CN109337965A - 一种荧光染料与电泳pcr双用缓冲液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光染料与电泳PCR双用缓冲液，包括以下各组分：甲酚红钠(1.5～2.5)*10^‑5g/L、PCR Buffer 71～75％、dNTP 5.5～6.5％、甘油4～5％、SYBR GreenⅠ0.008～0.015％和灭菌去离子水15～20％。本发明的双用染剂的具有不同检测平台的通用性，可适用不同厂牌Taq酶，至少确认可用于Invitrogen、Promega、Bioer Taq与pfu Taq，可同时用于Syber green I real‑time PCR扩增或一般PCR扩增，并且荧光PCR扩增反应后可直接进行琼脂糖电泳执行产物回收或判读，不需额外加入染色剂即可电泳，荧光PCR检测后仍可进行电泳检测，不需额外加入染色剂。缓冲液配方可以简化电泳操作时需要与染料稀释与加入核酸染剂的两个过程，特别是省略传统核酸染料EtBr等致癌物，大大增加试验的安全性。

Description

一种荧光染料与电泳PCR双用缓冲液
技术领域
本发明分子试验技术领域，具体涉及一种荧光染料与电泳PCR双用缓冲液。
背景技术
PCR反应中加入缓冲液有助于酶的稳定，能提供聚合酶活力需要的离子和合适的酸碱度，给PCR反应提供一个最适合酶催化反应的条件。传统的Real time PCR中使用的缓冲液中，一般不添加甘油与甲酚红钠。通常认为甲酚红钠会吸收Syber green I发散荧光，使荧光值下降，而甘油的加入会引起溶液密度加大影响荧光值。当缓冲液中存在Sybergreen I时，电泳时会因为PCR反应液密度对比电泳使用的缓冲液密度小，在加入反应液时会使飘起来，无法上样，而且由于上样时由于电泳缓冲液与PCR反应液都为无色透明液体，导致上样困难，一般现在的电泳方法需要将PCR反应液与染料(含增加密度的溶液)稀释混合方能顺利上样。
当Real time PCR所使用的Syber green I浓度较低时，电泳时若没有将核酸染料加入琼脂糖凝胶或电泳后复染过程无法顺利判读PCR扩增条带。
发明内容
本发明要解决的技术问题是传统的Real time PCR中使用的缓冲液一般不添加染色剂，电泳时前需要混入染料的缺陷，提供一种及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明所达到的有益效果是：
一种荧光染料与电泳PCR双用缓冲液，包括以下各组分：
甲酚红钠(1.5～2.5)*10^-5g/L
PCR Buffer 71～75％
dNTP 5.5～6.5％
甘油4～5％
SYBR Green Ⅰ0.008～0.015％
灭菌去离子水15～20％。
优选的，所述的荧光染料与电泳PCR双用缓冲液，包括以下各组分：
甲酚红钠2.5*10^-5g/L
PCR Buffer 71.5％
dNTP 5.7％
甘油4.3％
SYBR Green Ⅰ0.01％
灭菌去离子水17.9％。
在Real time PCR的运用中，一般不使用甘油与甲酚红钠。因为甲酚红钠会吸收Syber green I发散荧光，使荧光值下降，甘油使溶液密度加大影响荧光值。在本发明的配方中提高Syber green I使用量，提高至(1.5～2.5)*10^-5g/L，较现有技术中提高了5倍左右，配方中的甘油与甲酚红钠可以吸收Syber green I提高浓度后产生的背景讯号。Realtime PCR所使用的Syber green I浓度较低时，若进行电泳时若没有将核酸染料加入琼脂糖凝胶或电泳后复染过程无法顺利判读PCR扩增条带，而本发明的配方因为提高Sybergreen I浓度，因此电泳操作不需要使用核酸染料。
传统Real time PCR所使用的Syber green I，不加入甘油与甲酚红钠。这样的PCR缓冲液若进行电泳时会因为PCR反应液密度对比电泳使用的缓冲液密度小，在加入反应液后容易飘起来，无法上样。而且缺少甲酚红钠时由于电泳缓冲液与PCR反应液都为无色透明液体，导致上样困难，一般现在的电泳方法需要将PCR反应液与染料(含增加密度的溶液)稀释混合方能顺利上样。而本发明的我们的缓冲液呈现紫红色，在25℃时pH值应≥8.0。确保在TAE,TB,TBE 0.5-2乘的电泳缓冲液时都能顺利上样，不需要额外与染料稀释。另外，甲酚红钠同时作为缓冲液内控，室温条件下当缓冲液从紫红色变为无色或黄色时，缓冲液失效。
本发明的双用染剂的具有不同检测平台的通用性，可适用不同厂牌Taq酶，至少确认可用于Invitrogen、Promega、Bioer Taq与pfu Taq，可同时用于Syber green I real-time PCR扩增或一般PCR扩增，并且荧光PCR扩增反应后可直接进行琼脂糖电泳执行产物回收或判读，不需额外加入染色剂即可电泳，荧光PCR检测后仍可进行电泳检测，不需额外加入染色剂。缓冲液配方可以简化电泳操作时需要与染料稀释与加入核酸染剂的两个过程，特别是省略传统核酸染料EtBr等致癌物，大大增加试验的安全性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是PCR扩增后溶解曲线的结果；
图2是电泳的结果。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种荧光染料与电泳PCR双用缓冲液，包括以下各组分：
甲酚红钠2.5*10^-5g/L
PCR Buffer 71.5％
dNTP 5.7％
甘油4.3％
SYBR Green Ⅰ0.01％
灭菌去离子水17.9％。
本实施例的缓冲液在≤-18℃条件下，有效期为1年，用于PCR扩增的DNA应尽量保持其完整性和纯度。
在PCR反应中加入适量缓冲液，给PCR反应提供一个最适合酶催化反应的条件。
采用以下优化后的PCR扩增条件，1500bp内的片段都可以顺利扩增。用户根据自己设计的基因片段的具体要求，自己优化出的PCR扩增条件下，本发明的缓冲液仍然有非常出色的扩增和电泳结果。本发明的缓冲液应当避免长时间暴露在非储存条件下。若缓冲液颜色变为透明或黄色则失效。
PCR测序
PCR基因分型(电泳/荧光)
图1是在FluoVia Line 9600Plus real-time PCR下利用本发明的双用PCR缓冲液进行PCR扩增后溶解曲线的结果，使用的是针对ALB基因开发程度120bp的引物，在76～78℃有明显溶解峰，PCR顺利扩增。
图2中左一左二的条带为在FluoVia Line 9600Plus real-time PCR利用双用PCR缓冲液进行电泳的结果，使用的是针对ALB基因开发程度120bp的引物，出现明显单一条带；右一右二的条带为在ABI 9700PCR利用双用PCR缓冲液进行PCR电泳的结果，使用的是针对ALB基因开发程度120bp的引物，出现明显单一条带。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种荧光染料与电泳PCR双用缓冲液，其特征在于，包括以下各组分：
甲酚红钠 (1.5～2.5)*10^-5g/L
PCR Buffer 71～75％
dNTP 5.5～6.5％
甘油 4～5％
SYBR Green Ⅰ 0.008～0.015％
灭菌去离子水 15～20％。
2.如权利要求1所述的荧光染料与电泳PCR双用缓冲液，其特征在于，包括以下各组分：
甲酚红钠 2.5*10^-5g/L
PCR Buffer 71.5％
dNTP 5.7％
甘油 4.3％
SYBR Green Ⅰ 0.01％
灭菌去离子水 17.9％。
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