CN103804481A - 在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇ct和pla2的方法 - Google Patents

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Abstract

一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇蛇毒蛋白（CT）和磷脂酶A2（PLA2）的方法：利用RT-PCR的方法从眼镜蛇毒腺中分离表达CT和PLA2成熟肽的DNA序列，构建昆虫病毒表达载体BM-CT和BM-PLA2；将携带目的基因的载体和空载体转入Sf9昆虫细胞，获得病毒颗粒；用病毒颗粒感染细胞，经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，用Ni柱洗脱的方法从细胞裂解上清中纯化出CT和PLA2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性，结果显示，CT处理组小鼠的扭动次数显著低于PLA2处理组和对照组，说明获得的CT具有镇痛活性，效果好于PLA2；PLA2处理组鼠的扭动次数显著低于对照组，说明获得的PLA2也具有镇痛活性。本发明涉及的CT和PLA2蛋白可作为镇痛剂，应用于临床医学镇痛药物的开发利用和基础医学的研究。

Description

在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2的方法。
背景技术
眼镜蛇毒中有20多种生物活性成分，以毒蛋白、多肽和酶类等生物活性物质为主，在治癌和抗癌，抗肿瘤；止血和抗凝血；介毒药物和镇痛剂；制备抗蛇毒血清；降血压，降纤，溶血栓；治疗血淤性头痛等方面具有重要的药物活性。
神经毒素由于在眼镜蛇中的表达量大，一直是研究的热点。神经毒素的主要医学应用是用于镇痛和麻醉，据Phui Yee等文献报道，在2004年就有科学家开始用蛇毒来缓解神经性疼痛、肿瘤的疼痛、顽固性疼痛和关节的疼痛。目前国内外已有多种蛇毒制剂用于临床的治疗，收到满意的疗效，如美国FDA已批准两种蛇毒神经毒素作为药物，一种是治疗顽固性神经痛和癌痛的Cobroxin；另一种是用于治疗关节疼痛的Nyloxin。同时蛇毒的神经毒素是没有耐忍性的，也与吗啡等没有交叉忍耐。此外，神经毒素的镇痛作用没有成瘾性。此外蛇毒类的凝血酶也早己广泛用于治疗各种血管栓塞性疾病及预防术后血栓形成，如安可乐、蕲蛇酶等。
眼镜蛇毒素（Cobrotoxin, CT）蛋白是一种从台湾眼镜蛇体内分离出来的神经毒素。1965年，高雄医学大学最先发现并通过阳离子交换纤维素CM-cellulose和Sephadex G-25分离眼镜蛇毒蛋白，并在1969年确定其序列。CT蛋白是由62个氨基酸构成的蛋白质，其空间结构中通过4对二硫键形成β折叠成三指形结构，属于突触后短链神经毒素。根据其氨基酸序列确定，内含6个酸性氨基酸、9个碱性氨基酸、5个疏水氨基酸。和典型的突触后膜神经毒素一样属于碱性蛋白质。四对二硫键的位置分别是C3-C24、C17-C41、C43-C54和C55-C60。神经毒素富含二硫键的结构可作为研究蛋白质折叠、空间构象与功能关系的模型。CT蛋白成熟肽基因大小为186bp，其编码区基因的长度为2402bp，其中有3个外显子和3个内含子，还包括上游的启动子元件（如TATA框）和调控序列，第一外显子的全部序列为信号肽，第二外显子的开头9个碱基对也是信号肽部分，剩下的外显子序列为成熟肽序列。CT蛋白是典型的眼镜蛇体内的短链神经毒素，具有所有一切短链神经毒素的功能：能竞争性的与突触后膜上的烟酰胺型乙酰胆碱受体结合，阻止神经-肌肉通路的去极化，导致神经冲动传导阻断。根据神经毒素阻断神经传导过程的作用，可开发出不成瘾的新型镇静药，用于镇痛、麻醉和戒毒。
磷脂酶A2（Phospholipase A2, PLA2）是一种能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶，这些酶广泛分布于自然界中，目前为止分为15个不同的种类，是花生四烯酸（Arachidonic acid,  AA）、前列腺素及血小板活化因子（Platelet activating factor, PAF）等生物活性物质生成的限速酶。在蛇类中，PLA2主要存在于游蛇科、眼镜蛇科和蝰蛇科的蛇类中。根据结构特征的不同，蛇的PLA2可以分为两类，一类为毒蛇PLA2，另一类为普通PLA2。1938年，Slotta等第一次报告了PLA2的结晶。1981年，台湾国立清华大学通过SP- Sephadex C-25分离蛇初毒，成功分离出有生物活性的蛇毒PLA2。1990年，Scott等提出了蛇毒PLA2“界面活化”理论，该理论认为蛇毒的PLA2具有和普通酶类不同的一个特征，即其在作用的时候能够优先凝聚底物，形成胶束或者囊泡。同年，一项对中国眼镜蛇PLA2基因的研究公布了它的三维结构，同时运用模型对蛇毒PLA2的活性残基进行了验证，结果显示酰解的四面体中心是分子相互作用的关键残基，和普通的没有蛇毒活性的PLA2相比较，在不同的位置发生了一些氨基酸的替换，这些替换使得PLA2有了类似三指型的结构，这样就有了神经毒素的作用。由于分子生物学的快速发展，以及对其结构的更深入了解，在1994年从台湾眼镜蛇的毒腺cDNA扩增出一种PLA2，成熟肽序列由119氨基酸组成，另外还有一个27个氨基酸序列的信号肽。其成熟肽基因大小为357bp。PLA2是一类分布广泛的酶家族，其基本作用是催化甘油磷脂sn-2位上的酰键发生水解反应，产生溶血磷脂和脂肪酸，参与磷脂的代谢。蛇毒PLA2在结构和水解功能上与哺乳动物的PLA2非常相似，它能水解各种磷脂类物质，同时对细胞的通透性有很大的影响。目前国内外主要采用各种色谱技术从天然蛇毒中分离和提取蛇毒有效成分。由于蛇毒成分复杂，不同种的蛇、同种蛇不同产地或是蛇毒收集时期不同，其蛇毒成分也会有差异。因此捕蛇提毒的方式很难固定生产纯化工艺，获得纯品技术难度较大；养蛇提毒成本高周期长，也难得到高纯度的产品；加之蛇毒原料来源复杂，应用相同的分离纯化技术分离同种蛇毒所得到毒素的氨基酸组成可能有所不同，开发成药物时质量标准很难统一，使分离纯化达到质量标准的蛇毒制剂，难度加大，价格较高。从天然蛇毒提取的制剂，多为蛇毒粗毒，由于含有其他有毒成分，用现有分离纯化技术很难完全分开，这些毒性成分的存在，在临床应用中出现过多种的不良反应。有些蛇毒蛋白，例如同一种眼镜蛇毒中含有4-5种细胞毒素，它们的药理效应和毒性却不一致，有的抗肿瘤活性强而毒性却较小，有的则相反，而它们理化性质却非常接近，因此纯化细胞毒素并有选择地利用活性强、毒性小的细胞毒素难度较大。再者由于蛇毒资源有限，直接从自然界大量捕蛇获取蛇毒，会破坏生态平衡，不利于大量生产和广泛的临床应用。
随着分子生物学技术的发展，科研工作者通过对蛇毒各组分如神经毒素、细胞毒素、神经生长因子、凝血酶样酶等氨基酸的序列测定，通过基因工程技术大量高纯度制备和开发蛇毒的各种组分成为现实，它不仅能实现生产特定的蛇毒有效成分，而且还可通过基因的定点突变，改造天然成分的特性，有望生产出纯度更高、副作用更小的蛇毒有效成分制品。因此用基因工程技术克隆和高效表达蛇毒有效成分对保护自然资源、实现可持续发展具有重要意义。
眼镜蛇属（Naja）的物种均含有CT和PLA2蛋白，但不同种或亚种体内的CT和PLA2存在核苷酸或氨基酸的差异，这些差异可能会影响到CT和PLA2蛋白的功能。本发明所采用的CT和PLA2蛋白来源于广西野生的眼镜蛇（Naja naja）。
发明内容
本发明提供了一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2的方法。
