RNA(核糖核酸)，1μl逆转录酶和Tap酶混合物，加水至总体积为50μl。50℃温育35分钟，94℃热变性2分钟，完成反转录；以94℃变性30秒，41℃退火30秒，72℃延伸26秒，进行40个循环。最后一个循环延伸时间为7分钟。电泳检查扩增结果。

2.4T-A载体克隆及测定

分别取RT-PCR产物0.2，1.0μl，加5μl 2x连接缓冲液，1.0μl pGEM-T Easy载体，1.0μl T4-DNA连接酶，加水至总体积为10μl。室温连接3.5小时。取连接产物2-8μl转化感受态的JM109 E.coli细胞，以质粒pGEM-5f转化受体菌为阴性对照，涂布IPTG/X-Gal平板，37℃培养至长出单菌落，进行蓝白筛选。挑选白色菌落，提取质粒，Ecorl酶切初步鉴定。测定插入片断全序列。

2.5克隆入融合表达载体pThioHis C及融合蛋白的诱导表达

2.5.1神经毒素基因两端分别加Kpn I和Sal I位点(阴影中的碱基序列)

正向引物5’CGG CTG GAA TGT CAC    (序列4)

反向引物5’GGC

TTA ATT GTT GCA TCT(序列5)

以含神经毒素基因的T载体为模板进行PCR(聚合酶链反应)扩增，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸26秒，反应40个循环。Kpn I和Sal I酶切PCR(聚合酶链反应)产物，回收DNA，作为插入片断。

2.5.2载体双酶切及连接转化

pThioHi s C载体提取，Kpn I和Sal I双酶切，载体胶回收等，依常规程序进行。电泳估计酶切载体及插入片断的浓度，以不同量的载体与等量的插入片断进行连接反应，转化感受态TOP 10 E.coli，37℃培养至长出单菌落，挑选几个单菌落测序，确定插入片断正确连入载体中。

2.5.3神经毒素融合蛋白的诱导表达

接种单菌落至50mlLB液体培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日以1∶50接种至新鲜LB培养基，继续振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.5。加入IPTC至终浓度为1mmol/L，继续培养四个小时。在加入IPTC前和加入后每隔1小时取0.1ml菌液，离心，弃去上清，菌体分别标记为0，1，2，3，4，5小时的诱导表达产物。加入2x SDS-PAGE上样缓冲液0.1ml，充分混匀，95℃水浴加热10分钟。20μl上样，电泳检查。

2.5.4融合蛋白的渗透休克释放

接种单菌落至50mlLB液体培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中，30℃，200rpm振荡培养过夜。次日以1∶50接种至新鲜LB培养基，37℃振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.5。加入IPTG至浓度为1mmol/L。继续振荡培养5小时。测定菌体OD₆₀₀值，4℃ 6,000rpm离心收集菌体，弃上清，将菌体悬浮于适量冷渗透休克1#溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA，20％蔗糖)，使菌体密度OD₆₀₀约为5.0，冰水浴，10分钟。离心，弃去上清，菌体悬浮于等量的冷渗透休克2#溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA)，冰水浴，10分钟。4℃ 10,000rpm离心15分钟，取上清，-20℃冻存。蛋白电泳检查。

2.5.5不同宿主菌对融合表达的影响

得取含神经毒素基因的pThioHis C载体，转化E.coli BL21，诱导表达，渗透休克按2.5.4节所述。比较E.coli菌株TOP 10和BL21对融合蛋白表达的差异。

2.6分泌型载体pBAD/gIII表达神经毒素

2.6.1实验设计

pBAD/gIII载体插入区域为：--BamHI--信号肽-NdoI-Ec1136I-XhoI-XbaI，设计引物a1，a2扩增出片断a：BamHI一信号肽-XboI

神经毒素基因5’端密码子转换，不改变编码氨基酸，增加XhoI位点，3’端增加XbaI位点，设计引物b1，b2扩增出片断b：XhoI---神经毒素基因--XbaI

(序列6)                                        (序列7)

将扩增出片断a和b通过Xho I连接，形成片断c：BamHI---信号肽-神经毒素基因-XbaI，以此片断为模板，以a1，b2为引物大量扩增片断c。BamHI和XhoI双酶切片断c和载体质粒pBAD/gIII，连接，将神经毒素基因恰好插入信号肽之后，构建完成分泌型表达质粒。

2.6.2表达质粒构建

合成引物

a1：5’CGC GGA TCC TAC CTG ACG CTT(序列8)

a2：5’CCG CTC GAG GCT ATG GCT AT(序列9)

b1：5’CCG CTC GAG TGT CAC AAC CAA C(序列10)

b2：5’GC TCT AGA TTA ATT GTT GCA TCT GT(序列11)引物溶于无菌纯水浓度为50pmol/L.

扩增片断a：0.5μl模板pBAD/gIII，引物a1，a2各0.5μl，PCR(聚合酶链反应)缓冲液5μl，dNTP 4μl，加上50μl，混匀。94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸26秒，反应40个循环。

扩增片断b：0.5μ模板含神经毒素基因的pGEM-T载体，退火温度为58℃，其它条件同扩增片断a。

片断a和b连接：依常规操作进行，扩增产物纯化，XhoI酶切。电泳估测a和b的浓度，以1∶1设置连接反应，4℃，T4DNA连接酶连接过夜。

a和b连接片断扩增：取连接产物1.0μl模板，引物a1和b2各0.5μl，退火温度为55℃，其它条件同扩增片断a。片断a和b连接产物为c。

载体与插入片断的连接，转化及筛选：片断c用BamHI和XhoI双酶切，纯化后作为插入片断。pBAD/gIII用BamHI和XhoI双酶切，凝胶电泳分离回收大片断。分别插入片断0.1，1.0μl，与5μl载体混匀，加1.0U T4DNA连接酶，4℃，连接过夜。转化感受态TOP 10受体菌，涂布平板，37℃培养18小时，挑选单菌落，酶切鉴别插入子，测序。

2.6.3神经毒素的诱导表达

接种单菌落至10mlLB液体培养基(50μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养。次日1∶50转接至新鲜的6支4ml LB液体培养基，继续振荡培养至菌体密度OD₆₀₀约为0.5。分别加入阿拉伯糖至浓度为0.2％，0.02％，0.002％，0.0002％，0.00002％，另一个为空白对照。继续培养4小时后，4℃高速离心收集菌体。1)SDS-PAGE电泳检查表达情况。2)全菌超声冻融法破碎，检查表达蛋白是否可溶。3)渗透休克法检查表达蛋白是否可以周质腔释放。

2.7温度诱导型装载体pBV220对神经毒素的表达

2.7.1神经毒素基因两端加EcoRI和sal I位点及起始密码ATG合成引物

5’CGG GAATTC GAT TAT GCT GGAATG(序列12)

5’GGC GAC GAC TTA ATT GTT GCA TCT(序列13)

携带神经毒素基因的T载体为模板1.0μl，退火温度为50℃，其他条件同2.6.2节所述。电泳检查，纯化PCR(聚合酶链反应)产物。

2.7.2表达载体的构建

PCR(聚合酶链反应)产物及质粒pBV220用EcoR I和sal I双酶切，纯化，连接，转化E.coli DH5α如2.5.2所述进行。

2.7.3神经毒素基因的热诱导表达

接种单菌落至10mlLB液体培养基(50μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养。次日1∶50转化至新鲜LB液体培养基，继续振荡培养至菌体密度OD₆₀₀约为0.5。升高温度至42℃，继续培养4小时，每隔1小时1ml菌液，离心收集菌体。1)SDS-PAGE检查神经毒素表达情况。2)超声冻融法检查表达蛋白是否可溶。

2.8免疫印迹(western blot)检查鉴定表达的重组神经毒素

2.8.1天然眼镜蛇神经毒素兔抗血清制备

取神经毒素适量，配成1.0mg/ml的浓度，甲醛减毒处理后，与适量完全佐剂混匀乳化，皮下注射免疫新西兰种白兔，适时强化免疫。心脏取血，离心分离抗血清。

2.8.2间接ELISA检查抗血清中神经毒素抗体

神经毒素溶于PBSN溶液中(含0.5％NaN₃PBS)中，制成1μg/ml和2μg/ml的溶液，以50μl/孔点酶标板，轻弹使抗原均匀分布，保鲜膜封好，室温温育过夜。纯水洗板3次后，加封阻液(含0.05％Tween 20，1mmol/L EDTA，0.25％BSA，0.05％NaN₃的PBS)室温放置1小时。纯水洗板3次后，将抗血清及对照血清分别用PBSN溶液4倍比系列稀释，取50μl加到每个包被孔中。保鲜膜封好，室温温育过夜。纯水洗板3次。加用PBSN以1∶200稀释的AP偶联羊抗兔抗体50μl/孔，室温温育2小时后，洗板3次。每孔加显色液(66μl 5％NBT溶于70％二甲基甲酰胺，33μl 5％BCIP溶于100％二甲基甲酰胺，在10ml封阻液中混匀)50μl显色。酶标仪在550nm测定每孔的吸收值。

2.8.3免疫印迹

按标准程序(奥斯伯等，1998)进行作如下修改：用PVDF膜，以0.8mA/cm²的电流转移1.5小时，抗血清以1∶200稀释，酶标抗体为AP偶联羊抗兔抗体，以1∶500稀释。显色时间为30分钟。

