CN108467434A - 哌拉西林单克隆抗体的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法及其应用，利用杂交瘤细胞株制备，制备方法包括哌拉西林单克隆抗体的制备、抗体纯化、抗体纯度鉴定、抗体效价鉴定。所制备的哌拉西林单克隆抗体用于哌拉西林药物抗体检测，以被检测对象血液作为检测样品，若血浆中存在哌拉西林抗体，则该抗体通过抗IgG+C3d桥连与哌拉西林处理细胞上的哌拉西林药物抗原结合产生凝集，在离心力的作用下不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层或分散在凝胶中，呈现阳性反应；若血浆中不存在抗体或细胞表面不含有药物抗原则不产生凝集，在离心力作用下可通过凝胶间隙而沉积在微柱凝胶孔的底部，呈现阴性反应。

Description

哌拉西林单克隆抗体的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体的是涉及利用杂交瘤技术制备哌拉西林单克隆抗体，并将研制的单克隆抗体应用于临床。
背景技术
在临床治疗过程中使用药物，特别是使用抗生素类药物时，机体除了会产生药物耐受之外，还有可能产生针对此种药物的抗药物抗体。当机体产生抗药物抗体之后，药物、抗药物抗体及红细胞会形成一种免疫复合物，导致机体对红细胞的破坏清除，引起免疫溶血性贫血、药物使用无效以致危及患者生命安全。虽然产生抗药物抗体的几率很低，但至今为止己报道有超过100种药物可以引发抗药物抗体的产生。随着科技的进步及医药产业的发展，越来越多的药物会投入使用。因此，建立一种有效的检测抗药物抗体的方法，对药物引发的免疫溶血性贫血的检测，病因的确定，指导用药等方面都有着重要的意义。
哌拉西林是为数不多的对绿脓杆菌有强抗菌作用的抗生素，因此被广泛应用于临床。然而，患者在临床治疗过程中使用哌拉西林时，一些患者可能产生针对此种药物的抗体。患者一旦产生抗哌拉西林的抗体，该抗体与哌拉西林药物形成的抗原抗体复合体会中和抑制哌拉西林药物的药效，使得哌拉西林药物的疗效得不到充分保证。同时，哌拉西林药物与其对应的抗体形成的免疫复合体与人红细胞结合会引发红细胞溶血，轻则影响治疗效果，延误病情，重则危及患者生命安全。因此，建立有效检测体内哌拉西林药物抗体的方法对于合理使用哌拉西林药物具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种哌拉西林单克隆抗体，由杂交瘤细胞株制备而成。并具体提供利用该杂交瘤细胞生产的哌拉西林单克隆抗体，和该上述杂交瘤细胞生产的哌拉西林单克隆抗体的应用方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案为：一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法，该抗体是利用杂交瘤细胞株制备，具体步骤如下：
1.1饲养细胞的制备：
取6-10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于酒精内，消毒3-5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的无血清1640 培养液，用轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入离心管，离心；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃的CO2培养箱培养。
1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选
a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将 B细胞悬液离心，弃上清；重复以上步骤，再洗一次；
b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，离心，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；
c.按照1/10—1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640 培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；
d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；
e.将含融合细胞的离心管置于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s以上；
f.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于 37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT培养基，分至4板已铺好饲养细胞的 96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；
g.5天后每孔补充50μL含1×HT培养基的完全培养液；
h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；
i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；
j.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；
k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；