本发明所述的在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2蛋白的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1从眼镜蛇毒腺提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得编码眼镜蛇CT和PLA2蛋白的核苷酸序列，核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示；
（2）将眼镜蛇CT和PLA2蛋白的核苷酸序列克隆到昆虫杆状病毒载体pFastBac DualTM中，再通过转座获得BacMid重组质粒，在昆虫Sf9细胞中表达CT和PLA2蛋白；
（3采用亲和层析方法对CT和PLA2蛋白进行纯化，从而得到目的蛋白CT和PLA2，其氨基酸序列分别如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示。
以上所述的步骤（3）中，所述的亲和层析方法为Ni柱亲和层析纯化法。
所述的Ni柱亲和层析纯化法，具体包括如下步骤：
（1）收集转染后的昆虫Sf9细胞，裂解细胞后离心得到上清液；
（2）将上清液和Ni-NTA的混合液上柱；
（3）用清洗缓冲液洗去非特异结合型蛋白；
（4）加入洗脱缓冲液，洗脱下的蛋白即为CT和PLA2蛋白。
所述的眼镜蛇CT和PLA2蛋白，镇痛活性可以通过小鼠的扭体实验来进行检测。
具体操作方法如下：
以广西眼镜蛇取样，在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2蛋白的方法。
1．蛇毒腺总RNA的提取
眼镜蛇毒腺总RNA抽提的具体步骤如下：
（1）匀浆处理 取50-100 mg的广西眼镜蛇毒腺放入消毒并用液氮预冷的研钵中，加入适量的液氮，用研磨杵充分研磨组织，研磨完成以后加入裂解液RZ，样品体积不应超过裂解液RZ体积的十分之一。
（2）将匀浆样品，30℃放置5 min，使核酸与蛋白复合物分离。
（3）加入200 μL预冷的氯仿，盖好管盖，振荡器震荡15 s，室温放置3 min。
（4）4 ℃ 12000 rpm超速离心10 min，样品将会分成三层：中间层、无色的水相和黄色的有机相，核酸主要集中在水相中。把水相转移到新管中。
（5）缓慢加入步骤（4）中水相0.5倍体积的无水乙醇，温柔混匀。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4 ℃ 12000 rpm超速离心30 s，弃掉收集管中的废液。
（6）将500 μL去蛋白液RD（使用前先检查是否已加入乙醇）加入到吸附柱CR3中， 4 ℃ 12000 rpm超速离心30 s，弃掉收集管中的废液，将CR3放入收集管中。
（7）将700 μL去蛋白液RW（使用前先检查是否已加入乙醇）加入到吸附柱CR3中，室温放置2 min，4 ℃ 12000 rpm超速离心30 s，弃废液。
（8）重复操作步骤（7）。
（9）4 ℃ 12000 rpm超速离心2 min，去除吸附柱CR3中的残余液体。
（10）将吸附柱CR3转入一个新的1.5 mL EP管中，向吸附柱中间悬空加入45 μL的RNase-Free ddH2O，室温静置2 min，4 ℃ 12000 rpm超速离心2 min。得到广西眼镜蛇毒腺的RNA。
（11）用1.2%的琼脂糖水平电泳检测提取的广西眼镜蛇RNA。
2．CT和PLA2的RT-PCR扩增
CT的引物序列如下：
CT1-F：TCGAATTCATGCTGGAATGTCACAACCAA
CT-H-F：TCGAATTCATGCACCACCACCACCACCACCTGGAATGTCACAACCAA
方框里的碱基GAATTC为EcoRI、EcoRI的酶切位点，斜体碱基TC为保护碱基，有底纹的碱基CACCACCACCACCACCAC为加的组氨酸纯化标签。
PLA2的引物序列如下：
PLA2-F：TCCTCGAGATGAACCTCTATCAGTTCAAAAACA
PLA2-H-F：TCCTCGAGATGCACCACCACCACCACCACAACCTCTATCAGTTCAAAAACA
方框里的碱基CTCGAG和为Xho I、Xho I的酶切位点，斜体碱基TC为保护碱基，有底纹的碱基CACCACCACCACCACCAC为加的组氨酸纯化标签。
利用反转录试剂盒迅速反转上步提取的毒腺总RNA，反应体系为5×Buffer 5.0μL，Oligo dT 18（10 μM）1.0 μL，dNTPs（10 mM）3.0 μL，M-MLVRT酶（200 μ/μL）1.0 μL，RNA酶抑制剂（40 μ/μL）0.5 μL，毒腺RNA 5.0 μL，加ddH2O至25.0 μL；反应程序：25 ℃，10 min；37℃，60 min；95℃，5 min条件下，获得cDNA第一链。然后以cDNA第一链做模板进行PCR扩增。反应体系：Buffer without Mg2+ 2.0 μL，Mg2+ 1.2 μL，CT和PLA2上下游引物（10 μM）各0.5 μL，cDNA第一链 1.0 μL，dNTPs（10 mM）0.3 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μl，加ddH2O至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃/55 ℃（CT/PLA2）退30 s，72 ℃延伸30 s，重复35次；最后72 ℃，5 min。
3．CT和PLA2的PCR产物的回收
具体步骤如下：
（1）平衡柱子：将500 μL平衡液BL加入到吸附柱CA2中，12000 rpm超速离心1 min，倒弃废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中。
（2）切下单一的目的核酸条带，并将切下的胶块切成碎块，放入干净的EP管中，放置天平上称取重量。
（3）向上述的EP管中加入3倍体积溶胶液PN（注：胶的体积计算方法 0.1g=0.1mL）。后放入50 ℃恒温水浴锅中放置10 min，每2 min温和的上下翻转EP管，直到胶块完全溶解。
（4）将步骤（3）中所得的溶胶液加入吸附柱CA2中，25 ℃放置2 min，后12000 rpm超速离心45 s，弃废液，将吸附柱CA2重新放入收集管中。
（5）加入600 μL漂洗液PW（试剂盒使用前预先加入无水乙醇）至吸附柱CA2中，12000 rpm超速离心45 s，弃废液，吸附柱CA2重新放入收集管中。
（6）重复操作步骤（5）。
（7）12000 rpm超速离心2 min，除尽吸附柱中的漂洗液PW。将吸附柱CA2盖子打开，置于通风干燥处放置数分钟，彻底的晾干吸附柱，防止残留的漂洗液PW（主要是其中的乙醇）影响下一步的实验结果。
（8）将吸附柱CA2放置到一个干净的EP管中，在中间位置悬空滴加50 μL的缓冲液EB（或者灭菌后的偏碱性的ddH2O）至吸附柱膜上，室温静置2 min。12000 rpm超速离心2 min，EP管中收集的溶液即为纯化后的DNA。
4．CT和PLA2基因的克隆
将PCR产物和pMD18-T克隆载体16℃过夜连接，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，操作步骤如下：
（1）在无菌条件下，从-80 ℃冰箱中取出一支100 μL的大肠杆菌（DH5α）感受态细胞。分到4个EP管中，每管25 μL。
（2）取5 μL的过夜连接产物，多点加入到感受态细胞中，冰上放置30 min。
（3）42 ℃恒温热击90 s。
（4）快速将EP管包埋于冰中，冰浴5 min。
（5）无菌操作，向EP管中加入200-250 μL的LB培养基，180 rpm，37 ℃，离心60 min。
（6）将转化的产物取50-100 μL涂布于含有Amp的LB筛选平板上，37℃过夜培养。
（7）次日从平板上挑取长势较好且单独的菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中，摇菌5-6个小时。得到烟雾状菌液。
