CN106480181A - 用于检测转基因成分CaMV35S的LAMP引物组及其方法 - Google Patents

用于检测转基因成分CaMV35S的LAMP引物组及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测CaMV35S启动子的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括CaMV‑F3引物、CaMV‑B3引物、CaMV‑FIP引物、CaMV‑BIP引物、CaMV‑LF引物、CaMV‑LB引物。本发明还提供了利用所述LAMP引物组进行CaMV35S启动子检测的方法。本发明提供的LAMP引物组，可实现对CaMV35S启动子的检测，并且检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，结果便于判断，降低了实验室投入，适合推广使用。

Description

用于检测转基因成分CaMV35S的LAMP引物组及其方法
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测转基因成分CaMV35S的LAMP引物组及其方法。
背景技术
伴随着转基因技术的迅猛发展，全球农业生物技术的产业化速度也随之大大加快，转基因作物的推广种植面积逐年递增，然而，由于目前对转基因产品的安全性尚无定论，各国政府和消费者普遍对此采取谨慎的态度，纷纷出台一系列法规对转基因产品的贸易加以限制，要求对转基因作物及其加工产品进行标识。因此，建立完善的转基因农产品及食品检测体系显得尤其重要。
CaMV35S是外源基因在植物中表达的常用调控元件，可作为转基因生物的标记，目前大部分转基因生物都含有CaMV35S启动子。CaMV35S启动子的广泛使用使其成为进行转基因初筛的首要目标，因此可减少分析实验室进行特异性检测的数量。在风险分析和商业化过程中，考虑到转基因生物的大规模筛选，筛选CaMV35S启动子也是一种有效的方法。
现有技术中对于CaMV35S启动子的特异性检测主要有普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法。由于普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法需要经历变温过程及其相应的快速升降温的温度控制，也就需要价格高昂的专用PCR设备，而现场检测要求降低对仪器的依赖，无法满足现场检测需要。不仅如此，PCR方法还存在污染严重、假阳性率高的问题，限制了PCR检测方法的推广。
环介导等温扩增技术（英文名称为loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。本发明将LAMP技术运用于农产品及食品中转基因成分CaMV35S启动子的快速检测，可以免除高昂的仪器投入，便于基层及现场检测使用。目前尚未出现可用于检测CaMV35S启动子且适于大规模应用的LAMP引物组及其方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种可用于检测CaMV35S启动子且适于大规模应用的LAMP引物组。
本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中检测CaMV35S启动子的方法存在需要投入高昂的仪器、检测操作繁琐、检测成本较高的问题，进而提供一种操作简单、检测成本低的检测CaMV35S启动子的方法。
本发明的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；其中，所述CaMV-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述SEQ ID No.1为5`-GGCTCCTACAAATGCCATCA-3`；所述CaMV-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，所述SEQ ID No.2为5`-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3`；所述CaMV-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构，所述SEQ ID No.3为5`-GGTGGGGGTCCATCTTTGGGTTTTAGGAAAGGCCATCGTTGAA-3`；所述CaMV-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构，所述SEQ ID No.4为5`-CACGAGGAGCATCGTGGAAAAATTTTACGTCAGTGGAGATATCACA-3`；所述CaMV-LF引物具有如SEQ IDNo.5所示的序列结构，所述SEQ ID No.5为5`-ACCACTGTCGGCAGAGG-3`；所述CaMV-LB引物具有如SEQ ID No.6所示的序列结构，所述SEQ ID No.6为5`-GAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA-3`。
优选地，所述CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）：（2-12）。
本发明的检测CaMV35S启动子的方法，利用本发明所述的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组进行检测。
优选地，所述的检测CaMV35S启动子的方法，包括以下步骤：将权利要求1或2中所述的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组与待测溶液混合，将混合液置于55-65℃下培育10min以上，观察或检测所述混合液的变化情况。
优选地，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸。
进一步优选地，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、MgSO4、去离子水中的一种或多种。
优选地，所述混合液中还包括金属指示剂；所述金属指示剂为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐。
进一步优选地，所述混合液中还包括Mncl2；所述Mncl2与所述金属指示剂的用量摩尔比为1:1。
本发明还提供了包括本发明所述的LAMP引物组的检测试剂盒。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
（1）本发明的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组，可实现对CaMV35S启动子的检测，并且具有简单、快速、特异性强、灵敏度高的优点；更为重要的是，采用本发明的LAMP引物组对CaMV35S启动子进行检测，可实现现场高通量快速检测，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，所需的检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，结果可以通过常规的电泳判断，也可以通过颜色变化直接判断，降低了实验室投入，检测成本远低于荧光定量PCR，适合基层实验室推广使用；
（2）本发明的检测CaMV35S启动子的方法，采用4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐作为金属指示剂，由于环介导等温扩增反应的灵敏度高，极易造成污染，这也是环介导等温扩增容易产生假阳性的原因，本发明采用的所述金属指示剂能够在反应液配制时加入，反应结束后，不需开盖，直接通过反应液颜色变化即可判断结果，减少了气溶胶污染的可能性，避免了假阳性的产生；