3、实验结果

3.1天然毒素蛋白的同源性检索及引物设计

根据神经毒素N端15个氨基酸的序列，Blast Search检索同源蛋白结果如下，共检索到22个蛋白序列。

Database：nt

807,597sequences；2,863,827,885totallettersRID：983778928-6701-21870

成熟毒素蛋白的N端和C端用阴影框出。这10种蛋白分别来源于：

1 AJ239050 Naja naja atra mRNAfor cobrotoxin homolog

2 U42582   Naja atra cobrotoxin mRNA，complete cds

3 AF161797 Naja atra short chain neurotoxin precursor，gene，complete cds

4 AF068052 Najaj naja neurotoxin preprotein precursor，mRNA，complete cds

5 U77492   Naja atra cobrotoxin```mRNA，com plete cds

6 AF088998 Naja atra cobrotoxinIII mRNA，partial cds

7 AF023271 Naja sputatrix post synaptic alpha neurotoxin precursor(ntx)mRNA，ntx-3allele，complete cds

8 AF031472 Naja atra cobrotoxin mRNA，complete cds

9 AF088997 Naja atra cobrotoxinIV mRNA，partial cds

10 AF096999 Naja sputatrjx post synaptic alpha neurotoxin precursor(ntx)gene，ntx-1allele，complete cds

这些神经毒素属于眼镜蛇科(Elapidae)的眼镜蛇属(Naja)的眼镜蛇舟山亚种(Najanaja atra Cantor)和Naja sputatrix，都具有较高的同源性，它们的N端和C端保守性都很强。根据它们N端和C端的碱基序列设计合成引物，由Primer Calculator评估，挑选最佳的一对引物，结果如下：

    Forward Primer                      Reverse Primer

ATGCTGGAATGTCACAACCAAC                TTGTCTGTCTACGTTGTTAATC

A-8(36.36％)C-6(27.27％)              A-3(13.64％)C-4(18.18％)

G-4(18.18％)T-4(18.18％)              G-6(18.18％)T-9(50.00％)

Length-22 bases MW-6709daltons(g/M)   Length-22bases MW-6694daltons(g/M)

         T_m                                T_m

Nearest Neighber T_m      62.12        Nearest Neighber T_m    52.23

％GC method T_m           52.97        ％GC method T_m    49.25

2(A+T)+4(G+C)T_m          64.00        2(A+T)+4(G+C)T_m    60.00

    Forward Primer                            Reverse Primer

Primers may fold and anneal against themselves.A likely folding scenario is displayed below.

    5`-ATGCTGGAATGT3`                   5`-TTGTCTGTCTAC3`

            | |                             ||  |

  3`CAAC-CAA CAC 5`                    3`CTAATTGTTG

Primers may anneal with other copies of themselves.Below is a candidate a“gnment.

5`ATGCTGGAATG TCACAACCAAAC3`5`TT G TCTGTCTA CGTTGTTAATC3`

    | |||      | ||| | |            |  |  |  |||| | |   |

3`---CAACCAAC-ACTGTAAGGTCGTA 3`--CTAATTGTTGCATCTGTCTGTT 5`

Forward primers may anneal with reverse primers.A likely alignment is shown below.

                         5`--ATGCTGGA ATGTCACAACCAAAC3`

                             |   | |     | ||||  |

                        3`TTGTCTGTCT--A--CGTTGTTAATC5`

3.2神经毒素基因的克隆及全序列

提取的蛇毒腺总RNA(图8)及RT-PCR结果(图9)，扩增的主带大小约为200bp。装入pGEM-T Easy载体，转化JM109感受态细胞，携带插入片断的重组质粒呈白色，而空白质粒呈蓝色或浅蓝色。平板上白色菌落约占98％。由于pGEM-T Easy载体插入点两边各有一个EcoRI位点。挑选8个白色菌落快速提取质粒，EcoRI酶切鉴定都含有插入片断(图10)。

克隆的PCR产物片段及相邻pGEN-T Easy载体序列如下：(序列24)

GAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGG

GATTATGCTGGAATGTCACAACCAACAATCATCGCAAACTCCAACCACTACAGGTTGTTCAGGTGGGGAGACCAATTGCTATAAAAAGCGTTGGCGTGATCACCGTGGATATAGAACCGAGAGGGGATGTGGTTGCCCTTCAGTGAAGAACGGCATTGAAATTAACTGTTGCACAACAGACAGATGCAACAATTAGAATCACTAGT

GCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC虚线加框区为载体的EcoRI位点，加黑碱基为反转录引物。插入片断编码区为：(序列25，其中的纯氨基酸序列为：序列26)

ATG CTG GAA TGT CAC AAC CAA CAA TCA TCG CAA ACT CCA ACC ACT

     L   E   C   H   N   Q   Q  S    S   Q  T    P  T   T

ACA GGT TGT TCA GGT GGG GAG ACC AAT TGC TAT AAA AAG CGT TGG

 T   G   C   S   G   G   E   T   N   C   Y   K   K  R   W

CGT GAT CAC CGT GGA TAT AGA ACC GAG AGG GGA TGT GGT TGC CCT

 R   D   H   R   G   Y   R  T    E  R   G   C   G   C   P

TCA GTG AAG AAC GGC ATT GAA ATT AAC TGT TGC ACA ACA GAC AGA

 S   V   K   N   G  I   E   I   N   C   C   T   T   D   R

TGC AAC AAT TAG

C  N  N    stop

克隆的PCR产物5’端编码氨基酸序列与神经毒素N端15个氨基酸序列相同，将碱基全序列转译为氨基酸序列，全序列与基因库中cobrotoxin序列相同，含有该序列的p-GEM-T Easy载体命名为pGEM-NT。

3.3神经毒素在pThioHisC中的融合表达

3.3.1融合表达载体的构建

通过PCR反应在神经毒素蛋白基因两端增加两个限制性内切酶位点，从而将毒素蛋白基因连入载体中，序列测定证明神经毒素基因正确连入载体中，构建的重组质粒pTN314如图11A。表达的融合蛋白由硫氧还蛋白，肠激酶识别位点，神经毒素蛋白3部分组成。神经毒素蛋白N端有两个冗余的氨基酸Val和Pro。

3.3.2融合蛋白的诱导表达

重组质粒pTN314有强启动子Ptrc，可由IPTG诱导融合蛋白。当细胞生长到对数中期，OD₆₀₀舶约为0.5时，加入IPTG至终浓为1mmol/L。随着培养时间的增加，融合蛋白的表达量也增加，培养5个小时后，融合蛋白表达量最大，约占菌体总蛋白的28％(图12)，诱导时间与菌体生长密度，融合蛋白表达量和融合蛋白占菌体中总蛋白的相对量的关系见图13。在诱导后1小时内和第2-3个小时内，为融合蛋白表达量急剧增长期，而在诱导3小时后，表达量趋于稳定。菌体密度在诱导3小时后也基本稳定，但表达蛋白量继续增加。因此选择诱导后培养4小时收集菌体。

3.3.3融合蛋白的渗透休克纯化及不同菌株的表达差异

收获的菌体经两次渗透休克释放融合蛋白，第一次约释放总融合蛋白量的75.7％，第二次约释放7.5％，约有16.8％的融合蛋白残留在细胞中未被释放。在第一次的渗透休克液体中，融合蛋白约占总蛋白的65％。

为了研究在不同菌株中该质粒的表达，选择转化蛋白酶缺陷的E.coliBL(21)株，结果发现该菌株也能高效表达融合蛋白，用渗透休克纯化，释放的融合蛋白量小于15％，80％的融合蛋白保留在细胞中(图14，lane1-3)。

渗透休克是一种简洁而高效的纯化融合蛋白的方法，经过一步纯化，将蛋白释放到低离子强度的缓冲液中，易于进行下一步纯化。

3.4神经毒素在分泌型载体中的表达

3.4.1分泌型表达载体的构建

以pBAD/gIII载体为模板，设计引物扩增出的信号肽片断5’端有BamHI，紧接着信号肽后面为XhoI位点，该酶切位点同时编码神经毒素蛋白的N端前两个氨基酸。而以pGEM-NT为模板，设计引物将神经毒素基因5’端置换为XhoI位点，但不改变毒素蛋白的序列，3’端紧接终止密码TAA后增加XbaI位点，将这两个序列通过XhoI位点连接后，第二次PCR(聚合酶链反应)扩增出大量的N端含信号肽的毒素基因的片断。通过BamHI和XbaI位点将N端含有信号肽的神经毒素基因单向连入载体。序列测定证明神经毒素基因正确连入载体，重组质粒pBAD-NT如图16。

3.4.2神经毒素的诱导表达

pBAD/gIII质粒是可调节的E.coli分泌型表达载体，gene III编码丝状噬菌体fd的一种小外壳蛋白，为长18个氨基酸的信号肽序列，它可以穿过内膜，将重组蛋白导入E.coli周质腔中(Rfapoza&Webster，1993)。该质粒由araC调节蛋白和阿拉伯糖启动子(P_BAD)调控表达。当存在阿拉伯糖时，P_BAD激活转录，基因开始表达，而没有阿拉伯糖时P_BAD仅有非常低的转录水平(Lee，et al.1987)。蛋白表达水平可以通过诱导物阿拉伯糖的浓度来进行调节(Guzman，L.M.et al.1995)

神经毒素由阿拉伯糖诱导表达，培养4小时后，收集菌体，菌体全蛋白电泳(图17)，同时western blot检测，结果表明，阿拉伯糖浓度为0.0002％(3.9，lane 4)时，可由免疫印迹检测神经毒素的表达，而浓度为0.02％时，表达量达到最大。

超声冻融法破碎菌体，以未诱导工程菌为对照，检测发现被诱导菌表达的蛋白集中于沉淀部分(图18，A和B，Lane 4)，上清中仅有微量的表达蛋白(A和B，Lane 2)。对菌体进行两次渗透休克检查，诱导菌表达的神经毒素在第二次诱导后，仅有微量从周质腔释放(A和B，Lane 8)。

3.5神经毒素在pBV220中的温度诱导表达

3.5.1pBV220表达载体的构建

该载体含有PRPL高效串联启动子，CIts857基因可以通过温度变化，诱导PL启动子表达，可以转化任何常用工程菌菌株(张智清等)，构建的质粒图19。升高温度后，在不同的诱导时间SDS-PAGE没有检测到神经毒素的明显表达(图20)，更换宿主菌为蛋白酶缺陷的菌株BL(21)，仍然不能表达神经毒素。将培养温度降至30℃，28℃，25℃，最终仍未能检测到神经毒素的表达(data not shown)。

3.6天然神经毒素兔血清抗体滴度的测定

使用神经毒素浓度为1μg/ml和2μg/ml时，抗血清以1/4系列稀释(1/4，1/16，1/64，1/256，1/1024，1/4096)，间接ELISA法检测结果如图21，当抗血清稀释倍数为256时(0.0039)，与空白血清差异最大，检测特异性最高。因此在进行western blot采用1∶250稀释抗血清。