然后用PCR、双酶切和测序的方法鉴定阳性克隆。
5．CT和PLA2杆状病毒质粒的构建
将测序正确的阳性CT和PLA2重组质粒和pFastBac DualTM质粒双酶切，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，然后转化大肠杆菌感受态细胞，方法与CT和PLA2的克隆方法一样。然后用PCR、双酶切和测序的方法鉴定阳性克隆。
6．大肠杆菌DH10Bac的感受态细胞制备
（1）将大肠杆菌DH10Bac菌体涂布于LB（Kan+）固体平板上，筛选新鲜活化的DH10Bac单菌落，将菌落接种于含有2 mL LB液体培养基（Kan+）的250 mL三角烧瓶中，37 ℃过夜振荡培养，次日取0.5mL的过夜培养菌液接种于新的50 mL同样培养基中，继续振荡培养至OD600值达到0.6左右。
（2）在无菌条件下将上述菌液转移到0 ℃预冷的50 mL EP管中，冰上放置10 min，使菌液冷却至0 ℃，4000 rpm 4 ℃离心10 min，弃上清，将管倒置数分钟使残留培养基流出。
（3）用10 mL 0 ℃预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞沉淀，温柔混匀冰上放置5 min，4000 rpm 4 ℃离心10 min，倒出培养液，吸出上清，后将管倒置数分钟使残留培养基流出。
（4）加入1 mL 0 ℃预冷的含15%甘油的0.1 M CaCl2，重悬细胞沉淀，温柔混匀后冰上放置5 min，此时的细胞状态即为感受态细胞。
（5）用0 ℃预冷的无菌吸头将感受态细胞分装于0 ℃预冷的无菌1.5 mL的EP管中，每管200 μL，立即使用或放入-70 ℃保存。
7．真核表达载体构建
（1）将上步得到的真核穿梭载体菌液提取质粒，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞。同时真核穿梭载体在此大肠杆菌中发生转座。转化的步骤见4中DH5α转化步骤。
（2）发生转座的大肠杆菌的抗性筛选和蓝白筛选
用抗性和蓝白初步筛选，由于真核穿梭载体上本来有就Tet和Gen的抗性，加上DH10Bac菌种上有Kan的抗性，同时具有乳糖操纵子的结构，所以用Tet/Gen/Kan/LB/ X-Gal/ IPTG平板进行蓝白筛选。选取白色单菌落涂布于新的Tet/Gen/Kan/LB/ X-Gal/ IPTG平板上继续培养，如此筛选3代依然为白色菌落的可视为转座完全。
（3）用M13通用引物PCR检验
由于Bacmid质粒很大，超过135 kb，采用酶切的方法不能切开质粒，所以利用PCR技术来鉴定Bacmid是否发生重组，鉴定目的片段的插入是否正确。即用通用的M13引物扩增Bacmid质粒的Mini-attTn7 元件，通过扩增出来的目的片段大小确定是否重组，没有重组的为273 bp，发生重组的DNA扩增出来的片段大小应该为2560 (2287+273)  bp（Tn7L 元件）加上目的基因的基因大小。以菌液为模板，M13引物为引物进行PCR，反应体系：Buffer without Mg2+ 2.0 μL，Mg2+ 1.2 μL，M13-F（10 μM） 0.5 μL，M13-R（10 μM） 0.5 μL，菌液/质粒1.0 μL，dNTPs（10 mM） 0.3 μL，rTaq DNA聚合酶（5U/μL） 0.3μL，加ddH2O至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95℃ 变性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复35次；最后72 ℃延伸5 min。
8．大提阳性菌的质粒
具体步骤如下：
（1）取100 mL 过夜培养的菌液，10000 rpm超速离心3 min，弃上清，收集细菌。并倒置EP管于干净的吸水纸上。使培养基充分流尽。
（2）加入10 mL溶液P1(试剂盒使用前加入RNase A)至有菌体沉淀的EP管中，用移液器反复吹打彻底使细菌细胞沉淀悬浮。
（3）加入10 mL溶液P2至EP管中，立即温柔地上下翻转8次，充分混匀后室温静置5 min。
（4）加入10 mL溶液P4至EP管中，立即温柔地上下翻转8次，充分混匀，防止白色絮状沉淀在局部形成。后室温静置10 min。10000 rpm超速离心10 min，使白色絮状物沉淀，将全部上清倒入过滤器CS1中，避免倒入絮状沉淀，后慢慢推动过滤器推柄，将滤液收集于干净的50 mL的EP管中。
（5）加入0.35倍上述滤液体积的异丙醇和0.5倍异丙醇体积的5 M NaCl，温柔上下颠倒数次，使充分混匀。
（6）4 ℃ 10000 rpm超速离心30 min，缓慢倒掉上清液，倒置在吸水纸上，使液体全部留出。
（7）加入6 mL 70%乙醇，充分混匀，后4 ℃ 10000 rpm超速离心10 min，缓慢倒掉上清液，倒置在吸水纸上，使液体全部留出。。
（8）重复步骤（8）。
（9）打开EP管口，室温放置15 min，使乙醇挥发，后加入1 mL 洗脱缓冲液TB，充分溶解后，即得到大量抽提的质粒。
9．真核表达载体转染昆虫细胞
培养条件：培养基：SF-900 II （可加10%血清，也可不加。）
温度：27 ℃ 
CO2浓度：0%
恒温震荡培养箱（生化培养箱），50-90 rpm培养。
转染的具体步骤如下：
（1）取处于对数生长期同时细胞活力超过95%的昆虫Sf9细胞（一般培养时间为48h~72h）接种于48孔细胞培养板中，每孔0.5 mL，共含2.5×105个细胞；即细胞密度约为5.0×105个细胞/mL。
（2）让细胞在27 ℃静置30 min。
（3）无菌操作准备以下溶液：
A、杆状病毒DNA混合物：将0.25 μg(约1 μL)大量提取的Bacmid DNA稀释于25 μL无抗生素无血清的Sf-900 II SFM中。轻柔混匀。
B、Cellfectin ReagentⅡ混合液：23 μL无抗生素无血清的Sf-900 II SFM中加入2 μL转染试剂Cellfectin ReagentⅡ。轻柔混匀。
C、DNA-脂质体混合物：将A液和B液混合，大约51 μL，轻轻混匀，室温放置30 min。
（4）在C液温育到快30 min时，除去细胞培养板中的旧培养液。
（5）加200 μL无抗生素无血清的Sf-900II SFM于盛有C液的离心管中，轻轻混匀，然后将该混合液贴壁加入（1）中的细胞培养板孔中。
（6）27 ℃培养箱中静置培养5 h。
（7）将上步的混合液去除，加入500 μL的Sf-900II SFM（+10% FBS），27 ℃，静置培养直至细胞病变，一般出现在72 h以后。
10．病毒收集和扩增
（1）等细胞完全病变以后，收集杆状第一代病毒。将细胞板中的上清悬液吸出移至干净的EP管中，即为第一代病毒，4 ℃避光保存。
（2）取处于对数生长期同时细胞活力超过95%的昆虫Sf9细胞（一般培养时间为48 h~72 h）接种于48孔细胞培养板中，每孔2 mL，共含2×106个细胞；即细胞密度约为1×106个细胞/mL。
（3）27 ℃无菌静置30 min，使细胞贴壁。
（4）每孔中加入0.5 mL的一代病毒。
（5）27 ℃静置培养直至细胞发生病变，大概48 h~72 h。
（6）收集2代病毒，4 ℃避光保存。
（7）同样的方法扩增得到3代病毒，3代病毒的病毒滴度可以用于昆虫细胞的蛋白表达。
11．细胞蛋白收集和蛋白鉴定
（1）在50 mL培养瓶中接种10 mL的处于对数生长期同时细胞活力超过95%的昆虫细胞Sf9，控制细胞密度在1×106个/ mL左右。将3代杆状病毒按照1:5的比例加入到培养瓶中（即加入2 mL病毒），27 ℃静置培养，在细胞失去贴壁能力时收集细胞和上清。
（2）各种不同组分的分离
收集细胞液1000 rpm，5 min得到的上清为培养基组分。沉淀再用200 μL的PBS重悬，再反复冻融使细胞裂解，5000 rpm低温离心5 min，上清为可溶蛋白成分，沉淀再重悬于200 μL PBS中，为细胞不溶蛋白组分。均放入-20 ℃保存备用。
