CN105542010A - 脂蛋白相关磷脂酶a2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途，本发明采用多种表达系统表达脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，并用不同表达系统表达出来的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白进行混合后免疫小鼠，得到脾脏细胞，然后用脾脏细胞制备融合细胞即为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞注射小鼠得腹水，腹水纯化后得到不同的单克隆抗体，进行效价验证之后取优选的抗体，后对单克隆抗体进行DNA测序，确定了脂蛋白相关磷脂酶A2抗体可变区序列。采用本发明的方法制备的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，具有稳定、高效等诸多优良特点，适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料，尤其是适用于化学发光等高端诊断试剂盒开发的抗体原料。

Description

脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途。

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2由PLA2G7基因编码，又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)，属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶，其催化活性不需要Ca²⁺。人血浆脂蛋白相关磷脂酶A2的分子量为45KDa，其主要由巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、肝细胞等分泌生成，并受到炎性介质的调节。比如，γ-干扰素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子促进其分泌。脂蛋白相关磷脂酶A2的主要作用包括：产生十二烷酸类炎性物质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失。

急性心脑血管疾病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型。近年来，随着对动脉粥样硬化研究的不断深入，许多炎性因子被发现，炎性已经被公认是动脉粥样硬化发展过程中的核心因素。传统的炎性标志物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、纤维蛋白原、C反应蛋白等，在促进动脉粥样硬化斑块形成中的作用逐渐被众多实验所证实。脂蛋白相关磷脂酶A2作为一种新近研究的炎性反应介质，具有促进动脉粥样硬化作用，与心脑血管事件的发生有密切关系，为心脑血管疾病的诊断增添了一种新的手段，并成为治疗该类疾病新的潜在目标靶点。

目前关于脂蛋白相关磷脂酶A2的研究报道越来越多，急需开发出特异性强的抗体用于脂蛋白相关磷脂酶A2的检测。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供性能优良的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体；

本发明的另一目的是提供由蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体组合而成的抗体对。

本发明的另一目的是提供脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体、抗体对的制备方法。

本发明的另一目的是提供脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的用途。

本发明的另一目的是提供由脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体组合而成的抗体对的用途。

本发明通过实验验证了抗体的效果和序列测定，为脂蛋白相关磷脂酶A2的检测提供了性能优良的单克隆抗体，且适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，分别为CSB-DA113BmN①、CSB-DA113BmN②和CSB-DA113BmN③；

CSB-DA113BmN①轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所述；

CSB-DA113BmN①重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所述；

CSB-DA113BmN②轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所述；

CSB-DA113BmN②重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所述；

CSB-DA113BmN③轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所述；

CSB-DA113BmN③重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所述。

脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、采用多种表达系统表达脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，重组脂

蛋白相关磷脂酶A2序列如序列表SEQIDNO.1所述；

步骤二、分离纯化步骤一中各表达系统表达的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白；

步骤三、将步骤二之后的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白进行混合后免疫宿主动物；

步骤四、取所述免疫宿主动物的脾脏细胞制备融合细胞；

步骤五、采用所述融合细胞制备脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体。

作为进一步的优选，在步骤一中，各表达系统分别为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。

作为进一步的优选，在步骤一、二中，脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达和分离纯化，具体包括如下：

A、合成SEQIDNO.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如序列表SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至pUC18质粒，以此质粒为模板，进行PCR扩增Lp-PLA2基因；

B、双酶切pET28a表达质粒以及PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；

C、采用T4DNA连接酶连接回收后的载体和PCR产物，T4DNA连接酶的反应条件为16℃连接8h-16h；

D、连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含卡拉霉素的LB固体培养基，将培养皿置于37℃培养箱培养8h-16h；

E、挑取若干单菌落，特异引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物经过跑琼脂糖凝胶电泳，选取条带大小为1300bp左右对应的菌落进行基因测序；

F、编号为1、3、4和10对应的菌株基因测序结果正确，将四株菌株经扩大培养，提取其中重组质粒，然后转化至E.coliBL21表达菌株，转化成功的菌株分别命名为Lp-PLA2-BL21-1、Lp-PLA2-BL21-3、Lp-PLA2-BL21-4和Lp-PLA2-BL21-10；

G、将四种表达菌种接种于3mLLB液体培养基中37℃，200rpm过夜培养，取200μL培养液添加200μL30％甘油，均匀混合后置于-80℃，作为工作种子备用；取30μL过夜培养菌液加入到含3mLLB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，继续37℃震荡培养3hr；

H、取1ml诱导培养的菌液，12000g×30s离心收获菌体，用100μL1％SDS重悬，混匀，100℃加热10min；然后12000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE分析；