l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行交叉筛选；
m.制备饲养细胞层100μL/孔，2×104个/孔，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT培养基，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存于液氮罐中，记录冻存位置。
上述抗体的制备方法还包括哌拉西林单克隆抗体的纯化，步骤如下
(1)柱子的预处理：
a.将准备好的Protein A/Protein G填料取出转入50ml离心管中，加入适量乙醇，颠倒混匀，将填料混匀后转入空柱；
b.将空柱灌满后，旋紧接头，将填料中的20％从接头端手动排出，至出口处保留1-2ml乙醇为止；
c.将准备好的柱子接入AKTA系统，等待系统平衡及排除空气；
(2)实验试剂配制：所有配制试剂均需0.45μm滤器过滤除菌
a.VBS缓冲液：pH7.2巴比妥缓冲液
准确称量巴比妥0.737g，氯化钠8.766g，七水合硫酸镁0.197g，无水氯化钙0.033g，溶于1L蒸馏水中，用1M NaOH调节pH至7.2，于4℃保存；
b.洗涤缓冲液—A液：10mM PBS，pH7.4；
准确称量NaCl 8g，十二水合磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钾0.135g，氯化钾0.201g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl或1M NaOH调节pH至7.4±0.2；
c.洗脱缓冲液—B液：0.1M甘氨酸盐酸，pH 2.7；
准确称量甘氨酸7.5g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl调节pH至2.7；
d.中和缓冲液—C液：1M Tris-HCl，pH9.0；
准确称量Tris 121.04g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl调节pH至9.0；
e.20％乙醇
准确量取无水乙醇200mL，与800mL蒸馏水混匀；
(3)抗体纯化标准操作流程：
a.取新鲜采集的腹水或冻存的腹水，倒入圆底高速离心管中，加入等体积的VBS稀释液，混匀；
b.按照每10mL稀释腹水加入150mg二氧化硅粉末，混匀后，室温放置摇床200rpm孵育20-30min；
c.离心，上清用0.45μm以下滤器过滤，补加至少1倍体积的10mM PBS，待用；
d.打开Primeview软件，选择“Manual control”，设置“Flow rate”为“6mL/min”；“Prime limit”为“0.4KPa”；“Buffer Valve Pos”为“Pos 1”，设置完成后点击“StartRun”，开始清洗；
e.清洗：用B液清洗层析柱，清洗5-10倍体积；
f.平衡：用A液平衡层析柱，平衡5-10倍体积；
g.上样步骤c处理后的腹水，上样完毕后，继续用A液平衡至紫外基线平稳，并收集穿透液；
h.洗脱：用B液洗脱层析柱，当紫外起峰时收集洗脱峰于预加入3-4mL C液的收集管，收集结束后调pH至7-8；
i.将收集的穿透液混合在一起，重复步骤e-g；
j.将洗脱液装入预处理的透析袋中，对二十倍以上体积的A液4℃透析12小时以上，间隔4小时更换透析液三次。
上述抗体的制备方法还包括抗体纯度鉴定，将样品取出，加入0.1％proclin-300，用 0.22μm滤器过滤分装，采用BCA法进行抗体浓度的测定，具体操作见下：
a.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B配制BCA工作液，充分混匀；
b.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml，蛋白样品和标准品用相同的溶液稀释；
c.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl；
d.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl；
e.各孔加入200μl BCA工作液，静置进行显色反应；
f.测定A540-595nm之间的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
本申请中，蛋白样品和标准品用的稀释溶液为0.9％NaCl或PBS稀释标准品。
抗体的制备方法中还包括抗体效价鉴定，将样品取出，采用间接ELISA进行抗体效价的测定，操作如下
a.设计间接ELISA实验：
b.在进行样品稀释之前需将所有样品浓度稀释至1mg/ml后再进行下一步稀释，并按照实验室的ELISA实验体系进行实验操作；
c.结果判定：阴性对照A450OD值小于0.1为阴性结果有效；效价判定：样品A450OD/阴性对照A450OD大于2.1为有效效价，取比值大于并最接近2.1处一抗稀释比例为抗体效价。
本申请哌拉西林单克隆抗体的应用之一是用于哌拉西林药物抗体检测，将哌拉西林单克隆抗体作为阳性对照试剂。具体的是以被检测对象血液作为检测样品，若血浆中存在哌拉西林抗体，则该抗体通过抗IgG+C3d桥连与哌拉西林处理细胞上的哌拉西林药物抗原结合产生凝集，在离心力的作用下不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层或分散在凝胶中，呈现阳性反应；若血浆中不存在抗体或细胞表面不含有药物抗原则不产生凝集，在离心力作用下可通过凝胶间隙而沉积在微柱凝胶孔的底部，呈现阴性反应。
本申请哌拉西林单克隆抗体应用于哌拉西林诱导型溶血检测试剂盒的制备，该试剂盒包括
哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I，
哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡II，
哌拉西林处理红细胞，
非哌拉西林处理红细胞，
哌拉西林抗体阳性对照，
哌拉西林抗体阴性对照。
上述试剂盒的检验步骤如下
(一)哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I
(1)患者红细胞悬液的配制：患者新鲜血液样本压积红细胞用0.9％氯化钠溶液洗涤一次得到压积红细胞，用0.9％氯化钠溶液配制成0.5～1％浓度的红细胞悬液；
(2)取哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I，每份待检患者样本标记3孔，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；
(3)向标记的每孔中加入患者样本0.5～1.0％的红细胞悬液；
(4)混匀，置微柱凝胶卡配套的离心机离心，30min内观察结果并记录；
(二)哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ
(1)取哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ，每份待检患者样本标记4孔，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；
(2)哌拉西林处理红细胞悬液的配制：取试剂盒中哌拉西林处理红细胞用0.9％氯化钠溶液洗涤三次后得到压积红细胞，用0.9％氯化钠溶液配制成2～2.5％浓度的红细胞悬液；
(3)向第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔的每孔中加入哌拉西林处理的红细胞悬液各25μl；
(4)向第Ⅳ孔中加入非哌拉西林处理的红细胞悬液25μl；
(5)向第Ⅰ和第Ⅳ孔中分别加入待检样本0.9％氯化钠溶液1:19稀释的血浆 50μl，第Ⅱ孔中加入阳性对照液50μl，第Ⅲ孔中加入阴性对照液50μl；
(6)混匀，置试剂卡孵育器37±1℃孵育1h；
(7)置LB-3000医用离心机离心，30min内观察结果并记录；
(三)反应结果判定
阳性结果：红细胞位于胶表面或者悬浮在胶中均为阳性反应(1+～4+)；
阴性结果：红细胞全部沉积在微孔底部为阴性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本申请率先制备哌拉西林单克隆抗体，并且可直接应用于临床。同时，为开发哌拉西林诱导型溶血检测试剂盒(微柱凝胶法)提供了重要原料。本发明哌拉西林单克隆抗体利用杂交瘤技术，开发过程安全可靠、且性价比较高，具有较大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例中抗体效价鉴定步骤设计的间接ELISA实验参数。
图2为本发明应用哌拉西林诱导型溶血检测试剂盒检测结果判定的参照图。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的具体过程，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。
实施例l：哌拉西林单克隆抗体的制备
1.1饲养细胞的制备：
取6-10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于75％酒精内，消毒3-5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的10mL 无血清1640培养液，用镊子底部轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入10mL离心管， 1200r/min离心10min；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至 2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃、CO2培养箱培养；
1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选
a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有一定无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清；重复以上步骤，再洗一次；
b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；
c.按照1/10或1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640 培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；
d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；
e.将含融合细胞的离心管置于于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s；
f.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于 37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT(终浓度)，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；