（3）SDS-PAGE胶的制备，具体步骤如下：
按照蛋白电泳仪说明说装好干净干燥的玻璃板。配置12%分离胶制备，各成分加入后迅速涡旋混匀，用注射器将混合液迅速地加入玻璃板缝隙中，预留出浓缩胶（约为20%）的空间。再用轻轻在加入少量异丙醇封顶，异戊醇能压平分离胶的平面同时也能防止氧对分离胶聚合。凝胶聚合完成约一小时后，倒出上层的异丙醇，用双蒸水清洗封胶层数次，再用滤纸吸干封胶层中的水，防止影响溶缩胶的溶度。配置5%分离胶制备，各成分加入后迅速涡旋混匀，用注射器将混合液小心迅速地注入玻璃板剩余的间隙中，装满后迅速插入加样梳，避免梳子和胶之间有气泡。室温静置1h，使胶完全凝固，然后小心拔下梳子。胶制作完成。
（4）将上述得到的不同细胞位置的蛋白液中加入1/2体积的4×SDS电泳上样液。并在沸水中煮5min，使蛋白充分变性。
（5）然后用10 μL的蛋白变性液上SDS-PAGE胶电泳。先用80 V跑到溴酚蓝完全进入分离胶后，升电压到120 V跑到溴酚蓝差不多完全跑完分离胶，需要大约4 h。
（6）关闭电源，撬开玻璃板，取出凝胶并做好标记放入蛋白染色液，50 ℃恒温摇床1 h。
（7）从染色液中取出凝胶放入蛋白脱色液中，50 ℃恒温摇床脱色4 h，其间更换脱色液3到4次，直到条带清楚。记录结果并拍照。
（8）质谱检测表达蛋白，切下清楚的目的蛋白条带，委托亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室公共实验平台进行质谱检测。
12．目的蛋白纯化
（1）收集转染后的昆虫细胞，1000 g，离心5 min。用PBS冲洗细胞数次，1000 g，离心5 min。
（2）向清洗过的细胞中加入裂解缓冲液，每1-2×107个细胞中加入4 mL的细胞裂解液。冰上放置10 min。
（3）将上述的溶胞产物，10000 g，4 ℃离心10 min。离心出细胞碎片和DNA。取上清放入新管。
（4）按照每4 mL上清加200 μL 50% Ni-NTA的比例加入Ni-NTA。200 rpm震荡1-2 h。
（5）将溶胞产物和Ni-NTA的混合液上柱。
（6）打开出口盖，收集经过滤膜的液体。
（7）加入800 μL的清洗缓冲液，温柔混匀清洗缓冲液和Ni-NTA，然后打开出口盖，放出经过滤膜的液体。
（8）重复步骤（7）。
（9）加入100 μL的洗脱缓冲液，温柔混匀清洗缓冲液和Ni-NTA，然后打开出口盖，收集经过滤膜的液体。
（10）重复步骤（9），3遍，收集经过滤膜的液体-20 ℃备用。
13．CT和PLA2蛋白质定量
具体操作步骤如下：
（1）配制25 mg/mL 的蛋白标准溶液：于蛋白标准(20 mg BSA)中加入0.8 mL蛋白标准配制液，充分溶解，置于-40 ℃长期保存。
（2）稀释25 mg/mL 蛋白标准溶液至终浓度为0.5 mg/mL。
（3）配制BCA工作液：50 : 1 = 试剂A : 试剂B，充分混匀。 
（4）将标准品加到96孔板的标准品孔中。
（5）给孔依次加入BCA 工作液200μL，37 ℃恒温箱中孵育45 min。 
（6）利用酶标仪在A595nm 波长进行比色。绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。并统一用PBS将其调整为0.021 mg/mL。
14．CT和PLA2活性的检测
CT和PLA2活性通过小鼠醋酸扭体镇痛来检测，具体操作步骤如下：
（1）取90只体重在25 g左右，雌雄各半的成年小白鼠，随机分成3组，CT实验组、PLA2实验组和PBS对照组，每组30只。
（2）分别向腹腔注射25μL，浓度为0.021 mg/mL的CT、PLA2和PBS。
（3）45 min后，分别以每只小鼠按10 mL/kg剂量腹腔注射0.6%醋酸，使小鼠腹部产生疼痛而扭体和腹部收缩抽搐。
（4）观察10 min内小鼠的扭体次数，扭体次数越少的说明抑制疼痛效果越好。
本发明提供了广西眼镜蛇毒神经毒素CT和PLA2成熟肽的核苷酸序列。CT成熟肽的核苷酸序列长度为186 bp（SEQ ID NO.1），PLA2成熟肽的核苷酸序列长度为357 bp（SEQ ID NO.2）。
CT（SEQ ID NO.1）：
ctggaatgtc acaaccaaca atcatcgcaa actccaacca ctacaggttg ttcaggtggg    60
gagaccaatt gctataaaaa gcgttggcgt gatcaccgtg gatatagaac cgagagggga    120
tgtggttgcc cttcagtgaa gaacggcatt gaaattaact gttgcacaac agacagatgc    180
aacaat                                                               186
PLA2（SEQ ID NO.2）：
aacctctatc agttcaaaaa catgattcaa tgtactgtcc ccagtcgatc ttggtgggat    60
tttgcggact atggttgcta ctgcggacgc ggaggcagcg ggacaccagt agacgacttg    120
gataggtgct gccaggttca tgacaactgc tataatgaag ccgaaaaaat ttccggatgc    180
tggccctact tcaagaccta ttcatacgag tgttctcaag gcacactcac ctgcaaaggt    240
ggcaacaatg cgtgtgcagc tgctgtctgt gattgtgacc gcttggcagc catctgcttc    300
gccggagccc cttacaacaa taacaactac aatatcgacc tcaaggcacg ttgccaa       357
本发明提供了广西眼镜蛇毒神经毒素CT和PLA2成熟肽的氨基酸序列。CT成熟肽的氨基酸序列长度为186 aa（SEQ ID NO.3），PLA2成熟肽的氨基酸序列长度为357 bp（SEQ ID NO.4）。
CT（SEQ ID NO.3）：
Leu Glu Cys His Asn Gln Gln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly
1             5                10               15
Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His
           20               25               30
Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Ser Val Lys Asn
       35                40               45
Gly Ile Glu Ile Asn Cys Cys Thr Thr Asp Arg Cys Asn Asn
   50               55               60
PLA2（SEQ ID NO.4）：
Asn Leu Tyr Glu Phe Lys Asn Met Ile Glu Cys Thr Val Pro Ser Arg
1              5               10               15
Ser Typ Typ Asp Phe Ala Asp Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Arg Gly Gly
           20               25               30