I、经过SDS-PAGE分析Lp-PLA2-BL21-1、Lp-PLA2-BL21-3、Lp-PLA2-BL21-4和Lp-PLA2-BL21-10蛋白产量分别为2.1、3.8、2.5和4.3mg/mL，取产量最高的Lp-PLA2-BL21-10进行放大试验；

J、取保存于-80℃的Lp-PLA2-BL21-10菌种20μL转接入20mL液体LB培养基,37℃，200rpm过夜培养；取20mL过夜培养菌液加入到含2000mLLB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6，加入IPTG诱导剂(终浓度0.5mM)，然后降低温度到30℃继续培养3h；

K、收集发酵液，6000g离心10min收集菌体，将菌体悬浮于40mL预冷的NTA-0(20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH8.0)缓冲液，然后超声波破碎细菌，控制功率为300W，超声4s，暂停4s，超声90次，最后20000g，4℃离心30min，收集上清以及细胞碎片；

L、取少量上清和细胞进行SDS-PAGE检测，剩余上清过Ni-NTA层析柱，纯化得到分子量为45kDa目的蛋白。

作为进一步的优选，在步骤一、二中，脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在酵母表达系统中的表达和分离纯化，具体包括如下：

A、合成序列表1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至pPIC9K质粒，得到的连接产物转化到感受态菌E.coliTOP10，转化后将菌液涂布于含50μg/mL卡拉霉素和1mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，将培养皿置于37℃培养箱培养12h，挑选单菌落PCR和双酶切验证正确后，进行测序，得到测序正确的重组子；

B、将上述测序正确的三个重组子接种到含3mLLB液体培养基，200rpm，37℃培养8-16h，无菌条件下吸取200μL菌液保种，剩下的2.8mL菌液接种于300mLLB液体培养基(含50μg/mL卡拉霉素和1mg/mL氨苄青霉素)，200rpm，37℃培养12h，然后大提质粒，质粒纯度99％以上，浓度在10μg/μL左右；

C、用Sac1酶对上述大提质粒进行线性化，37℃水浴过夜后回收线性化质粒，然后用Eppendorf电转化仪分别电转化(电压1500V，时间5ms)线性化质粒于GS115感受态中；涂布150uL转化后的菌液于(1mg/mLG418)RDB固体培养基，30℃培养4-5天；

D、小量表达筛选：从RDB平板上挑选20株单菌落，PCR扩增目的基因PLA2G7，琼脂糖凝胶电泳大小正确的条带鉴定为阳性，得到17个阳性菌落，挑取这些菌落接种于1.5mLYPG液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养48h，吸取一定量菌液与甘油均匀混合后保存于-20℃备用，将得到7种阳性株接种于1.5mLYPG液体培养基，30℃，200rpm培养24h，然后加入1％甲醇诱导，培养24h再加入1％甲醇诱导，继续培养24h后离心收集上清，TCA沉淀后，SDS-PAGE分析重组Lp-PLA2表达量，最高产量约3mg/mL。

E、摇瓶发酵：将产量最高的细胞株经前培养24h，按1％接种量接种至1L的YPG液体培养基中，30℃，200rpm培养24h，然后装入500mLBackman离心瓶，8000rpm，3min离心，用YP(含1％甲醇)重悬菌体，倒入原来的三角瓶中，并加入1LYP(含1％甲醇)和200μL消泡剂，30℃，200rpm培养72h，每隔24h加入10mL甲醇诱导；最后离心取上清，浓缩后纯化。

F、将上清过Ni-NTA层析柱，然后用0-500mMNaCl(pH8.0)洗脱，收集A280吸收峰的蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化蛋白浓缩后备用。

作为进一步的优选，在步骤一、二中，脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在昆虫表达系统中的表达和分离纯化，具体包括如下：

A、杆状病毒转移载体的构建：合成SEQIDNO.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至改造后的pFastbac质粒(modifiedpFastbac，简称modpFastbac)，得到的连接产物modpFastbac-PLA2G7转化到感受态菌E.coliTOP10，得到的转化子经过菌落PCR和双酶切验证正确后，送到测序公司进行测序，得到测序正确的重组子；

B、重组Bacmid的筛选：取2μL重组质粒modpFastbac-PLA2G7转化至150μL感受态菌株DH10Bac，37℃，200rpm震荡培养4h使之发生转座，将培养后的菌液按10、100、1000倍分别稀释，然后各取100μL分别涂布于含“三抗”(卡那霉素，四环素，庆大霉素)的LB固体培养基(含100μg/mLx-gal和20μg/mLIPTG)的平板上，涂布完成的平板于37℃倒置培养24～48h，观察蓝白斑的生长情况，发生转座后的DH10Bac细菌因其LacZ基因被插入失活，而使含有Bacmid的大肠杆菌菌落成为白色，挑取单个白色菌落提取重组BacmidDNA，并用PCR扩增鉴定是否携带PLA2G7基因；