4小结

表1：三种载体对神经毒素表达的比较

表达载体	载体类型	表达及溶解性	表达量	纯化方式	复性情况
						pTN314	融合	表达，可溶	28％	渗透休克	不需
PBAD-NT	分泌	表达，不可溶	未测	破菌	需复性
						pBV-NT	非融合	不表达	-	-	-

将神经毒素基因装入三种不同类型的表达载体中，比较它们的表达情况。融合表达显著优于其他两种表达方式。因此选择融合表达载体pTN314作为进一步研究的重点。

由于载体类型不同，其表达方式也多种多样，本发明所述的采用pTN314载体进行融合表达的神经毒素具有较高的表达量和可溶的表达形式，有利于富含二硫键的重组神经毒素保持天然构象。

二、本发明所述的重组眼镜蛇神经毒素融合蛋白融合位点的改造及重组眼镜蛇神经毒素的酸解释放

本发明所述重组眼镜蛇神经毒素蛋白从融合蛋白中释放，要求在载体蛋白与目的蛋白之间有一个裂解位点。

在大部分融合表达载体中，该位点是一个特异的蛋白酶识别位点，通常为凝血酶，肠激酶，因子Xa等蛋白酶的位点。pThioHis载体中在硫氧还蛋白的C端连接有肠激酶的识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，切割裂解位点在Lys的C端。

酸解方法用于裂解融合蛋白，对重组目标蛋白有两个基本要求：1)目标蛋白应耐酸，不应含有酸敏感位点。2)耐热，在温度较高时蛋白能保持稳定，或者温度降低时，变性蛋白能恢复天然构象。

重组牛肠激酶(EKMax^TM)是由醇母表达的牛肠激酶的催化亚基，一种具有高度专一性的丝氨酸蛋白酶，SDS-PAGE4表观分子量为43,000Dalton，理论分子量为26,000Dalton，含有3个Asn基化位点。通常情况下对识别位点具有很高的特异性。

本发明对融合位点进行改造是将融合蛋白插入突变，在目标蛋白的前面加两个氨基酸残基(DP)，而它们之间的肽键对酸敏感，在低pH时，可自发断裂，从而将N端冗余一个Pro的重组神经毒素释放出来。

1.试剂及材料

重组牛肠激酶(EKMax^TM，EnterkinaseMax^TM)购自Invitrogen公司。质粒及PCR(聚合酶链反应)产物纯化试剂盒QIAGE公司的QIAquick^TMSpin，SSCS转化试剂盒购自上海生物工程公司。

2.实验方法

2.1重组神经毒素酶解法从融合蛋白释放

从6支0.5ml离心管中，各取纯化的融合蛋白26μl(约20μg，融合蛋白生产纯化方法见本发明说明书的第三部分)，加3μl 10x酶解缓冲液，分别加EK酶1.0，0.5，0.3，0.2，0.1unit，留作为不加酶对照，加水使总体积为30μl。以每6支管为一组，分别4℃，16℃，25℃恒温水解，每隔12或24小时采样5μl，SDS-PAGE检查重给神经毒素的释放，水解时间至72小时。

2.1.2融合蛋白的固相酶解

在每6支0.5ml的离心管中，各取纯化的融合蛋白26μl(约20μg)，按下表加样品，单位μl。

表2：固相酶解组成

	control	1	2	3	4	5	6
								融合蛋白	50	50	50	50	50	50	50
10xbuffer	6	6	6	6	6	6	6
								0.5MK<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>	0.6	0.12	0.24	0.36	0.48	0.60	0.60
	5mM	1mM	2mM	3mM	4mM	5mM	5mM
								1.0MCaCl<sub>2</sub>	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6
	10mM	10mM	10mM	10mM	10mM	10mM	10mM
								EKM<sub>AX</sub>	0.8μ	0.8μ	0.8μ	0.8μ	0.8μ	0.8μ	0.8μ
H<sub>2</sub>O	3.4	3.28	3.16	3.04	2.92	2.8	2.8

25℃酶解72小时，每隔24小时取5μl，离心，取出上清加等量电泳样品缓冲液；沉淀加5μl 0.1N盐酸溶解，加等量电泳样品缓冲液，混匀后，滴加1.0M Tris碱，直至溶液颜色由黄变蓝。上清及沉淀电泳，检查重组神经毒素释放情况。

2.1.3固相酶解的放大，重组眼镜蛇神经毒素的酸洗脱及免疫印迹

取纯化的融合蛋白溶液0.5ml，加酶解缓冲液60μl，加0.5MK₃PO₄和1.0M CaCL₂各6.0μl，混匀，加EKMax 8.0units，25℃温育72小时。离心，沉淀依次用10mM，100mM盐酸振荡悬浮溶解，8000rpm，4℃离心15分钟，取上清，5μl电泳检查及western blot，其余-20℃冻存。

2.2融合蛋白位点的酸敏感位点(DP)的引入

2.2.1引物的设计及PCR(聚合酶链反应)

如上所示，该图为设计的插入D-P的融合位点序列图，pTN314的质粒神经毒素基因的5’端和3’端终止密码子后，有Kpn I和Pst I位点，设计引物将编码酸敏感位点DP的碱基序列

加到神经毒素基因5’端。引物由上海生工生物工程公司合成，框内为酶切位点，阴影部分为编码D-P的碱基序列。

正向引物：5’GG

G

CTG GAA TGT CAC AAC(序列27)

反向引物：5’AA

GTC GAC TTA ATT GTT GCA T(序列28)

PCR(聚合酶链反应)扩增；以0.5μl p TN314为模板，正向和反向引物各0.5μl，PCR(聚合酶链反应)缓冲液5μl，dNTP 4μl，加水至50μl，混匀。94℃变性1.0分钟，65℃复性45秒，72℃延伸1.0秒，反应30个循环。最后一个循环72℃延伸5分钟。

2.2.2插入DP片段的表达载体的构建

双酶切：质粒提取及PCR(聚合酶链反应)产物纯化按试剂盒手册进行。1)取pTN314质粒40μl，加10xbufferl 8μl，BSA 0.8μl，Kpnl 50units和Pstl 30units，加水至总体积为80μl，充分混匀，37℃保温12小时。2)取纯化的PCR(聚合酶链反应)产物60μl，加10xbufferl 15μl，BSA 1.5μl，Kpnl 100units和Pstl 50units，加水至体积为150μl，充分混匀37℃保温12小时。电泳检查并回收载体大片断，酶切的PCR(聚合酶链反应)产物再次纯化，回收大片断。

连接：设置系列连接反应，取回收载体片断6μl，分别加纯化的双酶切PCR(聚合酶链反应)产物0.4，0.2，0.1μl，加1.0μl连接缓冲液，加T4DNA连接酶1.0unit，加水至总体积为10μl。分别设载体(6.0μl)及插入片断(0.4μl)对照。16℃，连接过夜。

转化：TOP 10感受态细胞的制备按试剂盒说明书进行，在1.5ml离心管中，取连接产物及其对照各5μl，加新鲜制备的感受细胞100μl，轻轻混匀，冰水浴温育10分钟，40℃热休克90秒，置冰水浴5分钟，加0.9ml新鲜的LB培养基，37℃，200rpm振荡培养1小时。取150μl涂布LB培养基平板(100μg/ml)，37℃培养至单菌落长出。

挑选单菌落，质粒提取酶切鉴定及序列测定。

2.3重组神经毒素的酸解释放

2.3.1融合蛋白的诱导表达及纯化制备

含有DP插入片断融合蛋白的诱导表达及渗透休克释放见本发明说明书的第一部分，2.5.3-4节。融合蛋白的纯化制备见第三部分。

2.3.2融合蛋白裂解条件的优化

在0.5ml离心管中，取纯化的融合蛋白40μl，分别加入冰乙酸6.5μl或13μl，甲酸134μl或者67μl，充分混匀，在另外2支0.5ml离心管中，各取天然神经毒素40μl(1mg/ml)，加入等量的甲酸和乙酸。混匀，以4支或6支反应管为一组，分别在37℃，85℃保温。48小时和3小时，每隔20小时或1小时取5μl冻干，电泳检查重组神经毒素的释放。

在5支0.5ml离心管中，各取纯化的融合蛋白43.5μl，分别加入1.0N的盐酸5，2.5，1.25，0.5μl，留一支为不加酸对照。另取2支离心管，各加入天然神经毒素20μl(1mg/ml)分别加入1.0N的盐酸5，2.5μl。这7支管加水至总体积为50μl，混匀，分别在以这7支管为一组，在65℃，85℃保温3小时，每隔一小时取样5μl，电泳检查重组神经毒素的释放。Western biot检查重组眼镜蛇神经毒素的抗原性。

3实验结果

3.1EKMax^TM对融合蛋白的酶解作用

3.1.1在溶液中EKMax^TM非特异降解融合蛋白

基于融合蛋白重组神经毒素与硫氧还蛋白之间通过一个牛肠激酶的识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)相连，而牛肠激酶是一种高度专一性的丝氨酸蛋白酶，它通过切割Lys的C端将目标蛋白从融合蛋白中释放出来(Light & Janska，1989，EKMax^TMInstruction Manual)。

但对于神经毒素融合蛋白而言，在4℃，16℃，作用72小时EKMax^TM均检测不到释放的重组神经毒素蛋白(datd not shown)。在25℃酶解24小时后，检测到重组神经毒素最大释放出约10％(图22A)，而作用36小时后，重组神经毒素释出约25％，但同时出现两条低分子量的蛋白带约占10％(图22B，non specific)。肠激酶裂解神经毒素融合蛋白效率低，并且随着酶解时间的延长，副反应严重。

在实验中发现，Ca²⁺与PO₄ ^3-离子形成的沉淀能吸附重组神经毒素，提高裂解反应，因此，进一步探索了不同浓度的Ca²⁺与PO₄ ^3-离子对酶切反应的影响，称之为“固相酶解”。