Ser Gly Thr Pro Val Asp Asp Leu Asp Arg Cys Cys Gln Val His Asp
       35               40                45
Asn Cys Yyr Asn Glu Ala Glu Lys Ile Ser Gly Cys Trp Pro Tyr Phe
    50                55              60
Lys Thr Tyr Ser Tyr Glu Cys Ser Gln Gly Thr Leu Thr Cys Lys Gly
65               70               75               80
Gly Asn Asn Ala Cys Ala Ala Ala Val Cys Asp Cys Asp Arg Leu Ala
              85               90                95
Ala Ile Cys Phe Ala Gly Ala Pro Tyr Asn Asn Asn Asn Tyr Asn Ile
         100              105               110
Asp Leu Lys Ala Arg Cys Gln
       115
本发明提供了特异扩增广西眼镜蛇毒神经毒素CT和PLA2基因的特异引物序列。
 CT1-F：
tcgaattcatgctggaatgtcacaaccaa
 CT-H-F：
tcgaattcatgcaccaccaccaccaccacctggaatgtcacaaccaa
PLA2-F ：
tcctcgagatgaacctctatcagttcaaaaaca
PLA2-H-F ：
tcctcgagatgcaccaccaccaccaccacaacctctatcagttcaaaaaca
本发明提供了广西眼镜蛇CT和PLA2重组杆状病毒质粒pFastBac DualTM-CT和pFastBac DualTM-PLA 2，昆虫病毒重组质粒BacMid-HCT和BacMid-HPLA 2。
本发明提供了广西眼镜蛇CT和PLA2蛋白的镇痛检测效果，CT处理组小鼠的扭动次数（13 ± 0.58）显著高于PLA2处理组（15.20 ± 0.58）和对照组（20.38 ± 0.64）（P﹤0.05），说明CT具有镇痛活性，且镇痛效果好于PLA2；PLA2处理组鼠的扭动次数显著高于对照组（P﹤0.05），说明PLA2也具有镇痛活性。
本发明涉及的在杆状病毒-昆虫表达系统中生产的广西眼镜蛇CT和PLA2蛋白可作为镇痛剂，应用于临床医学镇痛药物的开发利用和基础医学的研究。
本发明的技术方案是：
以下实施例是为了更好地阐明本发明的内容，但不限制本发明。
实施例1：广西眼镜蛇CT和PLA2的成熟肽序列的获得
1．蛇毒腺总RNAR的提取
广西眼镜蛇毒腺总RNA抽提的具体步骤如下：
（1）匀浆处理 取50-100 mg的广西眼镜蛇毒腺放入消毒并用液氮预冷的研钵中，并加入适量的液氮，用研磨杵充分研磨组织，研磨完成以后加入裂解液RZ，样品体积不应超过裂解液RZ体积的十分之一。
（2）将匀浆样品，30 ℃放置5 min，使核酸与蛋白复合物分离。
（3）加入200 μL预冷的氯仿，盖好管盖，振荡器震荡15 s，室温放置3 min。
（4）4 ℃ 12000 rpm超速离心10 min，样品将会分成三层：中间层、无色的水相和黄色的有机相，核酸主要集中在水相中。把水相转移到新管中。
（5）缓慢加入步骤（4）中水相0.5倍体积的无水乙醇，温柔混匀。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4 ℃ 12000 rpm超速离心30 s，弃掉收集管中的废液。
（6）将500 μL去蛋白液RD（使用前先检查是否已加入乙醇）加入到吸附柱CR3中， 4 ℃ 12000 rpm超速离心30 s，弃掉收集管中的废液，将CR3放入收集管中。
（7）将700 μL去蛋白液RW（使用前先检查是否已加入乙醇）加入到吸附柱CR3中，室温放置2 min，4 ℃ 12000 rpm超速离心30s，弃废液。
（8）重复操作步骤（7）。
（9）4 ℃ 12000 rpm超速离心2 min，去除吸附柱CR3中的残余液体。
（10）将吸附柱CR3转入一个新的1.5 mL EP管中，向吸附柱中间悬空加入45 μL的RNase-Free ddH2O，室温静置2 min，4 ℃ 12000 rpm超速离心2 min。得到广西眼镜蛇毒腺的RNA。
（11）用1.2%的琼脂糖水平电泳检测提取的广西眼镜蛇RNA。
2．CT和PLA2的RT-PCR扩增
CT的引物序列如下：
CT1-F：TCGAATTCATGCTGGAATGTCACAACCAA
CT-H-F：TCGAATTCATGCACCACCACCACCACCACCTGGAATGTCACAACCAA
方框里的碱基GAATTC和GAATTC分别为EcoRI、EcoRI的酶切位点，斜体碱基TC为保护碱基，有底纹的碱基CACCACCACCACCACCAC为加的组氨酸纯化标签。
PLA2的引物序列如下：
PLA2-F：TCCTCGAGATGAACCTCTATCAGTTCAAAAACA
PLA2-H-F：TCCTCGAGATGCACCACCACCACCACCACAACCTCTATCAGTTCAAAAACA
方框里的碱基CTCGAG和CTCGAG分别为Xho I、Xho I的酶切位点，斜体碱基TC为保护碱基，有底纹的碱基CACCACCACCACCACCAC为加的组氨酸纯化标签。
利用反转录试剂盒迅速反转上步中的毒腺总RNA，反应体系为5×Buffer 5.0 μL，Oligo dT 18（10 μM）1.0 μL，dNTPs（10 mM）3.0 μL，M-MLVRT酶（200 μ/μL）1.0 μL，RNA酶抑制剂（40 μ/μL）0.5 μL，毒腺RNA 5.0 μL，加ddH2O至25.0 μL；反应程序：25 ℃，10 min；37 ℃，60 min；95 ℃，5 min条件下，获得cDNA第一链。然后以cDNA第一链做模板进行PCR扩增。反应体系：Buffer without Mg2+ 2.0 μL，Mg2+ 1.2 μL，CT和PLA2上下游引物（10 μM）各0.5 μL，cDNA第一链 1.0 μL，dNTPs（10 mM）0.3 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μl，加ddH2O至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃/55 ℃（CT/PLA2）退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复35次；最后72 ℃，5 min。
实施例2：CT和PLA2杆状病毒质粒的构建
1．CT和PLA2的PCR产物的回收
具体步骤如下：
（1）平衡柱子：将500 μL平衡液BL加入到吸附柱CA2中，12000 rpm超速离心1 min，倒弃废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中。
（2）切下单一的目的核酸条带，并将切下的胶块切成碎块，放入干净的EP管中，放置天平上称取重量。
（3）向上述的EP管中加入3倍体积溶胶液PN，注：胶的体积计算方法为 0.1 g=0.1 mL。后放入50 ℃恒温水浴锅中放置10 min，每2 min温和的上下翻转EP管，直到胶块完全溶解。
（4）将步骤3中所得的溶胶液加入吸附柱CA2中，25 ℃放置2 min，后12000 rpm超速离心45 s，弃废液，将吸附柱CA2重新放入收集管中。
（5）加入600 μL漂洗液PW（试剂盒使用前预先加入无水乙醇）至吸附柱CA2中，12000 rpm超速离心45 s，弃废液，吸附柱CA2重新放入收集管中。
（6）重复操作步骤5。