C、杆状病毒粒子制备：扩大培养含PLA2G7的DH10Bac菌株，采用试剂盒(Invitrogen，K2100-02)提取bacmid，将25μL重组BacmidDNA，10μL转染试剂cellfectinII(Invitroge)加入到200μL不完全培养基，室温孵育30min，然后加入到生长有T25细胞的六孔板的孔中，轻轻洗涤细胞壁上的细胞，混匀后28℃继续培养6h；移除质粒、转染剂混合物，加入2mL完全培养基，28℃孵育6天；1500rpm离心5min收集六孔板上清，即P1代病毒粒子，取适当体积的P1杆状病毒粒子原液加入到汇聚度达90％的Sf9细胞中，28℃恒温培养箱中，静置培养3天后，1500rpm，5min离心收集细胞培养上清，即为P2代病毒粒子。得到的P2病毒粒子再次加入到汇聚度达90％的Sf9细胞中，28℃恒温培养箱中，静置培养3天后，1500rpm，5min离心收集细胞培养液中的病毒粒子，获得更高滴度的P3代杆状病毒粒子，4℃冰箱中避光保存备用；

D、蛋白大量表达：取适量的P3代病毒粒子感染sf9细胞，28℃恒温培养箱中，静置培养3天，倒掉皿中的培养基上清，注意动作尽量轻柔，不要大幅甩动培养皿，每皿中加入1ml的裂解液，在振荡仪上轻微振荡10min后(需将培养皿置于冰块上保持低温)，显微镜下观察细胞是否裂解完全，如果发现细胞未裂解完全，继续振荡直至裂解完全，裂解完全后，低温冷冻离心机12000rpm离心5min，收集上清；

E、蛋白纯化：将含蛋白的上清过Ni-NTA层析柱，然后用0-500mMNaCl(pH8.0)洗脱，收集A280吸收值的蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化蛋白浓缩后备用。

作为进一步的优选，在步骤一、二中，脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在哺乳动物表达系统中的表达和分离纯化，具体包括如下：

A、合成SEQIDNO.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至哺乳表达质粒pCMV6-entry，得到的连接产物pCMV6-entry-PLA2G7，将连接产物转化至感受态菌E.coliTOP10，转化后将菌液涂布于含50μg/mL卡拉霉素LB固体培养基，将培养皿置于37℃培养箱培养12h，挑选单菌落PCR和双酶切验证正确后，进行测序，得到测序正确的重组子，将这些菌株保存至-20℃备用；

B、将上述测序正确的四个重组子活化后，按1％接种量接种到300mLLB液体培养基(含50μg/mL卡拉霉素)，200rpm，37℃培养12h，然后大提质粒，要求质粒OD260/OD280＝1.8～1.9；

C、在6孔板用DMEM培养基培养HEK-293T细胞，采用磷酸钙共沉淀法将提取质粒转染至HEK-293T，然后培养48h后，取培养上清，用抗myc标签抗体进行WB检测，筛选出表达产量最高的表达株；

D、扩大培养100皿细胞，用磷酸钙共沉淀法将质粒分别转染至HEK-293T细胞，然后培养96h后收集上清；

E、超滤浓缩上清，经过Ni-NTA层析柱，然后用0-500mMNaCl(pH8.0)洗脱，收集A280吸收峰的蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化蛋白浓缩后备用。

作为进一步的优选，所述宿主动物为Balb/C雌性小鼠，所述融合用细胞系为SP2/0。

作为进一步的优选，在步骤三脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白混合免疫小鼠中，将多种所述重组蛋白表达系统制备得到的重组蛋白等比例混合。

作为进一步的优选，在步骤三脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白混合免疫小鼠中，按每只老鼠50μg脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，将多种重组蛋白表达系统制备得到的重组蛋白等比例混合，并加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，免疫6-8周龄Balb/C雌性小鼠；每两周免疫一次所述小鼠，每次免疫取50μg不同表达系统表达的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白与弗氏不完全佐剂混匀；免疫四次后测效价，若效价达到1:10000以上，按50μg/mouse腹腔冲击免疫，三天后在无菌条件下取出小鼠脾脏，并制成单个脾细胞悬液。