3.1.2固相酶解提高重组神经毒素的得率，但导致毒素抗原性丧失

不同浓度比例的K₃PO₄与CaCl₂在酶切反应缓冲液中能形成不同量的白色絮状沉淀，当反应体系中CaCl₂浓度为10mM时，逐渐提高K₃PO₄浓度，被沉淀吸附的融合蛋白，重组神经毒素和载体蛋白也逐渐增多。吸附机理未作深入探讨，但可能类似于“羟基磷灰石”吸附纯化蛋白的原理。离心分离沉淀和上清(图23)。当K₃PO₄浓度为5Mm时，沉淀几乎吸附了所有的融合蛋白和生组神经毒素(lane 8)。

按此比例加入K₃PO₄与CaCl₂，将反应体积提高到0.5ml，酶解完成后，用10mM盐酸溶解，可洗脱98％的硫氧还蛋白和45％的重组神经毒素(图24A，lane 3)，沉淀继续用100mM盐酸溶解，洗脱出55％的重组神经毒素，洗脱液中，毒素占总蛋白的95％以上(图24A，lane

4)。SDS-PAGE结果说明天然和重组的神经毒素蛋白分子量基本一致，但western blot结果却显示，纯化的重组神经毒素的主带与兔血清抗体的免疫反应几乎完全消失(图24，B)。

分析其原因可能有2个：1)纯化的融合蛋白溶液中，存在有微量的蛋白酶，而这些蛋白酶水破坏了神经毒素的抗原决定簇。2)EKMax对神经毒素蛋白的非特异降解。神经毒素序列中不含有肠激酶的识别位点(DDDDK)，但有可能含有电荷特性与识别位点相似的序列，而被肠激酶降解(Light&Janska，1989)。实验表明在含有神经毒素20μg，反应体积为30μl体系中，加入不同量的EKMax，37℃温育16.5小时。肠激酶用量为0.5μ时，天然神经毒素被降解(图25，Lane 4)；当肠激4.0μ时，约45％的神经毒素被降解为分子量较小的两条带(图25，Lane 2)。

3.1.3小结

肠激酶是裂解融合蛋白常用的一种专一性较强蛋白酶，但在本实验中却不适合用于生产神经毒素融合蛋白。1)对该融合蛋白专一性差，重组蛋白得率低，或者切出的重组神经毒素发生改变。2)EKMax价格昂贵，不适用于大量生产重组蛋白。

因此，设计改变重组蛋白的融合位点，将酸敏点位点(DP)引入神经毒素基因的5’端，希望通过酸解方法将重组神经毒素从融合蛋白中分离出来。

3.2DP插入表达载体的构建

扩增的DNA片断如图26，长约200bp。扩增片断与质粒pTN314被KpnI和Pst I双酶切，结果如图27。可以看到酶切后的扩增片断比酶切之前略小，但大于pTN314切出的小片断，与实际相符。转化后的挑选单菌落，测序按常规方法进行。重组质粒如图28，命名为pTNP314。

3.3融合蛋白的酸解释放

构建的载体pTNP314的IPTG透导表达，渗透休克检查，基本与pTNP314相同，证实插入的DP序列不影响融合蛋白的表达。

13％和26％的乙酸，35％和70％的甲酸在37℃酸解融合蛋白48小时，融合蛋白仅部分裂解，且观察不到重组神经毒素(图29A和B)。而在85℃酸解1小时后，融合蛋白降解严重(图29C)。

不同浓度的稀盐酸在85℃，作用2小时，融合蛋白被高效裂解(图30A)，Western blot结果说明重组神经毒素与天然神经毒素兔抗血清有强反应性(图30，B and C)。

当加入稀盐酸的终浓度分别为5，10，25，50，100mM时，融合蛋白逐渐减少，重组蛋白在裂解液中占总蛋白的比例也逐渐增大，但重组神经毒素得率并不总是随融合蛋白减少而增加，当酸终浓度为25mM时，重组蛋白得率最高为63％，占酸解液中总蛋白含量为28％(图31)，此时裂解溶液pH约为2.2。

4、讨论

4.1、Aspartyl-Prolyl肽键的酸解断裂机制及影响因素

天门冬氨酸-脯氨酸肽键在酸性环镜中，非常不稳定，天门冬氨酸的C端发生裂解，反应机制如下(Walker，J.M.1996)。

一些反应条件可以促进Asp-Pro肽键的裂解(landon，M.1977)；1)蛋白溶解在7.0M盐酸胍中，加10％乙酸，砒啶调pH至2.5。2)在37℃长时间温育(至24小时)。3)冻干终止反应。

4.2酸解的副反应及其对重组神经毒素的影响

低pH和高温条件下，蛋白可能发生的主要副反应为天门冬酰氨和谷氨酰氨脱氨，但把反应时间控制在2小时之内，能将副反应降低到最低程度(walker，J.M.1996，Wright，H.T.1991)。脱氨将导致蛋白带负电增多，而自由区带毛细管电泳能检测到蛋白荷质比的变化，因此可以通过毛细管电泳检测得重组神经毒素电荷的均一性。重组神经毒素的毛细管电泳呈单条带，与天然神经毒素迁移时间仅有0.10min差异(图33，天然神经毒素见图6)。因此重组神经毒素在酸解液中发生的脱氨反应是可以忽略的。

其他可能发生的一些次要反应包括(Walker，J.M.1996)；1)Asp-X，X-Asp肽键的断裂当X为除Pro外的基他氨基酸时，反应产率很低。2)在Glu残基断裂；3)色氨酸残基部分被破坏；4)N端Glu残基的环化等。但这些反应都可以通过缩短反应时间来避免。

4.3酸解方法在重组蛋白生产上的应用潜力

目前，应用这一策略，通过在融合蛋白中导入Asp-Pro位点，酸解融合蛋白将重组的人旁甲状腺素片段(hPTH₃₈)和一种抗菌肽释放出来而得以大量生产(Gavit.&Better.2000，Gram，H..et al.1994)。但这两种多肽都小于40个氨基酸，并且不含半胱氨酸，即不含有二硫键。

本发明所述的重组短链眼镜蛇神经毒素含有62个氨基酸，由4对二硫键形成具有紧密结构的蛋白分子，因而完全不同于上述两种小肽。

本发明所述的酸解方法用于重组蛋白的生产具有如下优点：1)盐酸无毒，无危险性。与其他化学裂解方法比较，盐酸在裂解完成后，通过调节溶液pH就可以轻易除去。而其他化学裂解剂必须小心使用。溴化氰(Br-CN)为剧毒物质，羟胺是易爆物质。2)盐酸成本低，裂解反应易于放大。而用特异蛋白酶裂解成本高，不易放大，用于生产必须严格控制实验条件，并且不同批次的酶对融合蛋白的裂解会有差异。3)盐酸解效率高，在本发明所述的实验条件下，最终对融合蛋白的裂解率大于90％，而重组神经毒素的得率也大于60％。相信该酸解条件还可以进一步优化，得率还能大幅度提高。

三、本发明所述的重组神经毒素生产纯化工艺

应用于本发明的蛋白分离纯化的实验技术包括离子交换、凝胶过滤、反向色谱、金属敖合层析等。

本发明的研究人员发现，神经毒素融合蛋白经渗透休克释放至低盐溶液中后，融合蛋白含量约为溶液总蛋白含量的65％，因此，蛋白后续纯化适合使用离子交换技术。

由于本发明所述的重组融合蛋白的分离纯化需要综合考虑生产规模或者样品的批处理，分离速度，介质的结合力，分辨率和回收率等方面的因素，在实验室规模，要求离子交换剂既有高分辨率，又要有高载量，因此，本发明采用了Source系列。

又由于本发明所述的融合蛋白酸解后，溶液中主要存在重组神经毒素和载体蛋白，分子量差别约为6,000Dalton，因此，本发明采用分辨率较高的凝胶-Superdex 75Prep对融合蛋白进行分离。

1、实验材料

1.1试剂，培养基及溶液

蛋白纯化介质Source 15Q，Superdex 75prep，Superdex G-15，和色谱柱K26/20，XK16/70，HR10/10均购自Amersham Pharmacia公司。超纯级Tris购自Sigma公司。NaCl及其他化学试剂均为分析纯。培养介质Tryptone，Yeast Extract为Oxoid公司产品。

LB液体培养基：每升含10g Tryptone，5g yeast Extract，5g NaCl，pH值用NaOH调为7.0，高压灭菌。接种前加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml。

氨苄青霉素溶液：取50mg，溶于1ml纯水中，0.2μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。

IPTG溶液(100mM)：取238.3mg IPTG溶于10ml纯水中，0.2μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。

渗透休克1#溶液：20mM Tris，pH 7.0，5mM EDTA，20％蔗糖，过滤除菌，4℃保存。

渗透休克2#溶液：20mM Tris，pH 7.0，5mM EDTA，高压灭菌，4℃保存。

1.2仪器

中低压层析系统

Purifier 100为Amersham Pharmacia公司赠送，大容量高速冷冻离心机20PR-52D型购自为Hitachi公司。

2实验方法

2.1工程菌的培养，菌体收集和融合蛋白的渗透休克释放

接种活化的工程菌TOP 10(pTNP 314)单菌落于15ml LB液体培养基中，在37℃以220rpm振荡培养过夜。次日转接3ml培养物至150ml LB培养基，在30℃以220rpm振荡培养6小时。然后以1∶40转接至2.7L培养基中，在37℃220rpm振荡培养至对数后期，菌体密度OD₆₀₀约0.5。加入TPTG至终浓度1mM，继续培养4小时。

测定菌液OD₆₀₀，在预冷至4℃的高速冷冻离心机中以8,000xg，离心30分钟，收集菌体。倾去上清，在离心管中直接加入适量冰冷的渗透休克1#溶液，使菌悬液的OD₆₀₀为5.0。充分悬浮后，冰水浴放10分钟。在4℃高速冷冻离心机以10,000xg，离心30分钟，倒掉上清，菌体悬浮在与1#溶液体积相同的渗透休克2#溶液中，充分混匀后，冰水浴放置10分钟。再次高速离心30分钟。取出上清置清洁的离心瓶中，在-25℃冻存，取少量电泳检查融合蛋白释放。