g.5天后每孔补充50μL含1×HT的完全培养液；
h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；
i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；
j.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；
k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；
l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清液进行交叉筛选；
m.制备饲养细胞层100μL/孔(2×104个/孔)，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满 1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好并冻存于液氮罐中，记录冻存位置。
以上的1×HAT、1×HT均是培养基。
实施例22：抗体纯化
2.1柱子的预处理：
a.将准备好的Protein A/Protein G填料取出转入50ml离心管中，加入适量20％(体积比)乙醇，颠倒混匀，将填料混匀后转入空柱；
b.将空柱灌满后，旋紧接头，将填料中的20％从接头端手动排出，至出口处保留1-2ml 20％乙醇为止。
c.将准备好的柱子接入AKTA系统，等待系统平衡及排除空气。
2.2实验试剂配制(所有配制试剂均需0.45μm滤器过滤除菌)：
a.VBS缓冲液：pH7.2巴比妥缓冲液
准确称量巴比妥0.737g，氯化钠8.766g，七水合硫酸镁0.197g，无水氯化钙0.033g，溶于1L蒸馏水中，用1M NaOH调节pH至7.2，于4℃保存。
b.洗涤缓冲液(A液)：10mM PBS，pH7.4。
准确称量NaCl 8g，十二水合磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钾0.135g，氯化钾0.201g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl或1M NaOH调节pH至7.4±0.2。
c.洗脱缓冲液(B液)：0.1M甘氨酸盐酸，pH 2.7。
准确称量甘氨酸7.5g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl调节pH至2.7。
d.中和缓冲液(C液)：1M Tris-HCl，pH9.0。
准确称量Tris 121.04g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl调节pH至9.0。
e.20％乙醇
准确量取无水乙醇200mL，与800mL蒸馏水混匀，备用。
2.3抗体纯化标准操作流程：
a.取新鲜采集的腹水(或冻存的腹水)，倒入圆底高速离心管中，加入等体积的VBS稀释液，混匀；
b.按照每10mL稀释腹水加入150mg二氧化硅粉末，混匀后，室温放置摇床200rpm孵育20-30min；
c.10000rpm/min离心30min，上清用0.45μm以下滤器过滤，补加至少1倍体积的10mM PBS，待用；
d.打开桌面Primeview软件，选择“Manual control”，设置“Flow rate”为“6mL/min”；“Prime limit”为“0.4KPa”；“Buffer Valve Pos”为“Pos 1”，设置完成后点击“StartRun”，开始清洗；
e.清洗：用B液清洗层析柱，清洗5-10倍体积；
f.平衡：用A液平衡层析柱，平衡5-10倍体积；
g.上样步骤c处理后的腹水，上样完毕后，继续用A液平衡至紫外基线平稳，并收集穿透液；
h.洗脱：用B液洗脱层析柱，当紫外起峰时收集洗脱峰于预加入3-4mL C液的收集管，收集结束后调pH至7-8(每管收集抗体约30-40mL)；
i.将收集的穿透液混合在一起，重复步骤e-g；
j.将洗脱液装入预处理的透析袋中，对二十倍以上体积的A液4℃透析12小时以上，间隔4小时更换透析液三次。
实施例3：抗体纯度鉴定
1.实验步骤
将样品取出，加入0.1％proclin-300，用0.22μm滤器过滤分装，采用BCA法进行抗体浓度的测定，具体操作见下：
a.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
b.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％NaCl或 PBS稀释标准品。
c.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。
d.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl。
e.各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。
注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
f.测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
2.实验结果
实施例4：抗体效价鉴定
1.实验步骤
将样品取出，采用间接ELISA进行抗体效价的测定。
a.设计间接ELISA实验：参见图1设计实验；
b.在进行样品稀释之前需将所有样品浓度稀释至1mg/ml后在进行下一步稀释，并按照本实验室的ELISA实验体系进行实验操作；
c.结果判定：阴性对照A450OD值小于0.1为阴性结果有效；效价判定：样品A450OD/阴性对照A450OD大于2.1为有效效价，取比值最接近2.1(需大于2.1)处一抗稀释比例为抗体效价。