作为进一步的优选，在步骤四制备融合细胞中，包括细胞融合和细胞建株，得到杂交瘤细胞。

作为进一步的优选，细胞融合如下：制备脾细胞悬液并用PBS洗涤干净后混入SP2/0细胞，按脾细胞:SP2/0＝10:1混合并离心，1000rpm离心5min后滴干混合细胞，轻敲弹松细胞团块，在37℃水浴中加入1mLPEG1450，加完后在37℃水浴中反应2min，沿管壁缓慢加入20mLRPMI-1640终止液；融合细胞终止后于800rpm离心5min，并吸干残留液体；HAT培养基重悬融合细胞，转入96孔细胞培养板培养；待融合细胞在HAT中培养7天左右后换成HT培养基；细胞建株如下：待孔中融合板细胞长至中等大小约104个细胞以上时开始检测，分别取50μL细胞培养液加入预先包被Lp-PLA2蛋白的微孔中，检测细胞上清抗体效价(即阴性对照<1.0，阳性对照>1.0)从检测为阳性对应的微孔取阳性细胞进行亚克隆，利用HT培养基通过有限稀释法将筛选得到细胞稀释至1个/孔，将细胞铺于96孔细胞培养板；待单克隆细胞长至中等大小，密度约104个细胞以上即可检测效价，然后再次选取其中阳性细胞重复一次亚克隆筛选，待检测到所有微孔中细胞上清都是阳性后，再进行一次同样的单克隆，如果有限稀释法后再次得到全阳性结果，能确定此时筛选到阳性细胞株，所得的阳性细胞株即为杂交瘤细胞。

作为进一步的优选，在步骤五融合细胞制备抗体时，包括腹水制备和腹水纯化步骤，腹水纯化后得到不同的单克隆抗体。

作为进一步的优选，腹水制备步骤如下：按0.5mL石蜡/只小鼠进行腹腔注射液体石蜡，7～10天后于腹腔内注射无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠约106个细胞，约7～10天后可用无菌注射器采集腹水，2000rpm离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清分装，-80℃保存；腹水纯化步骤如下：腹水经50％SAS沉淀，沉淀物用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重新溶解，并经0.22μm微孔滤膜滤过，取待纯化的样品上样ProteinG-琼脂糖亲和层析柱(HiTrapProteinG，PharmaciaBiotech)，流速为0.5mL/min，使得抗体与proteinG结合，最后用洗脱液进行洗脱，得到抗体SDS-PAGE鉴定其纯度。

脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体组合成的抗体对，包括如下：

A组合：CSB-DA113BmN①-CSB-DA113BmN③；

B组合：CSB-DA113BmN②-CSB-DA113BmN③；

C组合：CSB-DA113BmN③-CSB-DA113BmN①；

D组合：CSB-DA113BmN③-CSB-DA113BmN②。

脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体对的制备方法，包括如下步骤：将所有的所述单克隆抗体CSB-DA113BmN①、CSB-DA113BmN②和CSB-DA113BmN③，分别用作捕获抗体和标记抗体，然后组合成不同抗体对应用于双抗夹心法的免疫检测；不同抗体对分别对各种浓度的Lp-PLA2蛋白进行定量检测，以选择出最好的“捕获抗体-标记抗体”配对方式；最后对优选的单克隆抗体所对应的细胞株提取RNA，然后经RT-PCR反转录得到cDNA，利用小鼠IgG抗体轻链和重链可变区的通用引物进行DNA测序，确定抗体的可变区序列。

所述脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体对应用于双抗夹心法的免疫检测中。

所述单克隆抗体应用于制备检测脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂、药剂或试剂盒中。

本发明的有益效果是：本发明采用多种表达系统表达脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，并用不同表达系统表达出来的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白进行混合后免疫小鼠，得到脾脏细胞，然后用脾脏细胞制备融合细胞即为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞注射小鼠得腹水，腹水纯化后得到不同的单克隆抗体，进行效价验证之后取优选的抗体，后对单克隆抗体进行DNA测序，确定脂蛋白相关磷脂酶A2抗体可变区序列。本发明所述制备方法稳定，得到产物纯化程度高。

本申请主要包括如下研究内容：1、脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白制备及分离纯化；2、脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体制备及优化。采用本发明的方法制备的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，具有稳定、高效等诸多优良特点，适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料，尤其是适用于化学发光等高端诊断试剂盒开发的抗体原料。

所有的所述脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体分别用作捕获抗体和标记抗体，然后组合成不同抗体对应用于双抗夹心法的免疫检测。不同抗体对分别对各种浓度的Lp-PLA2进行定量检测，最后选择出最好的配对方式(捕获抗体-标记抗体)，经实验证实，所述单克隆抗体及抗体对能够满足临床检测需求。

附图说明

图1为本发明实施例A抗体对组合对18例健康志愿者血样和18例动脉粥样硬化或小脑梗塞患者血样进行检测的检测结果。

图2为本发明实施例B抗体对组合对18例健康志愿者血样和18例动脉粥样硬化或小脑梗塞患者血样进行检测的检测结果。

图3为本发明实施例C抗体对组合对18例健康志愿者血样和18例动脉粥样硬化或小脑梗塞患者血样进行检测的检测结果。

图4为本发明实施例D抗体对组合对18例健康志愿者血样和18例动脉粥样硬化或小脑梗塞患者血样进行检测的检测结果。

其中正常组血样来源为18名健康志愿者，病理组样本采集于动脉粥样硬化和小脑梗塞患者。图1-4中左边柱状图为正常组，右边柱状图为病理组。

具体实施方式

本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其他组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