（3）本发明的检测CaMV35S启动子的方法，除将LAMP引物组与待测溶液混合外，还在混合液中加入了Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸，保证了环介导等温扩增的顺利进行，并且还加入了Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、甜菜碱、去离子水，多重试剂协同作用，使得其检测的灵敏度提高、特异性增强、检测率提高、检测速度加快，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1 检测CaMV35S启动子的LAMP引物组的设计
本实施例中，检测CaMV35S启动子的LAMP引物组包括所述LAMP引物组包括CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；其中，所述CaMV-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构；所述CaMV-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述CaMV-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述CaMV-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构；所述CaMV-LF引物具有如SEQ ID No.5所示的序列结构；所述CaMV-LB引物具有如SEQ ID No.6所示的序列结构。
所述SEQ ID No.1：5`-GGCTCCTACAAATGCCATCA-3`
所述SEQ ID No.2：5`-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3`
所述SEQ ID No.3：5`-GGTGGGGGTCCATCTTTGGGTTTTAGGAAAGGCCATCGTTGAA-3`
所述SEQ ID No.4：5`-CACGAGGAGCATCGTGGAAAAATTTTACGTCAGTGGAGATATCACA-3`
所述SEQ ID No.5：5`-ACCACTGTCGGCAGAGG-3`
所述SEQ ID No.6：5`-GAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA-3`
实施例2 LAMP引物组的对CaMV35S启动子的检测
本实施例中使用的转基因成分CaMV35S启动子的阳性对照液购买自通用生物系统（安徽）有限公司，所述CaMV35S启动子的基因片段具有如SEQ ID No.7所示的序列结构，所述SEQ ID No.7为GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATC；DNA提取试剂盒购买自生物工程（上海）有限公司。需要说明的是，不仅仅是CaMV35S启动子的阳性对照液、DNA提取试剂盒为现有技术公开的、市售的常规材料，本实施例中使用的Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、Bst DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、MgSO4、去离子水、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、Mncl2等均为现有技术公开的、市售的常规材料，不同原料、来源以及制备方法得到的上述产品并不影响本发明的实施及其效果（下同，后文不再冗述）。
采用实施例1中所述的LAMP引物组进行肺CaMV35S启动子的检测，具体步骤如下：
（1）CaMV35S启动子阳性对照液及阴性对照液的制备：
CaMV35S启动子阳性对照液：将具有如SEQ ID No.7所示的序列结构的CaMV35S启动子基因，TA克隆至pUC57载体上，作为阳性对照模板，该阳性对照液由通用生物系统（安徽）有限公司提供；
阴性对照液：用LB培养基过夜培养大肠杆菌ATCC 25922，生物工程（上海）有限公司DNA提取试剂盒提取DNA，作为阴性对照液。
（2）CaMV35S启动子的检测：
将实施例1中所述的CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；分别与步骤（1）中制备得到CaMV35S启动子阳性对照液及阴性对照液混合，将两组混合液分别置于60℃下培育60min，电泳所述混合液，观察所述混合液的变化情况；
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液产生特异梯状DNA条带；加入所述阴性对照液的混合液未产生特异梯状DNA条带。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对CaMV35S启动子的检测。
实施例3 LAMP引物组对CaMV35S启动子的检测
采用实施例1中所述的LAMP引物组进行CaMV35S启动子的检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述CaMV-F3引物、1µl浓度为10µM的所述CaMV-B3引物、1µl浓度为40µM的所述CaMV-FIP引物、1µl浓度为40µM的所述CaMV-BIP、1µl浓度为20µM的所述CaMV-LF引物、1µl浓度为20µM的CaMV-LB引物、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1µl 浓度为8U/µl 的BstDNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、5µl的去离子水，分别与2µl的实施例2中所述的阳性对照液、所述阴性对照液混合，将两组所述混合液置于65℃下培育60min，电泳所述混合液，观察所述混合液的变化情况。
其中，所述Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为：200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C),100 mMKCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100。需要说明的是，所述BstDNA聚合酶缓冲液的成分并不唯一，只要能在反应过程中起到缓冲作用的溶液即可，本实施例只是提供一种具体的实现方式，本领域技术人员可根据实际情况替换为其他成分的缓冲液（下同，后文不再冗述）。
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液产生特异梯状DNA条带；加入所述阴性对照液的混合液未产生特异梯状DNA条带。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对CaMV35S启动子的检测。
实施例4 LAMP引物组的对CaMV35S启动子的检测
采用实施例1中所述的LAMP引物组进行CaMV35S启动子的检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述CaMV-F3引物、1µl浓度为10µM的所述CaMV-B3引物、1µl浓度为40µM的所述CaMV-FIP引物、1µl浓度为40µM的所述CaMV-BIP、1µl浓度为20µM的所述CaMV-LF引物、1µl浓度为20µM的CaMV-LB引物、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1µl 浓度为8U/µl 的BstDNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、1µl浓度为0.4mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、1µl浓度为0.4mM的MnCl2、5µl的去离子水，分别与实施例2的步骤（1）中制备得到2µl的CaMV35S启动子阳性对照液及2µl阴性对照液混合，将两组混合液分别置于65℃下培育60min，观察所述混合液的变化情况。