（7）12000 rpm超速离心2 min，除尽吸附柱中的漂洗液PW。将吸附柱CA2盖子打开，置于通风干燥处放置数分钟，彻底的晾干吸附柱，防止残留的漂洗液PW（主要是其中的乙醇）影响下一步的实验结果。
（8）将吸附柱CA2放置到一个干净的EP管中，在中间位置悬空滴加50 μL的缓冲液EB（或者灭菌后的偏碱性的ddH2O）至吸附柱膜上，室温静置2 min。12000 rpm超速离心2 min，EP管中收集的溶液即为纯化后的DNA。
2．CT和PLA2基因的克隆
将PCR产物和pMD18-T克隆载体16 ℃过夜连接，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，操作步骤如下：
（1）在无菌条件下，从-80 ℃冰箱中取出一支100 μL的大肠杆菌（DH5α）感受态细胞。分到4个EP管中，每管25 μL。
（2）取5μL的过夜连接产物，多点加入到感受态细胞中，冰上放置30 min。
（3）42 ℃恒温热击90 s。
（4）快速将EP管包埋于冰中，冰浴5 min。
（5）无菌操作，向EP管中加入200-250 μL的LB培养基，180 rpm，37 ℃，60 min。
（6）将转化的产物取50-100 μL涂布于含有Amp的LB筛选平板上，37 ℃过夜培养。
（7）次日从平板上挑取长势较好且单独的菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中，摇菌5-6 h。得到烟雾状菌液。
（8）然后用PCR、双酶切和测序的方法鉴定阳性克隆。
3．CT和PLA2杆状病毒质粒的构建
（1）将测序正确的阳性CT和PLA2重组质粒和pFastBac DualTM质粒双酶切，在T4连接酶的作用下16 ℃连接过夜，然后转化大肠杆菌感受态细胞，方法与CT和PLA2的克隆方法一样。
（2）然后用PCR、双酶切和测序的方法鉴定阳性克隆。
实施例3：CT和PLA2昆虫病毒重组质粒的构建
1．大肠杆菌DH10Bac的感受态细胞制备
（1）将大肠杆菌DH10Bac菌体涂布于LB（Kan+）固体平板上，筛选新鲜活化的DH10Bac单菌落，将菌落接种于含有2 mL LB液体培养基（Kan+）的250 mL三角烧瓶中，37 ℃过夜振荡培养，次日取0.5 mL的过夜培养菌液接种于新的50 mL同样培养基中，继续振荡培养至OD600值达到0.6左右。
（2）在无菌条件下将上述菌液转移到0 ℃预冷的50 mL EP管中，冰上放置10 min，使菌液冷却至0 ℃，4000 rpm 4 ℃离心10 min，弃上清，将管倒置数分钟使残留培养基流出。
（3）用10 mL 0 ℃预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞沉淀，温柔混匀冰上放置5 min，4000 rpm 4 ℃离心10 min，倒出培养液，吸出上清，后将管倒置数分钟使残留培养基流出。
（4）加入1 mL 0 ℃预冷的含15%甘油的0.1 M CaCl2，重悬细胞沉淀，温柔混匀后冰上放置5 min，此时的细胞状态即为感受态细胞。
（5）用0 ℃预冷的无菌吸头将感受态细胞分装于0 ℃预冷的无菌1.5 mL的EP管中，每管200 μL，立即使用或放入-70 ℃保存。
2．真核表达载体构建
（1）将上步得到的真核穿梭载体菌液提取质粒，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞。同时真核穿梭载体在此大肠杆菌中发生转座。转化的步骤见实施例3中DH5α转化步骤。
（2）发生转座的大肠杆菌的抗性筛选和蓝白筛选
用抗性和蓝白初步筛选，由于真核穿梭载体上本来就Tet和Gen的抗性，加上DH10Bac菌种上有Kan的抗性，同时具有乳糖操纵子的结构，所以用Tet/Gen/Kan/LB/ X-Gal/ IPTG平板蓝白筛选筛选。选取白色单菌落涂布于新的Tet/Gen/Kan/LB/ X-Gal/ IPTG平板上继续培养，如此筛选3代依然为白色菌落的可视为转座完全。
（3）用M13通用引物PCR检验
由于Bacmid质粒很大，超过135kb，采用酶切的方法不能切开质粒，所以利用PCR技术来鉴定Bacmid是否发生重组，鉴定目的片段的插入是否正确。即用通用的M13引物扩增Bacmid质粒的Mini-attTn7 元件，通过扩增出来的目的片段大小确定是否重组，没有重组的为273 bp，发生重组的DNA扩增出来的片段大小应该为2560 (2287+273) bp（Tn7L 元件）加上目的基因的基因大小。以菌液为模板，M13引物为引物进行PCR，反应体系：Buffer without Mg2+ 2.0 μL，Mg2+ 1.2 μL，M13-F（10 μM） 0.5 μL，M13-R（10 μM） 0.5 μL，菌液/质粒1.0 μL，dNTPs（10 mM） 0.3 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，加ddH2O至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复35次；最后72 ℃延伸5 min。
实施例4：昆虫病毒颗粒的包装和目的蛋白的获得
1．大提阳性菌的质粒
具体步骤如下：
（1）取100 mL 过夜培养的菌液，10000 rpm超速离心3 min，弃上清，收集细菌。并倒置EP管于干净的吸水纸上。使培养基充分流尽。
（2）加入10 mL溶液P1(试剂盒使用前加入RNase A)至有菌体沉淀的EP管中，用移液器反复吹打彻底使细菌细胞沉淀悬浮。
（3）加入10 mL溶液P2至EP管中，立即温柔地上下翻转8次，充分混匀后室温静置5 min。
（4）加入10 mL溶液P4至EP管中，立即温柔地上下翻转8次，充分混匀，防止白色絮状沉淀在局部形成。后室温静置10 min。10000 rpm超速离心10 min，使白色絮状物沉淀，将全部上清倒入过滤器CS1中，避免倒入絮状沉淀，后慢慢推动过滤器推柄，将滤液收集于干净的50 mL的EP管中。
（5）加入0.35倍上述滤液体积的异丙醇和0.5倍异丙醇体积的5M NaCl，温柔上下颠倒数次，使充分混匀。
（6）4 ℃ 10000 rpm超速离心30 min，缓慢倒掉上清液，倒置在吸水纸上，使液体全部留出。
（7）加入6 mL 70%乙醇，充分混匀，后4 ℃ 10,000 rpm超速离心10 min，缓慢倒掉上清液，倒置在吸水纸上，使液体全部留出。。
（8）重复步骤8。
（9）打开EP管关口，室温放置15 min，使乙醇挥发，后加入1 mL 洗脱缓冲液TB，充分溶解后，即得到大量抽提的质粒。
2．真核表达载体转染昆虫细胞
培养条件：
培养基：SF-900 II （可加10%血清，也可不加。）
温度：27℃ 
CO2浓度：0%
全温震荡培养箱（生化培养箱），50-90 rpm培养。
转染的具体步骤如下：
（1）取处于对数生长期同时细胞活力超过95%的昆虫Sf9细胞（一般培养时间为48 h~72 h）接种于48孔细胞培养板中，每孔0.5 mL，共含2.5×105个细胞；即细胞密度约为5.0×105个细胞/mL。
（2）让细胞在27 ℃静置30 min。
（3）无菌操作准备以下溶液：
A、杆状病毒DNA混合物：将0.25 μg(约1 μL)大量提取的Bacmid DNA稀释于25 μL无抗生素无血清的Sf-900 II SFM中。轻柔混匀。
B、Cellfectin ReagentⅡ混合液：23 μL无抗生素无血清的Sf-900 II SFM中加入2 μL转染试剂Cellfectin ReagentⅡ。轻柔混匀。
C、DNA-脂质体混合物：将A液和B液混合，大约51 μL，轻轻混匀，室温放置30 min。
（4）在C液温育到快30 min时，除去细胞培养板中的旧培养液。
（5）加200 μL无抗生素无血清的Sf-900II SFM于盛有C液的离心管中，轻轻混匀，然后将该混合液贴壁加入（1）中的细胞培养板孔中。
（6）27℃培养箱中静置培养5 h。