本申请实施例主要包括两个方面的研究内容：1、脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白制备及分离纯化；2、脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体制备及优化。

1、脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白制备及分离纯化；

脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在不同表达系统中的表达及分离纯化，具体的包括脂蛋白相关磷脂酶A2在大肠杆菌表达系统中的表达及分离纯化、脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在酵母表达系统中的表达及分离纯化、脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在昆虫表达系统中的表达及分离纯化、脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在哺乳动物表达系统中的表达及分离纯化，具体的每种表达系统表达脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白的技术及分离纯化的方案如下所述：

(1)脂蛋白相关磷脂酶A2在大肠杆菌表达系统中的表达及分离纯化

脂蛋白相关磷脂酶A2在大肠杆菌表达系统中的表达，具体涉及以下技术内容：

A、合成SEQIDNO.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至pUC18质粒，以此质粒为模板，进行PCR扩增Lp-PLA2基因；

B、双酶切pET28a表达质粒以及PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；

C、采用T4DNA连接酶连接回收后的载体和PCR产物，T4DNA连接酶的反应条件为16℃连接8h-16h；

D、连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含卡拉霉素的LB固体培养基，将培养皿置于37℃培养箱培养8h-16h；

E、挑取若干单菌落，特异引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物经过跑琼脂糖凝胶电泳，选取条带大小为1300bp左右对应的菌落进行基因测序；

F、编号为1、3、4和10对应的菌株基因测序结果正确。将四株菌株经扩大培养，提取其中重组质粒，然后转化至E.coliBL21表达菌株，转化成功的菌株分别命名为Lp-PLA2-BL21-1、Lp-PLA2-BL21-3、Lp-PLA2-BL21-4和Lp-PLA2-BL21-10；

G、将四种表达菌种接种于3mLLB液体培养基中37℃，200rpm过夜培养，取200μL培养液添加200μL30％甘油，均匀混合后置于-80℃，作为工作种子备用。取30μL过夜培养菌液加入到含3mLLB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，继续37℃震荡培养3hr；

H、取1ml诱导培养的菌液，12000g×30s离心收获菌体，用100μL1％SDS重悬，混匀，100℃加热10min；然后12000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE分析；

I、经过SDS-PAGE分析Lp-PLA2-BL21-1、Lp-PLA2-BL21-3、Lp-PLA2-BL21-4和Lp-PLA2-BL21-10蛋白产量分别为2.1、3.8、2.5和4.3mg/mL，取产量最高的Lp-PLA2-BL21-10进行放大试验；

J、取保存于-80℃的Lp-PLA2-BL21-10菌种20μL转接入20mL液体LB培养基,37℃，200rpm过夜培养。取20mL过夜培养菌液加入到含2000mLLB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6，加入IPTG诱导剂(终浓度0.5mM)，然后降低温度到30℃继续培养3h；

K、收集发酵液，6000g离心10min收集菌体，将菌体悬浮于40mL预冷的NTA-0(20mMTris-HCl，500mMNaCl,pH8.0)缓冲液，然后超声波破碎细菌，控制功率为300W，超声4s，暂停4s，超声90次，最后20000g，4℃离心30min，收集上清以及细胞碎片；

L、取少量上清以和细胞进行SDS-PAGE检测，剩余上清过Ni-NTA层析柱，纯化得到分子量为45kDa目的蛋白。

(2)脂蛋白相关磷脂酶A2在酵母表达系统中的表达及分离纯化

A、合成序列表SEQIDNO.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至pPIC9K质粒，得到的连接产物转化到感受态菌E.coliTOP10。转化后将菌液涂布于含50μg/mL卡拉霉素和1mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，将培养皿置于37℃培养箱培养12h。挑选单菌落PCR和双酶切验证正确后，进行测序，得到测序正确的重组子。

B、将上述测序正确的三个重组子接种到含3mLLB液体培养基，200rpm，37℃培养8-16h，无菌条件下吸取200μL菌液保种，剩下的2.8mL菌液接种于300mLLB液体培养基(含50μg/mL卡拉霉素和1mg/mL氨苄青霉素)，200rpm，37℃培养12h，然后大提质粒，质粒纯度99％以上，浓度在10μg/μL左右。

C、用Sac1酶对上述大提质粒进行线性化，37℃水浴过夜后回收线性化质粒，然后用Eppendorf电转化仪分别电转化(电压1500V，时间5ms)线性化质粒于GS115感受态中。涂布150L转化后的菌液于(1mg/mLG418)RDB固体培养基，30℃培养4-5天。

