CN102477097A

CN102477097A - 一种氯霉素单克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN102477097A
Application number: CN2010105617264A
Authority: CN
Inventors: 应国清; 汪竹环; 易喻; 陈建澍; 梅建凤; 王鸿
Original assignee: Hangzhou Bio Link Biological Technology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Hangzhou Bio Link Biological Technology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2012-05-30

Abstract

本发明公开了一种氯霉素（CAP）单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)用重氮化方法制备CAP-BSA的抗原；(2)用CAP-BSA抗原淋巴免疫小鼠，第一次免疫与弗氏完全佐剂充分乳化，第二次和第三次免疫与弗氏不完全佐剂充分乳化，每次间隔7天，融合前三天腹腔直接注射抗原加强免疫；(3)用酶联免疫吸附法测小鼠血清效价；(4)选择血清效价最高的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；(5)选择性培养基培养筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；(6)将扩大培养后的细胞株注射入小鼠腹腔以生产大量腹水；(7)用层析柱纯化腹水中的抗氯霉素单克隆抗体。制备得到的抗CAP-BSA单克隆抗体灵敏性高、特异性强、实用性好。

Description

一种氯霉素单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明属于单克隆抗体制备技术领域，特别涉及一种氯霉素单克隆抗体的制备方法。

背景技术

氯霉素（CAP）是一种广谱性抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有很好的抑制作用。由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，因此作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业和人工水产养殖业生产。但是，氯霉素具有毒性，易引起人体血中毒，长期应用可导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。婴儿长期食用氯霉素污染的乳汁，可能会引起“灰婴综合征”。此外长期微量摄入氯霉素，不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，而且会引起机体正常菌群失调，使人们易感染各种疾病。如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害，因此，抗氯霉素单克隆抗体的制备对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗氯霉素单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1) 用重氮化方法制备CAP-BSA的抗原；

(2)免疫：用CAP-BSA抗原淋巴免疫小鼠，第一次免疫与弗氏完全佐剂充分乳化，第二次和第三次免疫与弗氏不完全佐剂充分乳化，每次间隔7天，融合前三天腹腔直接注射抗原加强免疫；

(3)筛选：用酶联免疫吸附法测小鼠血清效价；

(4)细胞融合：选择血清效价最高的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；

(5)选择性培养基培养筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；

(6)腹水制备：将扩大培养后的细胞株注射入小鼠腹腔以生产大量腹水；

(7)腹水纯化：用层析柱纯化腹水中的抗氯霉素单克隆抗体。

进一步地，步骤（2）所述的小鼠为6周龄的BALB/c小鼠，每次抗原免疫量为100μg/只，抗原与弗氏完全佐剂的混合比例为1：1，抗原与弗氏不完全佐剂的混合比例为1：1。

步骤（4）中，洗涤调整小鼠脾B淋巴细胞浓度为（1-5）×10⁷/mL，将淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按 10：1 混合后离心弃上清，缓慢加入分子质量1500D的50%PEG进行融合，将融合后的细胞加入含有HAT选择性培养基培养。

步骤（5）中，用HAT选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接竞争酶联免疫吸附法筛选阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

步骤（6）中，用弗氏不完全佐剂0.5 mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶/只，7日后每日观察小鼠的腹部情况及精神状况，待腹部凸起，颜色变黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。

步骤（7）中，所述的层析柱为HiTrap r-Protein A FF预装层析柱，取适量腹水，10,000 r/min离心15 min，取上清，经过0.22 μm微孔滤膜过滤后，用pH7.0，20mmol/L磷酸缓冲液+ 3.0 mol/L NaCl上样，pH3.0，0.1 mol/L 甘氨酸—盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，调pH值后脱盐冻存。

采用本发明中可分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞的扩培技术和制备腹水抗体技术，可大量生产抗CAP单克隆抗体，并且随着生产规模的扩大，可以大大降低生产成本。由于细胞的背景、细胞培养液的成分以及腹水的纯化都是明确可控的，用这种方法所生产出的单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性。并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的CAP免疫测定方法的进一步建立和应用提供了实验依据。

附图说明

图1是单克隆抗体层析结果图。

图2是单克隆抗体电泳鉴定结果图。

具体实施方式

1、材料

1.1 动物、细胞株

BALB/c 小鼠，浙江省动物实验中心；F1 小鼠，浙江中医药大学动物实验中心；SP2/0 骨髓瘤细胞，南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 主要仪器

层流超净台SCV-4A1，Streamline Laboratory Products；三目倒置相差显微镜ELWD0.3T1-SNCP，Nikon；二氧化碳恒温培养箱3111，Thermo Electron Corporation；HiTrap r-Protein A FF层析柱（5mL）、AKTA purifier，GE Healthcare；无菌培养板、培养瓶、培养皿、离心管，Corning 公司。

1.3 主要试剂

免疫原CAP-BSA和检测抗原CAP-OVA，本实验室合成；氯霉素，上海晶纯试剂有限公司； HAT培养液、HT培养液、PEG（1500D），Sigma 公司；胎牛血清，民海生物工程有限公司；RPML 1640 培养液，吉诺生物医药技术有限公司；羊抗小鼠 IgG-HRP，博士德生物工程有限公司

2、方法

2.1 免疫：取6周龄的BALB/c小鼠，用重氮化方法合成的氯霉素-BSA（CAP-BSA）抗原淋巴免疫，每次免疫量为100μg/只，第一次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，第二次、第三次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化，每次间隔7天，融合前三天腹腔直接注射100μg抗原加强免疫。

2.2 细胞融合：将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾B淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度为（1-5）×10⁷/mL备用。将免疫脾B淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按 10：1 混合后离心弃上清，缓慢加入分子质量1500D的50%PEG 1mL，间隔1 min后，缓慢滴入无血清培养液，终止融合剂的作用，经洗涤去除融合剂后加入所含有HAT的细胞培养液，分种于96孔培养板孔内，每孔200μL。