2.实验结果
实施例5：哌拉西林单克隆抗体的应用
【产品名称】
通用名称：哌拉西林诱导型溶血检测试剂盒(微柱凝胶法)
【包装规格】
24人份/盒。
【预期用途】
用于哌拉西林药物抗体检测，指导临床合理选择使用抗生素，不用于血源筛查。
【检验原理】
若患者血浆中存在哌拉西林抗体，则该抗体通过抗IgG+C3d桥连与哌拉西林处理细胞上的哌拉西林药物抗原结合产生凝集，在离心力的作用下不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层或分散在凝胶中，呈现阳性反应；若血浆中不存在抗体或细胞表面不含有药物抗原则不产生凝集，在离心力作用下可通过凝胶间隙而沉积在微柱凝胶孔的底部，呈现阴性反应。
【主要组成成分】
哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I(6孔/卡×12卡/盒)
哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡II(8孔/卡×12卡/盒)
哌拉西林处理红细胞(2.5ml/瓶×1瓶/盒)
非哌拉西林处理红细胞(1ml/瓶×1瓶/盒)
哌拉西林抗体阳性对照(1.5ml/瓶×1瓶/盒)
哌拉西林抗体阴性对照(1.5ml/瓶×1瓶/盒)
【储存条件及有效期】
2～8℃保存。有效期自检定合格之日起3个月。
【样本要求】
建议使用患者EDTA抗凝的新鲜血液样本，发生严重溶血、黄疸及高脂的样本不能用于检测。
【检验方法】
1.哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I
(5)患者红细胞悬液的配制：患者新鲜血液样本压积红细胞用0.9％氯化钠溶液洗涤一次得到压积红细胞，用0.9％氯化钠溶液配制成0.5～1％浓度的红细胞悬液(取压积红细胞8μl加入到1ml0.9％氯化钠溶液中)。
(6)取哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I，每份待检患者样本标记3孔(分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。
(7)向标记的每孔中加入患者样本0.5～1.0％的红细胞悬液50μl。
(8)混匀，置微柱凝胶卡配套专用离心机离心5min(900rpm×2min、 1500rpm×3min)，30min内观察结果并记录。
2.哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ
(8)取哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ，每份待检患者样本标记4孔(分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。
(9)哌拉西林处理红细胞悬液的配制：取试剂盒中哌拉西林处理红细胞用0.9％氯化钠溶液洗涤三次后得到压积红细胞，用0.9％氯化钠溶液配制成2～2.5％浓度的红细胞悬液。
(10)向第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔的每孔中加入哌拉西林处理的红细胞悬液各25μl。
(11)向第Ⅳ孔中加入非哌拉西林处理的红细胞悬液25μl。
(12)向第Ⅰ和第Ⅳ孔中分别加入待检样本0.9％氯化钠溶液1:19稀释的血浆 50μl，第Ⅱ孔中加入阳性对照液50μl，第Ⅲ孔中加入阴性对照液50μl。
(13)混匀，置试剂卡孵育器37±1℃孵育1h。
(14)置LB-3000医用离心机离心5min(900rpm×2min,1500rpm×3min)，30min内观察结果并记录。
【检验结果的解释】
1.哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I—直接抗人球蛋白试验(DAT)结果判定：
注：“+”表示阳性，红细胞在凝胶表面或分散胶中；“0”表示阴性，红细胞沉于微柱凝胶孔底部。
2.哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ检测结果判定
3、哌拉西林诱导型溶血检测试剂盒(微柱凝胶法)检测结果判定
4、反应结果判定：
阳性结果：红细胞位于胶表面或者悬浮在胶中均为阳性反应(1+～4+)。
阴性结果：红细胞全部沉积在微孔底部为阴性。
【检验方法的局限性】
该检验方法只适用于定性检测哌拉西林药物抗体，不适用于定量检测。
【注意事项】
1.本试剂盒仅限用于哌拉西林抗体检测，不能用于其它检查。
2.凝胶卡从冰箱取出后需回温30min再使用，使用前先使用LB-3000医用离心机离心。
3.若凝胶卡封口膜破损，凝胶干涸或有气泡，不可使用。
4.撕开凝胶卡封口膜时，不能用力过度，以免造成凝胶微孔间的交叉污染。
5.哌拉西林处理红细胞使用前须用0.9％氯化钠溶液洗涤，否则保存液中防腐剂会产生干扰。
6.患者红细胞悬液的浓度为0.5～1.0％，哌拉西林处理红细胞悬液浓度为2～2.5％，浓度过高或过低会影响检测结果。
7.血浆标本须充分离心去除纤维蛋白及其他任何不溶物，否则会阻止红细胞在微柱凝胶中的沉降引起假阳性。
8.被检患者血浆样本必须用0.9％氯化钠溶液作1：19稀释后使用。
9.人源血液标本存在潜在的传染性，本产品使用后按医疗生物垃圾处理。
10.本产品仅用于体外诊断。

Claims (10)

1.一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：利用杂交瘤细胞株制备，具体步骤如下：
1.1饲养细胞的制备：