（7）将上步的混合液去除，加入500 μL的Sf-900II SFM（+10% FBS），27 ℃，静置培养直至细胞病变，一般出现在72 h以后。
3．病毒收集和扩增
（1）等细胞完全病变以后，收集杆状第一代病毒。将细胞板中的上清悬液吸出移至干净的EP管中，即为第一代病毒，4 ℃避光保存。
（2）取处于对数生长期同时细胞活力超过95 %的昆虫Sf9细胞（一般培养时间为48 h~72 h）接种于48孔细胞培养板中，每孔2 mL，共含2×106个细胞；即细胞密度约为1×106个细胞/mL。
（3）27 ℃无菌静置30 min，使细胞贴壁。
（4）每孔中加入0.5 mL的一代病毒。
（5）27℃静置培养直至细胞发生病变，大概48 h~72 h。
（6）收集2代病毒，4 ℃避光保存。
（7）同样的方法扩增得到3代病毒，3代病毒的病毒滴度可以用于昆虫细胞的蛋白表达。
4．细胞蛋白收集和蛋白鉴定
（1）在50 mL培养瓶中接种10 mL的处于对数生长期同时细胞活力超过95%的昆虫细胞Sf9，控制细胞密度在1×106个/ mL左右。将3代杆状病毒按照1:5的比例加入到培养瓶中（即加入2 mL病毒），27 ℃静置培养，在细胞失去贴壁能力时收集细胞和上清。
（2）各种不同组分的分离
收集细胞液1000 rpm离心5 min得到的上清为培养基组分。沉淀再用200 μL的PBS重悬，再反复冻融使细胞裂解，5000 rpm低温离心5 min，上清为可溶蛋白成分，沉淀再重悬于200 μL PBS中，为细胞不溶蛋白组分。均放入-20 ℃保存备用。
（3）SDS-PAGE胶的制备，具体步骤如下：
按照蛋白电泳仪说明说装好干净干燥的玻璃板。配置12%分离胶制备，各成分加入后迅速旋涡混匀，用注射器将混合液迅速地加入玻璃板缝隙中，预留出浓缩胶（约为20%）的空间。再用轻轻在加入少量异丙醇封顶，异戊醇能压平分离胶的平面同时也能防止氧对分离胶聚合。凝胶聚合完成约一小时后，倒出上层的异丙醇，用双蒸水清洗封胶层数次，再用滤纸吸干封胶层中的水，防止影响溶缩胶的溶度。配置5%分离胶制备，各成分加入后迅速旋涡混匀，用注射器将混合液小心迅速地注入玻璃板剩余的间隙中，装满后迅速插入加样梳，避免梳子和胶之间有气泡。室温静置1h，使胶完全凝固，然后小心拔下梳子。胶制作完成。
（4）将上述得到的不同细胞位置的蛋白液中加入1/2体积的4×SDS电泳上样液。并在沸水中煮5min，使蛋白充分变性。
（5）然后用10 μL的蛋白变性液上SDS-PAGE胶电泳。先用80 V跑到溴酚蓝完全进入分离胶后，升电压到120 V跑到溴酚蓝差不多完全跑完分离胶，大约4小时左右。
（6）关闭电源，撬开玻璃板，取出凝胶，做好标记放入蛋白染色液中，50 ℃恒温摇床1 h。
（7）从染色液中取出凝胶放入蛋白脱色液中，50 ℃恒温摇床脱色4 h，其间更换脱色液3到4次，直到条带清楚。记录结果并拍照。
（8）质谱检测表达蛋白，将条带清楚的目的蛋白切下来，委托亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室公共实验平台进行质谱检测。
实施例5：CT和PLA2蛋白的纯化
目的蛋白纯化步骤如下：
（1）收集转染后的昆虫细胞，1000 g，离心5 min。用PBS冲洗细胞数次，1000 g，离心5 min。
（2）向清洗过的细胞中加入裂解缓冲液，每1-2×107个细胞中加入4 mL的细胞裂解液。冰上放置10 min。
（3）将上述的溶胞产物，10000 g，4 ℃离心10 min。离心出细胞碎片和DNA。取上清放入新管。
（4）按照每4 mL上清加200 μL 50%的Ni-NTA的比例加入Ni-NTA。200 rpm震荡1-2 h。
（5）将溶胞产物和Ni-NTA的混合液上柱。
（6）打开出口盖，收集经过滤膜的液体。
（7）加入800 μL的清洗缓冲液，温柔混匀清洗缓冲液和Ni-NTA，然后打开出口盖，放出经过滤膜的液体。
（8）重复步骤7。
（9）加入100 μL的洗脱缓冲液，温柔混匀清洗缓冲液和Ni-NTA，然后打开出口盖，收集经过滤膜的液体。
（10）重复步骤9，3遍，收集经过滤膜的液体-20℃备用。
实施例6：CT和PLA2蛋白质定量
具体操作步骤如下：
（1）配制25mg/mL 的蛋白标准溶液：于蛋白标准(20mg BSA)中加入0.8mL蛋白标准配制液，充分溶解，置于-40℃长期保存。 
（2）稀释25mg/mL 蛋白标准溶液至终浓度为0.5mg/mL。
（3）配制BCA工作液：50:1=试剂A:试剂B，充分混匀。 
（4）将标准品加到96孔板的标准品孔中。
（5）给孔依次加入BCA 工作液200μL，37℃恒温箱中孵育45 min。 
（6）利用酶标仪在A595nm 波长进行比色。绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。并统一用PBS将其调整为0.021mg/mL。
实施例7：CT和PLA2活性的检测
CT和PLA2活性通过小鼠醋酸扭体镇痛来检测，具体操作步骤如下：
（1）取90只体重在25g左右，雌雄各半的成年小白鼠，随机分成3组，CT实验组、PLA2实验组和PBS对照组，每组30只。
（2）分别向腹腔注射25μL，浓度为0.021mg/mL的CT和PLA2和PBS。
（3）45min后，分别以每只小鼠按10mL/kg剂量腹腔注射0.6%醋酸，使小鼠腹部产生疼痛而扭体和腹部收缩抽搐。
（4）观察10min内小鼠的扭体次数，扭体次数越少的说明抑制疼痛效果越好。
结果显示，CT处理组小鼠的扭动次数（13±0.58）显著高于PLA2处理组（15.20±0.58）和对照组（20.38±0.64）（P﹤0.05），说明CT具有镇痛活性，且镇痛效果好于PLA2；PLA2处理组鼠的扭动次数显著高于对照组（P﹤0.05），说明PLA2也具有镇痛活性。
本发明突出和显著的特点是通过基因工程的技术手段，在体外获得了具有较高镇痛活性的广西眼镜蛇CT和PLA2蛋白。
附图说明
图1：广西眼镜蛇毒腺总RNA、CT和PLA2的RT-PCR扩增。A，广西眼镜蛇毒腺总RNA；B，广西眼镜蛇CT基因的RT-PCR扩增结果，M 为DL 2000 Marker，1为带有His标签的CT成熟肽序列；C，广西眼镜蛇PLA2基因的RT-PCR扩增结果，M为DL 2000 Marker，1为带有His标签的PLA 2的成熟肽序列。
图2：目的基因CT、PLA 2和pFastBac DualTM的双酶切电泳图。M为DL1000 Marker；p-HCT、p-H-PLA2和Dual分别表示带有His标签的pMD18-T-CT、pMD18-T-PLA2和pFastBac DualTM的双酶切电泳图。
图3：真核穿梭载体的双酶切电泳图。A为带有His标签的pFastBac DualTM-CT的双酶切电泳图，M1为DL 2000 Marker；B为带有His标签的pFastBac DualTM-PLA 2的双酶切电泳图，M2为1KD Marker。
图4：A为各种真核表达载体的PCR检测。1-3泳道分别为BacMid（空）、BacMid-HCT和BacMid-HPLA2的PCR产物，M为1KD Marker；B为病毒的PCR检测结果。1-3泳道分别为BacMid（空）、BacMid-HCT和BacMid-HPLA 2的PCR产物，M为1KD Marker。
图5：细胞上清的SDS-PAGE电泳。M为蛋白标准分子量；B：空白对照；1：空白病毒感染的细胞上清；2-7泳道为各病毒感染的细胞上清。
图6：Ni柱脱纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳。M为蛋白分子量；1和2分别代表Ni柱纯化后的CT蛋白和PLA2蛋白电泳条带。
图7：小鼠扭体次数差异性分析。表示差异显著（P<0.05）。
<110> 南宁培元基因科技有限公司
<120> 在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2的方法
 