D、小量表达筛选：从RDB平板上挑选20株单菌落，PCR扩增目的基因PLA2G7，琼脂糖凝胶电泳大小正确的条带鉴定为阳性，得到17个阳性菌落，挑取这些菌落接种于1.5mLYPG液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养48h，吸取一定量菌液与甘油均匀混合后保存于-20℃备用。将得到7种阳性株接种于1.5mLYPG液体培养基，30℃，200rpm培养24h，然后加入1％甲醇诱导，培养24h再加入1％甲醇诱导，继续培养24h后离心收集上清。TCA沉淀后，SDS-PAGE分析重组Lp-PLA2表达量，最高产量约3mg/mL。

E、摇瓶发酵：将产量最高的细胞株经前培养24h，按1％接种量接种至1L的YPG液体培养基中，30℃，200rpm培养24h。然后装入500mLBackman离心瓶，8000rpm，3min离心，用YP(含1％甲醇)重悬菌体，倒入原来的三角瓶中，并加入1LYP(含1％甲醇)和200μL消泡剂，30℃，200rpm培养72h，每隔24h加入10mL甲醇诱导；最后离心取上清，浓缩后纯化。

F、将上清过Ni-NTA层析柱，然后用0-500mMNaCl(pH8.0)洗脱，收集A280吸收峰的蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化蛋白浓缩后备用。

(3)脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在昆虫表达系统中的表达及分离纯化

A、杆状病毒转移载体的构建：合成SEQIDNO.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至改造后的pFastbac质粒(modifiedpFastbac，简称modpFastbac)，得到的连接产物modpFastbac-PLA2G7转化到感受态菌E.coliTOP10，得到的转化子经过菌落PCR和双酶切验证正确后，送到测序公司进行测序，得到测序正确的重组子；

B、重组Bacmid的筛选：取2μL重组质粒modpFastbac-PLA2G7转化至150μL感受态菌株DH10Bac，37℃，200rpm震荡培养4h使之发生转座，将培养后的菌液按10、100、1000倍分别稀释，然后各取100μL分别涂布于含“三抗”(卡那霉素，四环素，庆大霉素)的LB固体培养基(含100μg/mLx-gal和20μg/mLIPTG)的平板上。涂布完成的平板于37℃倒置培养24～48h，观察蓝白斑的生长情况。发生转座后的DH10Bac细菌因其LacZ基因被插入失活，而使含有Bacmid的大肠杆菌菌落成为白色。挑取单个白色菌落提取重组BacmidDNA，并用PCR扩增鉴定是否携带PLA2G7基因；

C、杆状病毒粒子制备：扩大培养含PLA2G7的DH10Bac菌株，采用试剂盒(Invitrogen，K2100-02)提取bacmid，将25μL重组BacmidDNA，10μL转染试剂cellfectinII(Invitroge)加入到200μL不完全培养基，室温孵育30min，然后加入到生长有T25细胞的六孔板的孔中，轻轻洗涤细胞壁上的细胞，混匀后28℃继续培养6h；移除质粒、转染剂混合物，加入2mL完全培养基，28℃孵育6天；1500rpm离心5min收集六孔板上清，即P1代病毒粒子。取适当体积的P1杆状病毒粒子原液加入到汇聚度达90％的Sf9细胞中，28℃恒温培养箱中，静置培养3天后，1500rpm，5min离心收集细胞培养上清，即为P2代病毒粒子。得到的P2病毒粒子再次加入到汇聚度达90％的Sf9细胞中，28℃恒温培养箱中，静置培养3天后，1500rpm，5min离心收集细胞培养液中的病毒粒子，获得更高滴度的P3代杆状病毒粒子，4℃冰箱中避光保存备用；

D、蛋白大量表达：取适量的P3代病毒粒子感染sf9细胞，28℃恒温培养箱中，静置培养3天，倒掉皿中的培养基上清，注意动作尽量轻柔，不要大幅甩动培养皿。每皿中加入1ml的裂解液，在振荡仪上轻微振荡10min后(需将培养皿置于冰块上保持低温)，显微镜下观察细胞是否裂解完全，如果发现细胞未裂解完全，继续振荡直至裂解完全。裂解完全后，低温冷冻离心机12000rpm离心5min，收集上清；

E、蛋白纯化：将含蛋白的上清过Ni-NTA层析柱，然后用0-500mMNaCl(pH8.0)洗脱，收集A280吸收值的蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化蛋白浓缩后备用。

(4)脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在哺乳动物表达系统中的表达及分离纯化

A、合成SEQIDNO.1所示的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述)，并连接至哺乳表达质粒pCMV6-entry，得到的连接产物pCMV6-entry-PLA2G7，将连接产物转化至感受态菌E.coliTOP10。转化后将菌液涂布于含50μg/mL卡拉霉素LB固体培养基，将培养皿置于37℃培养箱培养12h。挑选单菌落PCR和双酶切验证正确后，进行测序，得到测序正确的重组子，将这些菌株保存至-20℃备用；