取6-10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于酒精内，消毒3-5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的无血清1640培养液，用轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入离心管，离心；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃的CO2培养箱培养；
1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选
a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液离心，弃上清；重复以上步骤，再洗一次；
b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，离心，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；
c.按照1/10—1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；
d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；
e.将含融合细胞的离心管置于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s以上；
f.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT培养基，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；
g.5天后每孔补充50μL含1×HT培养基的完全培养液；
h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；
i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；
j.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；
k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；
l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行交叉筛选；
m.制备饲养细胞层100μL/孔，2×104个/孔，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT培养基，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存于液氮罐中，记录冻存位置。
2.根据权利要求1所述的哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括哌拉西林单克隆抗体的纯化，步骤如下
(1)柱子的预处理：
a.将准备好的Protein A/Protein G填料取出转入50ml离心管中，加入适量乙醇，颠倒混匀，将填料混匀后转入空柱；
b.将空柱灌满后，旋紧接头，将填料中的20％从接头端手动排出，至出口处保留1-2ml乙醇为止；
c.将准备好的柱子接入AKTA系统，等待系统平衡及排除空气；
(2)实验试剂配制：
a.VBS缓冲液：pH7.2巴比妥缓冲液
准确称量巴比妥0.737g，氯化钠8.766g，七水合硫酸镁0.197g，无水氯化钙0.033g，溶于1L蒸馏水中，用1M NaOH调节pH至7.2，于4℃保存；
b.洗涤缓冲液—A液：10mM PBS，pH7.4；
准确称量NaCl 8g，十二水合磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钾0.135g，氯化钾0.201g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl或1M NaOH调节pH至7.4±0.2；
c.洗脱缓冲液—B液：0.1M甘氨酸盐酸，pH 2.7；
准确称量甘氨酸7.5g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl调节pH至2.7；
d.中和缓冲液—C液：1M Tris-HCl，pH9.0；
准确称量Tris 121.04g，溶于1L蒸馏水中，用1M HCl调节pH至9.0；
e.20％乙醇
准确量取无水乙醇200mL，与800mL蒸馏水混匀；
(3)抗体纯化标准操作流程：
a.取新鲜采集的腹水或冻存的腹水，倒入圆底高速离心管中，加入等体积的VBS稀释液，混匀；
b.按照每10mL稀释腹水加入150mg二氧化硅粉末，混匀后，室温放置摇床200rpm孵育20-30min；
c.离心，上清用0.45μm以下滤器过滤，补加至少1倍体积的10mM PBS，待用；
d.打开Primeview软件，选择“Manual control”，设置“Flow rate”为“6mL/min”；“Prime limit”为“0.4KPa”；“Buffer Valve Pos”为“Pos 1”，设置完成后点击“StartRun”，开始清洗；
e.清洗：用B液清洗层析柱，清洗5-10倍体积；
f.平衡：用A液平衡层析柱，平衡5-10倍体积；
g.上样步骤c处理后的腹水，上样完毕后，继续用A液平衡至紫外基线平稳，并收集穿透液；
h.洗脱：用B液洗脱层析柱，当紫外起峰时收集洗脱峰于预加入3-4mL C液的收集管，收集结束后调pH至7-8；
i.将收集的穿透液混合在一起，重复步骤e-g；