需要说明的是，作为本实施例的优选实现方式，两组混合液分别置于65℃下培育60min，采用水浴锅进行恒温培育。
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液的颜色变为浅黄色；加入所述阴性对照液的混合液颜色保持橘红色。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对CaMV35S启动子的检测。
实施例5
采用实施例1中所述的LAMP引物组进行CaMV35S启动子的检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述CaMV-F3引物、1µl浓度为10µM的所述CaMV-B3引物、1µl浓度为40µM的所述CaMV-FIP引物、1µl浓度为40µM的所述CaMV-BIP、1µl浓度为20µM的所述CaMV-LF引物、1µl浓度为20µM的CaMV-LB引物、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1µl 浓度为8U/µl 的BstDNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、1µl浓度为0.4mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、1µl浓度为0.4mM的MnCl2、5µl的去离子水，分别与实施例2的步骤（1）中制备得到2µl的CaMV35S启动子阳性对照液及2µl阴性对照液混合，每组设置6个重复，将两组混合液分别置于65℃下培育60min，观察所述混合液的变化情况。
需要说明的是，作为本实施例的优选实现方式，两组混合液分别置于65℃下培育60min，采用水浴锅进行水下恒温培育，相比公开号为CN102140516B的专利文献，本发明将所述混合液置于水下，进行恒温水浴，偶尔泄露的气体将经过水洗将扩增产物溶解在水中，可防止核酸扩增产物引起的气溶胶污染，极大的减少了假阳性的产生，解决了环介导等温扩增技术推广应用的瓶颈：气溶胶污染。
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液的颜色变为浅黄色，6个重复全部变为浅黄色；加入所述阴性对照液的混合液颜色保持橘红色，6个重复均保持橘红色。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对CaMV35S启动子的检测。本发明中金属指示剂4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐所检测的是环介导等温扩增的副产物焦磷酸根，即可以提前加入到反应体系中，又不受引物二聚体的影响；而公开号为CN102140516B的专利文献中通过浑浊度或使用指示剂SYBR Green 判断扩增结果，通过焦磷酸镁引起的浑浊度来判断，环介导等温扩增引起的浑浊度变化不明显易受操作人员主观因素的影响而误判，SYBR Green 是通过插入到扩增产物双链DNA中荧光受到激发而强度增强，以此判断扩增结果，而此方法易受引物二聚体的影响。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 许昌学院
<120> 用于检测转基因成分CaMV35S的LAMP引物组及其方法
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> CaMV-F3
<400> 1
ggctcctaca aatgccatca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> CaMV-B3
<400> 2
gatagtggga ttgtgcgtca 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> CaMV-FIP
<400> 3
ggtgggggtc catctttggg ttttaggaaa ggccatcgtt gaa 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> CaMV-BIP
<400> 4
cacgaggagc atcgtggaaa aattttacgt cagtggagat atcaca 46
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> CaMV-LF
<400> 5
accactgtcg gcagagg 17
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> CaMV-LB
<400> 6
gaagacgttc caaccacgtc ttca 24

Claims (9)

1.检测CaMV35S启动子的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；其中，所述CaMV-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构；所述CaMV-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述CaMV-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述CaMV-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构；所述CaMV-LF引物具有如SEQ ID No.5所示的序列结构；所述CaMV-LB引物具有如SEQ ID No.6所示的序列结构。
2.根据权利要求1所述的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组，其特征在于，所述CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）：（2-12）。
3.检测CaMV35S启动子的方法，其特征在于，利用权利要求1或2中任一所述的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组进行检测。
4.根据权利要求3所述的检测CaMV35S启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2中所述的检测CaMV35S启动子的LAMP引物组与待测溶液混合，将混合液置于55-65℃下培育10min以上，观察或检测所述混合液的变化情况。
5.根据权利要求4所述的检测CaMV35S启动子的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸。
6.根据权利要求5所述的检测CaMV35S启动子的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、MgSO4、去离子水中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的检测CaMV35S启动子的方法，其特征在于，所述混合液中还包括金属指示剂；所述金属指示剂为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐。
8.根据权利要求7所述的检测CaMV35S启动子的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Mncl2；所述Mncl2与所述金属指示剂的用量摩尔比为1:1。
9.一种包括权利要求1-4中任意一项所述的LAMP引物组的检测试剂盒。
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