2.2融合蛋白的纯化

2.2.1离子交换色谱条件优化

色谱柱：HR 10/10

填料：Source 15Q，8ml

上样体积：渗透休克释放的融合蛋白溶液10ml

基本流动相：A 20mM Tris，pH 8.0

B 20mM Tris，pH 8.0，1.0M NaCl

洗脱条件：色谱柱平衡                    100％A    2CV

          上样                          10ml

          穿透组分洗脱                  100％A    2CV

          梯度洗脱                      0-20％B   20CV

                                        20-60％B  5CV

                                        60-100％B 0CV

                                        100％B    2CV

                                        100-0％B  0CV

                                        100％A    4CV

检测方式：紫外(280，260，214nm)，电导检测器，压力检测器

流动相优化因子：a，b，c，优化方法：在样品及流动相中，1)添加1％的a；2)加10％的b；3)将样品浓度稀释一倍；4)在样品及流动相中，加入不同浓度的c，即c1，c2，c3，c4，c5。

依次改变流动相及样品溶液组成，每种流动相重复一次。每次改变流动相后，需再次平衡色谱柱。计算每次分离融合蛋白的得率(mAU*ml)和峰面积占总峰面积之比。

2.2.2融合蛋白的制备

色谱柱：XK26/20

填料：Source 15Q，37ml

上样体积：渗透休克释放的融合蛋白溶液250ml。

优化的流动相：A 20mM Tris，pH 8.0+c2

B 20mM Tri s，pH 8.0，1.0M NaCl+c2

流速：23ml/min

洗脱条件同2.2.1节

收集方式：分部收集器等组分收集

上样方式：样品泵上样

融合蛋白溶液置37℃水浴，轻轻旋转快速解冻，加入c至c2浓度，在4℃高速冷冻离心机中以10,000xg，离心20分钟，取上清测定其体积，设定上样体积，以11.5ml/min的流速成上样。以10ml/管分部收集穿透组分及洗脱出的各组分，电泳检查。洗脱的融合蛋白在-25℃冻存。

2.3重组神经毒素的制备

2.3.1重组蛋白的酸解释放

取纯化的融合蛋白溶液10ml，加入1N的盐酸至终浓度为25mM，轻摇混匀，置85℃水浴保温反应2小时。取出自然冷却至室温，电泳检查重组神经毒素的释放情况。加入1.0M的Tris碱至Tris终浓度为50mM，混匀后，-25℃冻存。

2.3.2重组神经毒素蛋白的凝胶纯化

(1)凝胶柱的装填及柱效测定

材料：装柱器RK16，色谱柱XK16/70，凝胶介质Superdex 75prep，HiTrap DesaltingSuperdex G-25均为Amersham Pharmacia公司产品。

溶液：去离子水，20％的乙醇水溶液，Tween-20，丙酮

将装柱器安装在XK柱体顶部，纯水清洗，将滤膜装在柱底部，加入20％乙醇溶液，洗柱。将色谱柱垂直装在

Purifier 100柱架上，加入纯水，清洗色谱柱后，柱底部加约2cm高的纯水，堵头封闭柱下部出口。取138ml自然沉淀的Superdex 75prep凝胶，加入纯水悬浮至总体积475ml，加入0.25ml Tween-20，一次性匀速倒入色谱柱及装柱器中，加水添满装柱器，将装柱器入口连

，打开色谱柱出口，以纯水为流动相，设流速为1.0ml/min，开泵，3小时后，凝胶柱床体积稳定，关泵。小心卸调装柱器，装色谱柱入口适配器，以6ml/min的流速成1小时。调节适配器至凝胶柱床表面下压5mm，旋紧。

将填好的色谱柱连接

Purifier 100，以纯水为流动相，检测器设置波长为280nm。流速为2.0ml/min，以丙酮为样品，进样0.2ml。记录色谱图，计算丙酮峰的理论塔板数。

(2)重组眼镜蛇神经毒素蛋白与载体蛋白的分离

色谱柱：XK16/60装填Superdex 75prep介质

流动相：50mM Tris，pH8.0，0.15M NaCl

以1.0ml/min的流速，用两个柱体积的流动相平衡色谱柱，取酸解后Tris中和的融合蛋白溶液5ml，上样。峰收集组分，-25℃冻存。

(3)重组蛋白的浓缩与脱盐

流动相：5mM NEPES，pH7.0，25mM NaCl

凝胶分离的重组神经毒素冻干，测定重组蛋白含量，将重组蛋白以1mg/ml溶于纯水中，每次上样1.0ml，紫外及电导检测，HiTrap Desalting Superdex G-25柱脱盐。收集蛋白组分，BCA法测定蛋白含量，-25℃冻存。

3、实验结果及讨论

3.1工程菌的发酵培养及渗透休克

在实验室条件下，工程菌摇瓶培养4个小时后，达到稳定的菌体密度，OD₆₀₀约为2.0-2.2。20PR-52D型离心机每次可处理2.0L菌液，新鲜培养的菌体沉淀在500ml的离心瓶中进行渗透休克，加入1#溶液后，必须将沉淀的菌体充分悬浮均匀，不能有絮状或片状菌体。2.7L菌液约悬浮在1.08L溶液中，在冰水浴放置10分钟以上，充分渗透平衡。由于含1#溶液20％蔗糖，离心时需用较高的离心机。倒掉1#溶液后，要使离心瓶口朝下，放置几分钟，然后用吸水纸去掉管口的液滴。

2.7L培养液最终可能得约1.0L的渗透休克溶液，用4个离心瓶分装，于-70℃速冻后，在-25℃保存。

3.2融合蛋白的分离纯化

3.2.1离子交换色谱条件的优化

(1)离子交换介质及实验条件选择

离子交换是纯化基因工程重组蛋白质最有用的方法之一，交换介质结合容量大，可以一次处理大量样品。融合蛋白释放到渗透休克2#溶液中，离子强度低，适合用离子交换法进行下一步处理(孙志贤等，1995)。该溶液pH值为8.0，将融合蛋白氨基酸全序列用ProtParam tool软件分析其生化性质得出：等电点pI为5.50，因此在该溶液中，融合蛋白带强负电，选择阴离子交换剂Source 15Q。该离子交换介质具有以下特点：1)介质为耐压的刚性小球，具有均匀的15μm直径，分辨率高，可以在高流速下纯化蛋白；2)使用pH范围宽，结合容量大；3)化学稳定性好，在pH 2.0-12的范围内长期稳定(Handbook of Ion Chromatography，1991)。

选择好离子交换介质后，依次选择实验的分离条件：起始流动相pH值及离子强度，洗脱盐种类，流速，洗脱方式。1)起始流动相的pH最好与融合蛋白溶液的pH值相同，因此选择流动的pH值为8.0。2)洗脱盐采用1.0M的NaCl溶液。3)Source 15Q耐压好，生产厂家推荐线性流速为30-600cm/h，选择流速为23ml/min。4)选择线性梯度分离，第一次分离采用宽范围梯度，在20个柱体积内，NaCl浓度由0增加到100％。发现融合蛋白在NaCl为0.13M(13％NaCl)时被洗脱，因此在设置洗脱梯度在20个柱体积内，NaCl浓度由0增加到20％。

(2)流动相组分的优化

融合蛋白与分离介质结合及解离受多方面因素所影响，而流动相的组成及离子强度是其中一个重要的因素。因此重点研究改变流动相的组成，尽可能降低融合蛋白与交换介质的非特异吸附作用，保持融合蛋白具有均一而稳定的构象。

在相同的上样量和其他色谱条件相同的情况下，仅仅改变流动相的组成，由色谱图计算分离所得融合蛋白的量和所占百分比(图34)。在流动相中加入C至浓度为C2时，融合蛋白的得率最高，因此选择C2为融合蛋白作为分离纯化的流动相组成。

3.2.2离子交换法纯化融合蛋白

冰冻的融合蛋白溶液快速解冻，防止蛋白被降解，高速离心去除解冻过程中可能产生的沉淀。上样时降低流速防止由于样品溶液粘度增加而导致的柱压升高。分离过程如图(图35A)。穿透及各个主峰电泳图(图35B)，融合蛋白纯度大于95％(lane 6)，分部收集的融合蛋白主峰。

3.3重组神经毒素的制备

3.3.1重组眼镜蛇神经毒素的酸解释放

酸解反应完成后，经预实验，加入Tris碱至50mM，酸解液pH被调节至7.0左右。其作用有两方面：1)升高pH，中和盐酸，终止反应；2)调节酸解液Tris至50mM，与下一步凝胶纯化流动相组成相近。

酸解液经电泳检查，酸解完全后，进行凝胶柱纯化。

3.3.2凝胶柱的柱胶检测

自行装填的凝胶色谱柱必须检测其柱效，每米理论塔板数(N/m)应大于10,000。柱效测定色谱图(图36)，柱效每米理论塔板数(N/m)为14,500。说明色谱柱达到实验要求。

3.3.3重组神经毒素的凝胶色谱分离

与在SDS-PAGE的异常电泳行为不同，在凝胶柱上，神经毒素滞后于硫氧还蛋白(MW：13,068Dalton)，分子量表面正常(图37)。重组蛋白主峰收集，真空冷冻浓缩，脱盐(图38)，收集蛋白峰，测定重组蛋白浓度约为0.5mg/ml。

4.小结

综合整个生产工艺过程，每步纯化产物电泳纯度分析(图39，A)及相应的免疫印迹结果(图39，B)。

重组神经毒素的最终得率为35.3％(以渗透休克获得量为1)(表3)。每升发酵菌液最终可得纯度大于95％的重组神经毒素约12mg。在实验室500ml摇瓶培养条件下，菌体最高生长密度到OD₆₀₀为2.0-2.2。若使用发酵罐培养，菌体生长密度可大大提高，因此改变培养条件，重组蛋白产量可得到很大的提高。

离子交换介质Source 15Q是一种分辩率很高，同时适用于实验室精细纯化和重组蛋白的工业生产的填料，但价格较高，在今后放大工艺中，可考虑更换其他更适合与工业生产的介质，在适当牺牲分辩率的前提下，显著降低成本，提高批次处理量。酸解条件的控制是生产过程中非常关键的一步，重组蛋白的得率并不总是随融合蛋白的酸解率的提高而增大(图31)。下一步的放大将使用具有加热套和搅拌器的耐酸小型罐。凝胶纯化在生产过程中是非常有效的一个步骤，若将柱径和柱长大大提高，能提高每批处理量和分辩率。