B、将上述测序正确的四个重组子活化后，按1％接种量接种到300mLLB液体培养基(含50μg/mL卡拉霉素)，200rpm，37℃培养12h，然后大提质粒，要求质粒OD260/OD280＝1.8～1.9；

C、在6孔板用DMEM培养基HEK-293T细胞，采用磷酸钙共沉淀法将提取质粒转染至HEK-293T，然后培养48h后，取培养上清，用抗myc标签抗体进行WB检测，筛选出表达产量最高的表达株；

D、扩大培养100皿细胞，用磷酸钙共沉淀法将质粒分别转染至HEK-293T细胞，然后培养96h后收集上清；

E、超滤浓缩上清，经过Ni-NTA层析柱，然后用0-500mMNaCl(pH8.0)洗脱，收集A280吸收峰的蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化蛋白浓缩后备用。

2、脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体制备

2.1脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白免疫小鼠

按每只老鼠50μg脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，将四种重组蛋白表达系统制备得到的重组蛋白等比例混合，并加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，免疫6-8周龄Balb/C雌性小鼠；每两周免疫一次，每次免疫取50μg不同表达系统表达的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白与弗氏不完全佐剂混匀。免疫四次后测效价，若效价达到1:10000以上，按50μg/mouse腹腔冲击免疫，三天后在无菌条件下取出小鼠脾脏，并制成单个脾细胞悬液。

2.2细胞融合

制备脾细胞悬液并用PBS洗涤干净后混入SP2/0细胞，按脾细胞:SP2/0＝10:1混合并离心，1000rpm离心5min后滴干混合细胞，轻敲弹松细胞团块。在37℃水浴中加入1mLPEG1450，加完后在37℃水浴中反应2min，沿管壁缓慢加入20mLRPMI-1640终止液。

融合细胞终止后于800rpm离心5min，并吸干残留液体。HAT培养基重悬融合细胞，转入96孔细胞培养板培养。待融合细胞在HAT中培养7天左右后换成HT培养基。

2.3细胞建株

待孔中融合板细胞长至中等大小约104个细胞以上时开始检测，分别取50μL细胞培养液加入预先包被Lp-PLA2蛋白的微孔中，检测细胞上清抗体效价(即阴性对照<1.0，阳性对照>1.0)从检测为阳性对应的微孔取阳性细胞进行亚克隆。利用HT培养基通过有限稀释法将筛选得到细胞稀释至1个/孔，将细胞铺于96孔细胞培养板。待单克隆细胞长至中等大小，密度约104个细胞以上即可检测效价，然后再次选取其中阳性细胞重复一次亚克隆筛选，待检测到所有微孔中细胞上清都是阳性后，再进行一次同样的单克隆，如果有限稀释法后再次得到全阳性结果，能确定此时筛选到阳性细胞株，所得的阳性细胞株即为杂交瘤细胞。

2.4腹水制备

按0.5mL石蜡/只小鼠进行腹腔注射液体石蜡，7～10天后于腹腔内注射无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠约106个细胞。约7～10天后可用无菌注射器采集腹水。2000rpm离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清分装，-80℃保存。

2.5腹水纯化

腹水经50％SAS沉淀，沉淀物用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重新溶解，并经0.22μm微孔滤膜滤过。取待纯化的样品上样ProteinG-琼脂糖亲和层析柱(HiTrapProteinG，PharmaciaBiotech)，流速为0.5mL/min，使得抗体与proteinG结合，最后用洗脱液进行洗脱，得到抗体SDS-PAGE鉴定其纯度。

2.6抗体验证

所有的单克隆抗体分别用作捕获抗体和标记抗体，然后组合成不同抗体对应用于双抗夹心法的免疫检测。不同抗体对分别对各种浓度的Lp-PLA2进行定量检测，最后选择出最好的配对方式如下(捕获抗体-标记抗体)：

A组合：CSB-DA113BmN①-CSB-DA113BmN③；

B组合：CSB-DA113BmN②-CSB-DA113BmN③；

C组合：CSB-DA113BmN③-CSB-DA113BmN①；

D组合：CSB-DA113BmN③-CSB-DA113BmN②。

三支单抗CSB-DA113BmN①、CSB-DA113BmN②和CSB-DA113BmN③所对应的细胞株HT-LP1、HT-LP2和HT-LP3。从细胞株HT-LP1、HT-LP2和HT-LP3提取RNA，然后经RT-PCR反转录得到cDNA，利用小鼠IgG抗体轻链和重链可变区的通用引物进行DNA测序，确定不同抗体的轻链可变区与重链可变区。