2.3 杂交瘤细胞的筛选：在接种96孔培养板，经过1周的培养后，骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出，然后进行单克隆化。克隆化方法用有限稀释法，一般克隆化3—4次，直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止。

2.4 腹水抗体的制备：用弗氏不完全佐剂0.5mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶/只，待7日后每日观察小鼠的腹部情况及精神状况，待腹部凸起，颜色变黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。

2.5 间接竞争ELISA测抗体效价及阳性孔：将氯霉素-卵清蛋白（CAP-OVA）抗原1μg/孔包被酶标板，设置空白对照孔，37℃包被过夜；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入200μL待测样,以PBS稀释,37℃孵育1小时；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入100μL用1%BSA溶液按1：3000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，37℃孵育1小时；PBS-T溶液浸洗三次，双蒸水浸洗三次，每孔加入100μL邻苯二胺底物溶液，置于暗处反应5分钟，阳性孔变为棕黄色，每孔加入100μL 2M H₂SO₄终止反应。筛选出的阳性孔再用CAP-OVA包被的酶标板进行竞争抑制性ELISA法，先将细胞培养上清与2×10^-3M的CAP溶液等量混合，37℃感作1小时，再加入已包被的酶标板中。同时用0.01M，Ph7.4的PBS替代CAP溶液作对照，其余步骤同上。若经抑制后的OD值降至对照孔50%以下，则判为阳性孔。

2.6 抗体的纯化：选择5mL HiTrap r-Protein A FF预装层析柱纯化抗体。取适量腹水，10,000 r/min离心15 min，取上清，经过0.22μm微孔滤膜过滤后，用20mmol/L磷酸缓冲液上样，用0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱缓冲液的pH值，控制样品流速。

2.7 SDS-PAGE法鉴定单抗纯度：分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%，还原状态下处理样品，电泳后用考马斯亮蓝R250染色，乙醇乙酸脱色，然后经凝胶成像系统扫描分析其纯度。

3、结果

3.1 CAP杂交瘤细胞株的建立

3.1.1 小鼠血清抗体效价检测：CAP-BSA抗原免疫的BALB/c小鼠共四只，眼眶取血检测效价。四只小鼠的血清抗体效价都达到了10^-6以上，免疫效果较好，可进行细胞融合。

3.1.2 杂交瘤细胞株的建立：细胞融合后铺三块96孔板，经HAT培养液筛选后，测出9个阳性孔，取上清效价最高（10^-4）的两孔细胞株（1D₁，3G₁₂）单克隆化4次，第2，3，4次单克隆时，2株细胞的阳性率均为100%。杂交瘤细胞株经14周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存复苏后仍能稳定分泌抗CAP单克隆抗体。

3.2 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定

3.2.1 杂交瘤细胞上清抗体效价的检测：细胞上清抗体效价达到了10^-4以上。

3.2.2 腹水抗体效价的检测：2株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔产生的抗体效价均在10^-7以上。

3.3 腹水抗体的纯化

在上样缓冲液pH6.5、7.0、7.5条件下，目的单抗基本保留在层析介质上。在pH7.0的上样条件下，洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少，纯度略高。

上样缓冲液的离子强度大于4mol/L时会产生盐析效应，影响抗体的稳定性。在（0～3.0）mol/L NaCl的离子强度下，目的单抗均能较好地与层析介质结合，在3.0mol/L NaCl的离子强度下，洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少，纯度较高。

采用pH值为3.0的0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液进行洗脱时，洗脱峰为单一峰，而且峰形较好，洗脱较完全，回收率高。

样品在各个流速下进行上样和洗脱，都可以得到较高的纯度和回收率，流速对其影响较小。因此为了提高效率，可以采用5.0ml/min的流速进行上样和洗脱。

综上所述，本发明确定pH7.0，20mmol/L 磷酸缓冲液 + 3.0mol/L NaCl为最佳上样条件，pH3.0，0.1 mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液为最佳洗脱条件。纯化后抗体纯度达95%以上，回收率达80%。层析结果如图1所示(1.穿透峰；2.抗体洗脱峰)。电泳鉴定结果如图2所示（1.标准蛋白marker；2.腹水；3.穿透峰；4.洗脱峰）。

Claims

1.一种抗氯霉素单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1) 用重氮化方法制备CAP-BSA的抗原；

(3)筛选：用酶联免疫吸附法测小鼠血清效价；

(7)腹水纯化：用层析柱纯化腹水中的抗氯霉素单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的小鼠为6周龄的BALB/c小鼠，每次抗原免疫量为100μg/只，抗原与弗氏完全佐剂的混合比例为1：1，抗原与弗氏不完全佐剂的混合比例为1：1。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中，洗涤调整小鼠脾B淋巴细胞浓度为（1-5）×10⁷/mL，将淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按 10：1 混合后离心弃上清，缓慢加入分子质量1500D的50%PEG进行融合，将融合后的细胞加入含有HAT选择性培养基培养。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）中，用HAT选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接竞争酶联免疫吸附法筛选阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（6）中，用弗氏不完全佐剂0.5 mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶/只，7日后每日观察小鼠的腹部情况及精神状况，待腹部凸起，颜色变黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（7）中，所述的层析柱为HiTrap r-Protein A FF预装层析柱，取适量腹水，10,000 r/min离心15 min，取上清，经过0.22 μm微孔滤膜过滤后，用pH7.0，20mmol/L磷酸缓冲液+ 3.0 mol/L NaCl上样，pH3.0，0.1 mol/L 甘氨酸—盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，调pH值后脱盐冻存。