凝胶收集的组分体积将增大一倍以上，因此必须进行浓缩和脱盐。对于重组神经毒素而言，曾使用1000Dalton分子量的透析和超滤装置对重组蛋白进行浓缩和脱盐，但蛋白得率很低，这或许是由于重组眼镜蛇神经毒素致密而紧凑的结构造成的。所以采用冻干浓缩样品，凝胶柱脱盐。

重组蛋白的生产工艺是一个系统工程，分离介质的选择，分离步骤的衔接和优化不是一个个孤立的过程，要根据生产规模，运行成本综合考虑，进行优化配置。

表3：重组神经毒素的综合得率

纯化步骤	得率	纯度
			渗透休克	100％	65％
离子交换	82％	90％
			酸解	63％	28％
凝胶过滤	76％
			脱盐纯品	91％	＞95％
最终得率	35.3％

四、重组神经毒素的理化性质及毒性测定

对重组眼镜蛇毒素进行理化性质分析，从分子量，N端氨基酸序列，对小鼠静脉注射的半数致死量等方面，与天然毒素进行比较。

1、实验材料

昆明种小鼠，由中国药物生物制品研究所实验动物中心提供。

2、实验方法

2.1重组眼镜蛇神经毒素的理化性质

SDS-PAGE电泳，反向液相色谱，毛细管区带电泳，N端氨基酸序列测定，质谱等方法与天然神经毒素测定相同。

2.2重组眼镜蛇神经毒素的毒性测定(Meier&Theakston，1986)

取18-20g昆明种小白鼠10只，分别通过尾静脉注射0.5ml不同浓度的重组神经毒素溶液，使小鼠的注射后存活时间在1分钟到30分钟之间。记录小鼠的存活时间。以每kg体重的剂量/存活时间(D/T)为横坐标，以小鼠的每kg体重的注射剂量为纵坐标作图，线性回归，曲线与纵坐标的交点为在无限时间内杀死50％的实验动物的剂量，即LD₅₀。

天然神经毒素按相同方法测定。

3、实验结果

3.1重组神经毒素分子量测定及纯度

SDS-PAGE电泳测定的重组神经毒素表观分子量为16,500dalton(图39A，Lane3)，与天然神经毒素基本相同。电喷雾质谱测定其分子量为7046dalton(图40)。反向高效液相色谱测定纯度大于98％(图41)，二级管全波长扫描(190-800nm)特征吸收在205nm和276nm(图42)，自由区带毛细管电泳纯度大于95％(图43)。

3.2重组神经毒素的N端序列

由Edman固相测序测定重组神经毒素N端序列为：

Pro-Leu-Glu-Cys-His-Asn-Gln-Gln-Ser-Gln-Thr-Pro-Thr-Thr与在载体pTNP314上携带神经毒素基因5`端编码氨基酸序列一致。

3.3重组神经毒素的毒性

小鼠每kg体重的剂量/存活时间(D/T)与每kg体重的注射剂量的对应关系如图44，重组及天然神经毒对小鼠的LD₅₀值分别为0.556mg/kg和0.369mg/kg。

4.讨论

表4：重组和天然神经毒素理化性质及毒性比较

毒素来源	表观MWSDS-PAGE(n＝3)	MW质谱	RP-HPLC保留时间(n＝3)	CZE迁移时间(n＝3)	LD<sub>50</sub>小鼠尾静脉(n＝2)	N端氨基酸(5个)	与免抗血清反应
								重组神经毒素	16,500	7046	24.3min	14.090	0.556mg/kg	PLECH	阳性
天然神经毒素	16,500	6946	25.0min	14.183	0.369mg/kg	LECHN	阳性

天然神经毒素电喷雾质谱实际测定的分子量为6946Daltons，而重组眼镜蛇神经毒素测定的分子量为7046Daltons分子量相差100Daltons而序列测定结果表明重组眼镜蛇神经毒素比天然毒素N端多一个Pro，残基分子量为97.1Daltons，相差约3个质量数，实验误差在系统误差之内。

本发明所述的重组神经毒素在C8反相柱的保留时间稍大于天然神经毒素，这与重组神经毒素在N端多一个Pro，疏水性增加有关。

本发明所述的重组神经毒素的小鼠尾静脉注射半数致死量略小于天然毒素，说明重组眼镜蛇神经毒素的毒性接近天然毒素。

五、本发明所述的重组神经毒素与肌型尼克酰胺胆碱受体结合能力的测定-------对培养的骨骼肌细胞烟碱诱导电流的抑制作用

眼镜蛇短链神经毒素与肌型尼克酰胺乙酰胆碱受体有很高的特异亲和力，它与受体的结合是一个可逆的过程。短链神经毒素是该类受体的激活剂乙酰胆碱，烟碱等的竞争性拮抗剂。在培养的单个骨骼细胞上，采用膜片钳全细胞钳制电压在-70mV，加入一定量的激活剂如烟碱，可以记录到受体通道开放产生的内向电流。当激活剂存在时，加入重组神经毒素后，可以记录到由于部分受体通道与神经毒素结合而导致的内向电流的减少。该电流的减少量与加入量组神经毒素的浓度呈正相关。

1实验材料

1.1试剂及仪器

烟碱(草酸盐)DMEM培养基，阿糖胞苷和秋水仙碱为Sigma公司产品，马血清，牛血清和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠复合物(ITS)为Gibcol公司产品。PC-84型电极拉制仪为Sutter公司产品；AxonPatch-ID放大器，TL-1AD转换板，Clampex 7.0版，Clampfit 6.0版采样和分析软件均为Axon Instrument公司产品；PPS-2空气压力给药5系统为Medical System公司产品。细胞培养箱为Baxer公司产品。相差显微镜01ympus公司产品。

1.2溶液

细胞种植液：含80％的DMEM，10％的马血清，10％的胎牛血清；

细胞饲养液：含90％的DMEM，10％的马血清和1％的ITS；

细胞外液：含0.82％的Nacl，0.04％的KCl，0.02％的MgCl₂，0.24％的HEPES，0.20％的葡萄糖，最后加0.03％CaCl₂，NaOH调节pH为7.3。

细胞内液：含2.36％的CaCl₂，0.24％4的HEPES，0.38％的EGTA，0.11％的ATP，调节pH为7.3。

2.实验方法

2.1骨骼肌细胞的培养

取当天新生的Wistar大鼠，75％乙醇消毒后处死，在无菌条件下取其后肢骨肌，在0℃的pH 7.3的磷酸盐缓冲液中剪碎，在含有0.25％胰酶的缓冲液中于37℃通氧消化60分钟，离心，弃去消化液，加入种植液，吹打，200目筛过滤，滤液在37℃，10％CO₂的培养箱中培养，24小时后换饲养液，适时换液和加入阿糖胞苷和秋水仙碱，5-8天有肌球形成后用于实验。

2.2玻璃微电极的拉制

取直径1.4mm的软质玻璃毛坯，在800℃以上拉制玻璃微电极，经抛光后测其尖端直径应为1μm。

2.3全细胞记录

膜片钳记录装置由相差显微镜，记录电极，微操纵器，前置放大器，示波器，AD转换板和工作站控制分析系统组成。将培养的骨骼肌细胞浸于2ml细胞外液中。在倒置相差显微镜下，通过微操纵仪将充满细胞内液的玻璃微电极压向肌球表面，并通过示波器显示封接测试脉冲，观察电极电阻变化。当脉冲所代表的电流值突然下降时，表面电极已经接触细胞，这时立即给玻璃微电极施以负压，使细胞与玻璃电极形成贴附式封接，从示波器读取的电流计算封接电阻约为1-3GΩ。继续施加负压或加电压1.5V 10ms，电击打破细胞膜，使细胞内环境与电极相通，形成全细胞记录并施加钳制电压。

2.4给药方式

给药装置由氮气，气体压力系统，微操纵器和给药电极组成。将充满药液的给药电极置于与记录细胞同一平面，距离1～2个肌球的位置上，调节给药压力使喷出的药液覆盖记录细胞。将三根给药电极毛坯捆绑在一起，并拉制成型，电极内充满不同药物或同种药物不同剂量的溶液，用于观察不同药物或不同剂量对同一细胞的作用。以天然毒素为对照，重组和天然毒素用含80mM烟碱的细胞外液稀释，观察它们对烟碱诱导电流的抑制作用。

2.5数据采集及处理

去极化电流及烟碱诱发电流经AD转换板和放大器Clampex7版工作站采集记录，用Clampfit 6.0版测量电流幅度。经标准化的电流幅度取平均值用X±s表示，用单因素单方差分析比较不同药物，不同剂量在-70mV钳制电压下毒素对烟碱电流抑制率的影响。

3、实验结果

3.1培养的骨骼细胞

经5～8天培养后，骨骼肌细胞有肌球形成(图47)，肌细胞生长正常。

3.2骨骼肌诱发细胞的烟碱电流

将形成全细胞记录的细胞钳制在-70mV，给予一系列刺激的同时记录诱发电流(图48)，可见明显的钠，钾离子电流，说明培养的骨骼肌细胞功能正常。向同一细胞按顺序喷射40，80，120μM烟碱1秒，间隔3分钟，可见烟碱诱发电流不断增大(表5)，说明烟碱诱发电流有量效关系。

表5  烟碱诱发电流的浓度依赖性(n＝9)

取80μM烟碱作为诱发浓度，向细胞喷射烟碱1秒，能诱发1～4nA的内向电流。以给药间隔2～3分钟，同一细胞反复数次给予80μM烟碱1秒，可见诱发电流基本一致，表面细胞的反应性前后一致(图49)。

3.3重组和天然神经毒素神经毒素对烟碱诱发电流的抑制作用

向细胞喷射80μM烟碱1秒，每间隔3分钟向同一细胞依次喷射含2.3，11.5，23μM重组或天然神经毒素的80μM烟碱1秒，可见烟碱诱发电流逐步减小(图50，图51，图46)，表明重组和天然毒素抑制烟碱诱发电流有浓度依赖性，抑制效应曲线(图15)，由此而得重组和天然神经毒素对骨骼肌细胞烟碱诱发电流的IC₅₀分别为26.2×10^-6mol/L和7.5×10^-6mol/L。