<160> 4
 
<210> 1
<211> 186
<212> DNA
<213> 眼镜蛇（Najanaja）
 
<221> CT
<222> (1)...(186)
 
<400> 1
ctggaatgtc acaaccaaca atcatcgcaa actccaacca ctacaggttg ttcaggtggg           60
gagaccaatt gctataaaaa gcgttggcgt gatcaccgtg gatatagaac cgagagggga         120
tgtggttgcc cttcagtgaa gaacggcatt gaaattaact gttgcacaac agacagatgc            180
aacaat                                                                                                            186
 
<210> 2
<211> 357
<212> DNA
<213>眼镜蛇（Najanaja）
 
<221> PLA2
<222> (1)...(357)
 
<400> 2
aacctctatc agttcaaaaa catgattcaa tgtactgtcc ccagtcgatc ttggtgggat               60
tttgcggact atggttgcta ctgcggacgc ggaggcagcg ggacaccagt agacgacttg         120
gataggtgct gccaggttca tgacaactgc tataatgaag ccgaaaaaat ttccggatgc           180
tggccctact tcaagaccta ttcatacgag tgttctcaag gcacactcac ctgcaaaggt              240
ggcaacaatg cgtgtgcagc tgctgtctgt gattgtgacc gcttggcagc catctgcttc             300
gccggagccc cttacaacaa taacaactac aatatcgacc tcaaggcacg ttgccaa               357
 
<210> 3
<211> 62
<212> PRT
<213>眼镜蛇（Najanaja）
 
<221> CT
<222> (1)...(62)
 
<400> 3
Leu Glu Cys His Asn Gln Gln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly
1                          5                               10                             15
Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His
                   20                               25                             30
Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Ser Val Lys Asn
              35                               40                             45
Gly Ile Glu Ile Asn Cys Cys Thr Thr Asp Arg Cys Asn Asn
       50                            55                              60
 
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213>眼镜蛇（Najanaja）
 
<221> PLA2
<222> (1)...(119)
 
<400> 4
Asn Leu Tyr Glu Phe Lys Asn Met Ile Glu Cys Thr Val Pro Ser Arg
1                          5                               10                          15
Ser Typ Typ Asp Phe Ala Asp Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Arg Gly Gly
                     20                              25                           30
Ser Gly Thr Pro Val Asp Asp Leu Asp Arg Cys Cys Gln Val His Asp
              35                             40                              45
Asn Cys Yyr Asn Glu Ala Glu Lys Ile Ser Gly Cys Trp Pro Tyr Phe
       50                              55                           60
Lys Thr Tyr Ser Tyr Glu Cys Ser Gln Gly Thr Leu Thr Cys Lys Gly
65                             70                            75                               80
Gly Asn Asn Ala Cys Ala Ala Ala Val Cys Asp Cys Asp Arg Leu Ala
                            85                              90                               95
Ala Ile Cys Phe Ala Gly Ala Pro Tyr Asn Asn Asn Asn Tyr Asn Ile
                     100                         105                             110
Asp Leu Lys Ala Arg Cys Gln
              115

Claims (5)

1.一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2蛋白的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）从眼镜蛇毒腺提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得编码眼镜蛇CT和PLA2蛋白的核苷酸序列，核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示；
（2）将眼镜蛇蛇毒蛋白（Cobrotoxin，CT）和磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2）蛋白的核苷酸序列克隆到昆虫杆状病毒载体pFastBac DualTM中，再通过转座获得BacMid重组质粒，在昆虫Sf9细胞中表达CT和PLA2蛋白；
（3）采用亲和层析方法对CT和PLA2蛋白进行纯化，从而得到目的蛋白CT和PLA2，其氨基酸序列分别如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示。
2.根据权利要求1所述的在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤（3）中，所述的亲和层析方法为Ni柱亲和层析纯化法。
3.根据权利要求2所述的在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2蛋白的方法，其特征在于：所述的Ni柱亲和层析纯化法，具体包括如下步骤：
（1）收集转染后的昆虫Sf9细胞，裂解细胞后离心得到上清液；
（2）将上清液和Ni-NTA的混合液上柱；
（3）用清洗缓冲液洗去非特异结合型蛋白；
（4）加入洗脱缓冲液，洗脱下的蛋白即为CT和PLA2蛋白。
4.根据权利要求1所述的所述的在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA2蛋白的方法，其特征在于：所述的CT和PLA2蛋白，其镇痛活性通过小鼠的扭体实验来进行检测。
5.权利要求1所述的眼镜蛇CT和PLA2蛋白在制备镇痛药物中应用。
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