j.将洗脱液装入预处理的透析袋中，对二十倍以上体积的A液4℃透析12小时以上，间隔4小时更换透析液三次。
3.根据权利要求2所述的哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)实验室试剂配制过程中所有配制试剂均需0.45μm滤器过滤除菌。
4.根据权利要求1所述的哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括抗体纯度鉴定，将样品取出，加入0.1％proclin-300，用0.22μm滤器过滤分装，采用BCA法进行抗体浓度的测定，具体操作见下：
a.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B配制BCA工作液，充分混匀；
b.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml，蛋白样品和标准品用相同的溶液稀释；
c.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl；
d.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl；
e.各孔加入200μl BCA工作液，静置进行显色反应；
f.测定A540-595nm之间的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
5.根据权利要求4所述的哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤b蛋白样品和标准品用的稀释溶液为0.9％NaCl或PBS稀释标准品。
6.根据权利要求1所述的哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括抗体效价鉴定，将样品取出，采用间接ELISA进行抗体效价的测定，操作如下
a.设计间接ELISA实验：
b.在进行样品稀释之前需将所有样品浓度稀释至1mg/ml后再进行下一步稀释，并按照实验室的ELISA实验体系进行实验操作；
c.结果判定：阴性对照A450OD值小于0.1为阴性结果有效；效价判定：样品A450OD/阴性对照A450OD大于2.1为有效效价，取比值大于并最接近2.1处一抗稀释比例为抗体效价。
7.一种哌拉西林单克隆抗体的应用，其特征在于：用于哌拉西林药物抗体检测，将哌拉西林单克隆抗体作为阳性对照试剂。
8.根据权利要求7所述的哌拉西林单克隆抗体的应用，其特征在于：以被检测对象血液作为检测样品，若血浆中存在哌拉西林抗体，则该抗体通过抗IgG+C3d桥连与哌拉西林处理细胞上的哌拉西林药物抗原结合产生凝集，在离心力的作用下不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层或分散在凝胶中，呈现阳性反应；若血浆中不存在抗体或细胞表面不含有药物抗原则不产生凝集，在离心力作用下可通过凝胶间隙而沉积在微柱凝胶孔的底部，呈现阴性反应。
9.一种哌拉西林单克隆抗体的应用，其特征在于：用于哌拉西林诱导型溶血检测试剂盒的制备，该试剂盒包括
哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I，
哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡II，
哌拉西林处理红细胞，
非哌拉西林处理红细胞，
哌拉西林抗体阳性对照，
哌拉西林抗体阴性对照。
10.根据权利要求9所述哌拉西林单克隆抗体的应用，其特征在于：该试剂盒的检验步骤如下
(一)哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I
(9)患者红细胞悬液的配制：患者新鲜血液样本压积红细胞用0.9％氯化钠溶液洗涤一次得到压积红细胞，用0.9％氯化钠溶液配制成0.5～1％浓度的红细胞悬液；
(10)取哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡I，每份待检患者样本标记3孔，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；
(11)向标记的每孔中加入患者样本0.5～1.0％的红细胞悬液；
(12)混匀，置微柱凝胶卡配套的离心机离心，30min内观察结果并记录；
(二)哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ
(15)取哌拉西林诱导型溶血检测试剂卡Ⅱ，每份待检患者样本标记4孔，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；
(16)哌拉西林处理红细胞悬液的配制：取试剂盒中哌拉西林处理红细胞用0.9％氯化钠溶液洗涤三次后得到压积红细胞，用0.9％氯化钠溶液配制成2～2.5％浓度的红细胞悬液；
(17)向第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔的每孔中加入哌拉西林处理的红细胞悬液各25μl；
(18)向第Ⅳ孔中加入非哌拉西林处理的红细胞悬液25μl；
(19)向第Ⅰ和第Ⅳ孔中分别加入待检样本0.9％氯化钠溶液1:19稀释的血浆50μl，第Ⅱ孔中加入阳性对照液50μl，第Ⅲ孔中加入阴性对照液50μl；
(20)混匀，置试剂卡孵育器37±1℃孵育1h；
(21)置LB-3000医用离心机离心，30min内观察结果并记录；
(三)反应结果判定
阳性结果：红细胞位于胶表面或者悬浮在胶中均为阳性反应(1+～4+)；
阴性结果：红细胞全部沉积在微孔底部为阴性。
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