表6重组眼镜蛇神经毒素或天然毒素抑制80μM烟碱电流的浓度依赖性(n＝6)

F检验，^*P＜0.05，vs小剂量组

4讨论

4.1膜片钳技术的测定原理

膜片钳(patch-clamp)全细胞记录方法是在玻璃微电极与细胞膜之间形成高阻抗封接后，用负压或加电脉冲的方法造成电极尖端内的膜片破裂，使电极内液与细胞内液相通，这样可记录一个完整细胞产生的电活动。在电压钳制的条件下，可记录通过细胞膜的所有离子的总和。若有目的地将电位钳制在某一程度，可做到选择性地抑制某些通道的活性，而只记录某总通道电流的总和(张均田，1996)。

按药物对胆碱能受体的作用，受体分为烟碱受体(N受体)和毒蕈碱样受体(M受体)，在电器官和肌肉组织，N受体是一个约290kD的跨膜糖蛋白，由4种不同亚基组成的五聚体α₂βγδ，呈玫瑰花瓣状。离子通道被这5个亚基包围在中间，每个亚基的M2片段构成了离子通道的外侧壁并控制着离子通道的关启，神经递质结合位点主要是由存在于α亚基上的亲水区里的氨基酸组成，当激动剂与这些位点结合时，可使N受体的5个亚基发生扭曲或开花状变构，从而引起离子通道的开放。

短链眼镜蛇神经毒素对肌型尼克酰胆碱受体(N受体)有很高的亲和力，是烟碱的竞争性拮抗剂，毒素与烟碱受体结合，能阻断神经一肌肉的信号传导(Servant，D.etal.2000)。用相同浓度的烟碱激发细胞，随着毒素浓度的增大烟碱诱导的电流将逐步降低。通过全细胞记录方式，将细胞膜电位钳制在-70mV(接近细胞的静息电位)，记录到逐步降低的烟碱电流，表明神经毒素对与烟碱受体结合作用的逐渐增强，以天然毒素为对照，检测了重组神经毒素与受体结合能力的强弱。

4.2重组神经毒素的毒性测定方法

衡量或比较本发明所述的重组神经毒素与天然毒素毒性的差别通常有3种方法：1)小鼠半数致死量测定这是传统测定蛇毒毒性和其他毒素最常用的方法，方法简便易行。2)与纯化或半纯化的电鱼尼克酰胆碱受体放免竞争结合抑制实验，该方法为一种间接的体外生化测定方法。尤其适用于测定突变表达的神经毒素与受体结合能力的变化，从而了解与受体结合的神经毒素的功能位点，以[³H]标记的天然毒素为示踪元素，观察其他毒素对它与受体结合的神经毒素的竞争抑制作用，得出它们的IC₅₀。3)神经毒素对由乙酰胆碱诱发离体的蛙腹直肌收缩的抑制作用通过检测离体肌肉组织张力的变化而比较重组和天然毒素对乙酰胆碱的颉抗作用。

单电极钳制技术也曾经用于测定纯化的眼镜蛇毒蛋白对乙酰胆碱受体的阻断作用，电极尖端吸取乙酰胆碱溶液，后部充灌含有不同浓度的毒蛋白，选择培养的肌细胞，作成胞上膜片钳，电压钳制在+20mV，可记录到受体的开放活动。当电极后部的毒蛋白逐渐扩散到电极尖端时，通道即被阻断。改变电极后部充灌的毒蛋白的浓度，以毒蛋白作用前后乙酰胆碱受体的平均开放时间的比值对毒蛋白的浓度，以毒蛋白作用前后乙酰胆碱受体的平均开放时间的比值对毒蛋白的作用浓度作出反应剂量曲线，并以此计算对受体的半阻断量。

本发明采用双电极全细胞记录方式，即采用一个微电极钳制细胞，电极与细胞内液相通，并钳制电位在-70mV，另一个电极为给药电极，不同浓度的毒素蛋白溶解在同一浓度的受体激动剂中，通过压力给药系统给药1秒，使喷出的药液均匀覆盖在细胞膜表面，细胞膜上的受体经历离子通道开放，产生瞬间电流，关闭的过程，产生的电流通过记录电极被工作站采集，处理。对受体的抑制率与受体浓度的作效应曲线，计算IC₅₀。

本发明采用该方法测定重组神经毒素与胆碱受体的亲和力，本发明的研究人员认为，该方法也可用于测定不同位点突变的神经毒素与受体结合的差异。

附图说明：

图1是本发明所述的短链神经毒素(A)和长链神经毒素(B)的一级结构；

图2是本发明所述的短链神经毒素(1NOR)和长链神经毒素(1CTX)空间结构图；

图3是本发明所述的短链神经毒素(A)和长链神经毒素(B)的二级结构图；

图4是本发明所述的神经毒素SDS-PAGE电泳图；其中：

Lane 1：protein molecular weight marker，Lane 2～3：cobra neurotoxin，5ug，10ug

图5是电喷雾质谱测定本发明所述的神经毒素的分子量；

图6是本发明所述的眼镜蛇神经毒素毛细管电泳图；

图7是所述的神经毒素纯度测定HPLC图(a)及主峰的全波长(190-800nm)扫描图(b)；

图8是提取的蛇毒腺总DNA；其中：

Lane 1～3：total RNA

Lane 4：1kbp DNA ladder

Lane 5：100bp DNA ladder；

图9是RT-PCR扩增结果；其中：

Lane 1～4：PCR products at different concentrations of RNA template

Lane 5：100bp ladder；

图10是提取重组质粒EcoRI酶切鉴定电泳图，其中，箭头指示酶切出的插入片段；

其中：

Lane 1：1kbp ladder

Lane 2～9：recombinant plasmids cleaved by EcoRI

Lane 10：100bp ladder；

图11是构建的融合表达质粒pTN314(a)，蛋白融合区域(b)；

图12是IPTG诱导不同时间表达融合蛋白的全菌体蛋白电泳图；其中：

Lane 1：Low molecular weight protein marker

Lane 2：the whole cell lysate before induction

Lane 3～7：the whole cell lysate induction at 1，2，3，4，5hours；

图13是诱导时间与菌体生长密度OD₆₀₀，融合蛋白表达量及在菌体中相对含量的关系图；

图14是在E.coil菌株TOP10和BL(21)中，pTN314表达融合蛋白及渗透休克释放的比较；其中：

Lane 1：the first osmotic shock fluid of E.coli BL(21).

Lane 2：the second osmotic shock fluid of E.coli BL(21).

Lane 3：cell pellet after second osmotic shock of E.coli BL(21).

Lane 4：Low molecular weight protein marker

Lane 5：the first osmotic shock fluid of E.col i TOP10.

Lane 6：the second osmotic shock fluid of E.coli TOP10.

Lane 7：cell pellet after second osmotic shock of E.coli TOP10；

图15是重组(a)和天然神经毒素(b)对烟碱诱发电流的抑制效应曲线；

图16是构建的分泌表达质粒pBAD-NT(a)及分泌区域毒素基因插入位置(b)；

图17是pBAD-NT的阿拉伯糖诱导表达SDS-PAGE(a)和免疫印迹(b)；其中：

Lane1～5：0.2％，0.02％，0.002％，0.0002％，0.00002％of Arabinose

Lane 6：the control without induction

Lane 7：Protein molecular weight marker；

图18是菌体超声裂解上清及沉淀，渗透休克，SDS-PAGE(a)和免疫印迹(b)；其中：

Lane 1：protein marker

Lane 2：the supernatant by induction

Lane 3：the supernatant without induction

Lane 4：the precipitate by induction

Lane 5：the precipitate without induction

Lane 6：the first osmotic shock fluid by induction

Lane 7：the first osmotic shock fluid without induction

Lane 8：the second osmotic shock fluid by induction

Lane 9：the second osmotic shock fluid without induction

图19是温度诱导型表达载体pBV-NT；

图20是表达载体pBV-NT的温度诱导表达；其中：

Lane 1：low molecular weight of protein marker

Lane 2：before induct ion

Lane 3～6：induction time at 1，2，3，4hours.

Lane 7：native cobra neurotoxin；

图21是间接ELISA法检查兔血清抗体效价，箭头所指稀释倍数为256，其中，Neurotoxin 1μg/ml(a)，2μg/ml(b)；

图22是EKMax^TM在溶液中25℃对融合蛋白的裂解作用，酶解时间为24小时(a)，36小时(b)，其中：

Lane 1：Protein molecular weight marker

Lane 2～6：addition of 0.1，0.2，0.3，0.5，1.0uEKMax^TM

Lane 7：control without EKMax^TM

Lane 8：native neurotoxi n；

图23是不同浓度比例的K₃PO₄CaCl₂对融合蛋白酶的影响，沉淀部分(a)和上清部分(b)；其中：

Lane 1：Protein molecular weight marker

Lane 2：control wi thout EKMax

Lane 3～8：the addition of K₃PO₄1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mM respectively.