CSB-DA113BmN①轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所述。

CSB-DA113BmN①重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所述。

CSB-DA113BmN②轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所述。

CSB-DA113BmN②重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所述。

CSB-DA113BmN③轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所述。

CSB-DA113BmN③重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所述。

本发明实施例制备的抗体临床应用效果评价如下：

为验证本发明实施例制备的抗体对适用于临床检测，利用4种抗体对组合(A组合、B组合、C组合和D组合)对18例健康志愿者血样和18例动脉粥样硬化或小脑梗塞患者血样进行检测，其检测结果如附图1-4所示，此结果表明本发明实施例所产生的抗体能够区分正常组和病理组样本，能够满足临床检测需求。

检测的实验流程如下：

A、用0.05MPH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至浓度为1μg/mL。后在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL抗体溶液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

B、加稀释5倍的待检样品50μL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤；

C、于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，37℃孵育0.5小时，洗涤；

D、加入化学发光底物液50μL，避光放置于微孔板化学发光仪上静置5分钟，依序测量各孔的相对发光单位(RLU)。

采用本发明实施例的方法制备的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，具有稳定、高效等诸多优良特点，适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料，尤其是适用于化学发光等高端诊断试剂盒开发的抗体原料。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCELISTING

<110>武汉华美生物工程有限公司

<120>脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途

<130>2015

<160>15

<170>PatentInversion3.3

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100

Claims (14)

1.脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，其特征在于：包括CSB-DA113BmN①、CSB-DA113BmN②和CSB-DA113BmN③；

CSB-DA113BmN①轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所述；

CSB-DA113BmN①重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所述；

CSB-DA113BmN②轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所述；

CSB-DA113BmN②重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所述；

CSB-DA113BmN③轻链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所述；

CSB-DA113BmN③重链可变区部分核苷酸序列如SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所述。

2.权利要求1所述脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：其特征在于：

步骤一、采用多种表达系统表达重组脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白，重组脂蛋白相关磷脂酶A2序列如序列表SEQIDNO.1所述；

步骤二、分离纯化步骤一中各表达系统表达的重组脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白；

步骤三、将步骤二之后的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白进行混合后免疫宿主动物；

步骤四、取所述免疫宿主动物的脾脏细胞制备融合细胞；

步骤五、采用所述融合细胞制备脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤一中，各表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。

4.根据权利要求3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在各表达系统中合成序列表SEQIDNO.1的基因序列以及亚克隆引物。

5.根据权利要求4所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述亚克隆引物的序列如序列表SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述。

6.根据权利要求2或3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述宿主动物为Balb/C雌性小鼠，所述融合用细胞系为SP2/0。

7.根据权利要求2或3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤三脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白混合免疫宿主动物中，将多种重组蛋白表达系统制备得到的重组蛋白等比例混合。

8.根据权利要求7所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤三脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白混合免疫小鼠中，按每只老鼠50μg脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，将多种重组蛋白表达系统制备得到的重组蛋白等比例混合，并加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，免疫6-8周龄Balb/C雌性小鼠；每两周免疫一次所述小鼠，每次免疫取50μg不同表达系统表达的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白与弗氏不完全佐剂混匀；免疫四次后测效价，若效价达到1:10000以上，按50μg/mouse腹腔冲击免疫，三天后在无菌条件下取出小鼠脾脏，并制成单个脾细胞悬液。

9.根据权利要求6所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤四制备融合细胞中，包括细胞融合和细胞建株，得到杂交瘤细胞。

10.根据权利要求6所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤五融合细胞制备抗体时，包括腹水制备和腹水纯化步骤，腹水纯化后得到不同的单克隆抗体。

11.权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体组合成的抗体对，其特征在于：包括如下：

A组合：CSB-DA113BmN①-CSB-DA113BmN③；

B组合：CSB-DA113BmN②-CSB-DA113BmN③；

C组合：CSB-DA113BmN③-CSB-DA113BmN①；

D组合：CSB-DA113BmN③-CSB-DA113BmN②。

12.权利要求11所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体对的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将所述单克隆抗体CSB-DA113BmN①、CSB-DA113BmN②和CSB-DA113BmN③，分别用作捕获抗体和标记抗体，然后组合成不同抗体对应用于双抗夹心法的免疫检测；不同抗体对分别对各种浓度的Lp-PLA2蛋白进行定量检测，以选择出最好的“捕获抗体-标记抗体”配对方式；最后对优选的单克隆抗体所对应的细胞株提取RNA，然后经RT-PCR反转录得到cDNA，利用小鼠IgG抗体轻链和重链可变区的通用引物进行DNA测序，确定抗体的可变区序列。

13.权利要求11所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体对的用途，其特征在于：所述脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体对在双抗夹心法的免疫检测中的应用。

14.权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的用途，其特征在于：所述单克隆抗体在制备检测脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂、药剂或试剂盒中的应用。