Lane 9：native neurotoxin；

图24是固相酶解产物的纯化(a)，和免疫印迹(b)；其中：

Lane 1：protein marker

Lane 2：precipate from EXMax digest ion

Lane 3：the elute from 10mM HCL

Lane 4：the elute from 100mM HCL

Lane 5：native neurotoxin；

图25是EKMax对天然神经毒素的非特异酶切，其中：

Lane 1：polypaptide marker

Lane 2～6：addition of EKMax 4.0，1.0，5.0，0.2，0.1unit

Lane 7：control without EKMax；

图26是DP插入片段PCR扩增，其中：

Lane 1：100bp DNA marker

Lane 2～4：Amplified the DNA fragments

Lane 5：100bp ladder；

图27是DP插入片段及载体双酶切，其中：

Lane 1：double-digested pTN314

Lane 2：control of pTN314

Lane 3：double-digested DP insert

Lane 4：control of DP insert

Lane 5：100bp ladder；

图28是带有酸解位点的表达质粒pTN314(a)，和融合表达区域(b)；

图29是用甲酸和乙酸解融合蛋白，在37℃，保温24小时(a)和48小时(b)，在85℃保温1小时(c)，其中：

A：Lane 1：protein molecular weight marker

Lane 2：control without acid

Lane 3～4：addition of 13％ and 26％ of acetic acid respectively

Lane 5～6：addition of 35％ and 70％ of formic acid respectively

B：Lane 1～2：addition of 13％ and 26％ of acetic acid respectively

Lane 3～4：addition of 35％ and 70％ of formic acid respectively

Lane 5：control without acid

Lane 6：protein molecular weight marker

Lane7：native neurotoxin in 13％of acetic acid

Lane 8：native neurotoxin in 70％of formic acid

C：Lane 1：control without acid

Lane 2：protein molecular weight marker

Lane 3～4：addition of 13％ and 26％ of acetic acid respectively

Lane 5～6：addition of 35％ and 70％ of formic acid respectively

Lane 7：native neurotoxin

Lane 8：native neurotoxin in 13％ of formic acid；

图30是不同浓度稀盐酸在85℃保温2小时酸融合蛋白(a)，免疫印迹对照(b)，和免疫印迹(c)，b和c上样量为a的1/4，其中：

A Lane 1：native neurotoxin

Lane 2：protein molecular weight marker

Lane 3～7：addition of 100，50，25，10，5mM of HCl respectively

Lane 8：fusion protein control wi thout acid

B and C：Western blot.The loading sample of B and C were as much as about1/4of the sample in A.

Lane 1：protein molecular weight marker

Lane 2～5：addition of 100，50，25，10，5mM of HCl respectively

Lane 6：fusion protein control without acid

Lane 7：native neurotoxin in 100mM of HCl

Lane 8：native neurotoxin；

图31是酸解液中未水解融合蛋白和释放的重组神经毒素分别所占比例，重组神经毒素的得率；

图32是天门冬氨酸C端肽键裂解反应机制；

图33是重组神经毒素的毛细管电泳，迁移时间为14.09min；

图34是色谱流动相组成的优化，dil指将样品浓度稀释一倍，control为以基本流动相进行分离的对照，a，b，c为不同添加剂，c1-c5指添加c的不同浓度；

图35是离子交换法纯化融合蛋白色谱图(a)和相应组分电泳图(b)；其中：

Lane 1：fl ow-through

Lane 2：protein molecular weight marker

Lane 3～4，8～9：impurities in the osmotic shock fluid.

Lane 5～7：the fractions of fusion protein；

图36是XK16/60Superdex 75prep的柱效测定；

图37是凝胶层析分离重组神经毒素；

图38是重组神经毒素脱盐，(1)重组神经毒素峰，紫外280nm，(2)盐峰，电导检测；

图39是每步纯化产物电泳纯度分析(a)及其免疫印迹检测(b)；其中：

A：Lane 1，6：fusion proteins from ion exchange colum.

Lane 2：acedic lysate

Lane 3：recombinant neurotoxin

Lane 4：protein molecular weight marker

Lane 5：native neurotoxin

B：Lane 1：osmotic shock fluid

Lane 2：fusion protein from ion exchange column.

Lane 3：acetic lysate

Lane 4：recombinant neurotoxin

Lane 5：native neurotoxin；

图40是重组神经毒素的电喷雾质谱；

图41是反向高效液相色谱测定重组神经毒素纯度(1)和溶剂空白(2)；

图42是重组神经毒素主峰()的全波长扫描图；

图43是重组神经毒素的毛细管自由区带电泳图；

图44是重组(a)及天然神经毒素(b)的LD₅₀测定；

图45是膜片钳实验装置示意图；

图46是全细胞膜片钳给药方式示意图；

图47是培养的新生大鼠骨骼肌细胞；

图48是培养的骨骼肌细胞的电压门控通道电流，电压去极化刺激从-70mV到40mV，步阶10mV，共12次，可见外向钾电流和内向钠电流；

图49是80mmol/L诱发骨骼肌烟碱电流的可重复性；

图50是天然神经毒素对烟碱电流的抑制作用；其中：

Lane 1：control，80mM nicotine-evoked currents by recombinant neurotoxin

Lane 2and 3：80mM nicotine+2.3uM native neurotoxin

Lane 4：80mM nicotine+11.5uM native neurotoxin

Lane 5and 6：80mM nicotine+23uM native neurotoxin；

图51是重组神经毒素对烟碱电流的抑制作用；其中：

Lane 1：control，80mM nicotine-evoked currents

Lane 2：80mM nicotine+11.5uM native neurotoxin

Lane 3and 4：80mM nicotine+23uM native neurotoxin

图52是重组(a)和天然神经毒素(b)对烟碱诱发电流的抑制效应曲线。

Claims (5)

1.一种融合方式可溶表达眼镜蛇神经毒素蛋白的制备方法，其特征在于所述的方法包括：

(1)神经毒素基因的克隆；

(2)可溶融合表达，在所述的融合表达中所形成的融合蛋白经过渗透休克释放出来；

(3)酸解释放；

(4)酸解反应完成后，加入Tris碱至50mM，酸解液pH被调节至7.0左右，经电泳检查酸解完全后，进行凝胶柱纯化；

(5)重组蛋白主峰收集，真空冷冻浓缩，脱盐，收集蛋白峰，测定重组蛋白浓度约为0.5mg/ml，重组神经毒素的最终得率为35.3％，以渗透休克释放获得量为1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的可溶融合表达方法包括：

(1)在神经毒素基因两端分别加Kpn I和Sal I位点，即阴影中的碱基序列

正向引物5’CGG GTA CCG CTG GAA TGT CAC

反向引物5’GGC GTC GAC TTA ATT GTT GCA TCT

以含神经毒素基因的T载体为模板进行PCR扩增，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸26秒，反应40个循环；Kpn I和Sal I酶切PCR产物，回收DNA，作为插入片断；

(2)载体双酶切及连接转化

pThioHis C载体提取，Kpn I和Sal I双酶切，载体胶回收等，依常规程序进行；电泳估计酶切载体及插入片断的浓度，以不同量的载体与等量的插入片断进行连接反应，转化感受态TOP 10 E.coli，37℃培养至长出单菌落，挑选几个单菌落测序，确定插入片断正确连入载体中；

(3)神经毒素融合蛋白的诱导表达

接种单菌落至50mlLB液体培养基，即100μg/ml氨苄青霉素中，37℃，200rpm振荡培养过夜；次日以1∶50接种至新鲜LB培养基，继续振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.5；加入IPTC至终浓度为1mmol/L，继续培养四个小时；在加入IPTC前和加入后每隔1小时取0.1ml菌液，离心，弃去上清，菌体分别标记为0，1，2，3，4，5小时的诱导表达产物；加入2x SDS-PAGE上样缓冲液0.1ml，充分混匀，95℃水浴加热10分钟；20μl上样，电泳检查。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的融合蛋白的渗透休克释放包括：接种单菌落至50mlLB液体培养基，即100μg/ml氨苄青霉素中，30℃，200rpm振荡培养过夜；次日以1∶50接种至新鲜LB培养基，37℃振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.5；加入IPTG至浓度为1mmol/L；继续振荡培养5小时；测定菌体OD₆₀₀值，4℃6,000rpm离心收集菌体，弃上清，将菌体悬浮于适量冷渗透休克1#溶液中，该溶液中：20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA，20％蔗糖；使菌体密度OD₆₀₀约为5.0，冰水浴，10分钟；离心，弃去上清，菌体悬浮于等量的冷渗透休克2#溶液中，该溶液中；20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA；冰水浴，10分钟；4℃ 10,000rpm离心15分钟，取上清，-20℃冻存；蛋白电泳检查；

pTN314表达载体的可溶表达量为为28％，其纯化方式为渗透休克并且复性情况为不需。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酸解释放包括：

(1)在融合蛋白位点的酸敏感位点DP的引入

如上所示，该图为设计的插入D-P的融合位点序列图，pTN314的质粒神经毒素基因的5’端和3’端终止密码子后，有Kpn I和pst I位点，设计引物将编码酸敏感位点DP的碱基序列GAT CCG加到神经毒素基因5’端，框内为酶切位点，阴影部分为编码D-P的碱基序列；

(2)PCR(聚合酶链反应)扩增；以0.5μl p TN314为模板，正向和反向引物各0.5μl，PCR缓冲液5μl，dNTP 4μl，加水至50μl，混匀；94℃变性1.0分钟，65℃复性45秒，72℃延伸1.0秒，反应30个循环；最后一个循环72℃延伸5分钟；

(3)DP插入表达载体的构建

扩增的DNA片断如图26，长约200bp；扩增片断与质粒pTN314被KpnI和Pst I双酶切，结果如图27；可以看到酶切后的扩增片断比酶切之前略小，但大于pTN314切出的小片断，与实际相符；转化后的挑选单菌落，测序按常规方法进行；重组质粒如图28，命名为pTNP314；

(4)融合蛋白的酸解释放

浓度为5-100mM的稀盐酸在85℃，作用2小时，融合蛋白被高效裂解，当酸终浓度为25mM时，重组蛋白得率最高为63％，占酸解液中总蛋白含量为28％，此时裂解溶液pH约为2.2。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的凝胶柱纯化方法包括：

(1)重组眼镜蛇神经毒素与载体蛋白的分离

色谱柱：XK16/60装填Superdex 75 prep介质

流动相：50mM Tris，pH8.0，0.15M NaCl

以1.0ml/min的流速，用两个柱体积的流动相平衡色谱柱，取酸解后Tris中和的融合蛋白溶液5ml，上样；峰收集组分，-25℃冻存；

(2)重组蛋白的浓缩与脱盐

流动相：5mM NEPES，pH7.0，25mM NaCl

凝胶分离的重组神经毒素冻干，测定重组蛋白含量，将重组蛋白以1mg/ml溶于纯水中，每次上样1.0ml，紫外及电导检测，HiTrap Desalting Superdex G-25柱脱盐；收集蛋白组分，BCA法测定蛋白含量，-25℃冻存。

Images