CN105177178A - 烟草花叶病毒lamp检测用的试剂盒 - Google Patents

烟草花叶病毒lamp检测用的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，其特征在于包括：LAMP反应液缓冲液0.6mL；引物250μL；荧光染料50μL；酶溶液50μL；阳性对照50μL；去离子水1000Μl；本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒；采用本发明试剂盒检测烟草花叶病毒的方法具有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。

Description

烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
烟草花叶病毒tobaccomosaicvirus缩写TMV，为RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，系Tobamovirus属的代表种。该病毒是伊凡诺夫斯基D.I.Iwanowski于1892年首次证明了这个TMV的存在。斯坦利W.M.Stanley于1935年首先从烟草病叶榨汁中分离到TMV病毒状结晶，其以了解到这个蛋白质还含有核酸，并肯定病原就是这个病毒。该病毒极其稳定，因在病叶内能大量地增殖，所以从1升病叶榨汁中可提纯2克结晶。TMV粒子长300纳米、直径18纳米，有一条分子量为2×106道尔顿的单链RNA。核酸被2130个分子量为17530道尔顿的蛋白质亚基所包裹。TMV的寄主范围是十分广泛，现已知对22科植物中的198种植物都具有侵染性，如烟草及各种蔬菜等，是目前植物病毒中寄生范围最为广泛的病毒之一。
该病毒的致死温度是90-93℃经10分钟，稀释限点106倍，体外保毒期72-96小时。在无菌条件下致病力达数年，在干燥病组织内存活30年以上。而且该病毒有不同株系，我国主要有普通株系、番茄株系、黄斑株系和珠斑等4个株系，因致病力差异及与其他病毒的复合侵染而造成症状的多样性。
TMV能在多种植物上越冬，初侵染源为带病残体和其它寄主植物，另外未充分腐熟的，带毒肥料也可引致初侵染。它主要通过汁液传播，病健叶轻微摩擦造成微伤口，病毒即可侵入，不从大伤口和自然孔口侵入，侵入后在薄壁细胞内繁殖，后进入维管束组织传染整株。在22—28℃条件下，染病植株7—14天后开始显症，田间通过病苗与健苗摩擦或农事操作进行再侵染。另外烟田中的蝗虫、烟青虫等咀嚼式口器的昆虫也可传播。
由于该病毒寄生范围广，可以侵染多种农作物、而且极易传播、带病毒残体潜伏侵染时间又非常长，给防治该病毒带来了极大的困难，每年都会给农作物造成无法估量的损失，因此最经济有效的控制策略是对种苗就进行检测，发现TMV病毒的及时淘汰，在源头上把好防治病毒关。
目前植物病毒的检测方法主要有生物学、血清学和分子生物学三种，生物学方法就是用病毒指示植物来检测病毒的存在与否，一般需要7-10天；血清学方法是根据抗原抗体的特异性结合来检测病毒，一般只需要4-6小时左右，但是它需要特异性的抗血清，而且检测灵敏度不高，还存在有非特异性问题；分子生物学方法主要是指PCR方法，该方法快且准确性也比较高，但是需要昂贵的检测仪器和相关设备，而且对于像TMV这个病毒，由于其稀释限点是106倍，即将病汁液稀释到106倍才失去侵染力，故需要灵敏度非常高的检测方法才能将潜在的TMV检测出来，以上三种方法灵敏度都难以达到，这样必将存在漏检的可能，所以急需研究新的检测方法。
目前已有的检测方法，其检测步骤繁琐，采用仪器昂贵，不能快速、方便的实现鉴别鱼翅真伪。故此，现有鉴别鱼翅真伪的检测方法有待进一步完善。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒；采用本发明试剂盒检测烟草花叶病毒的方法具有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，其特征在于包括：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3’；
反向外引物B3：5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3’；
正向内引物FIP：
5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA；
F2：GTGTTCTTGTCATCAGCGT；
反向内引物BIP：
5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA；
B2：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC。
如上所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，其特征在于该试剂盒产品规格：45次。
一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、烟草花叶病毒RNA的提取
采用纳米磁珠提取烟草花叶病毒RNA；
B、建立LAMP反应体系
25μL的LAMP反应体系包括20μL预反应溶液和5μLDNA模板，其中20μL预反应溶液，由以下组分组成:
所述引物的序列包括：
正向外引物F3：5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3’；
反向外引物B3：5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3’；
正向内引物FIP：
5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT
-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA；
F2：GTGTTCTTGTCATCAGCGT；
反向内引物BIP：
5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA
-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA；
B2：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC；
C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20μL；
D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA5μL，使总量达到25μL；
E、对照反应中，阴性对照反应使用黄瓜花叶病毒的RNA5μL，空白对照反应使用去离子水5μL，阳性对照使用烟草花叶病毒RNA5μL；
F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；
G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60-70℃恒温反应90min，最后60-80℃下保温5min以结束反应；
H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果。
如上所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述(正向外引物F3+反向外引物B3)：(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1:2-1:10。
如上所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述的FIP和BIP各1.6μM，各40pmol；F3和B3各0.2μM，各5pmol。
如上所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤A中所述的烟草花叶病毒RNA的提取具体步骤：
1)制样：取0.1g的烟草花叶病毒感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨，得样品；
2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
5)裂解：加入50μLddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为烟草花叶病毒的RNA。
如上所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述的LAMP浊度仪方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。
如上所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述荧光目测的方法：
使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
综上所述，本发明的有益效果：
本发明采用环介导等温扩增loop－mediatedisothermalamplification，简称LAMP是一种新的核酸检测方法，其原理是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在l小时内能扩增出109靶序列拷贝，扩增产物电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。传统的PCR技术，PCR结束后，需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测，操作步骤繁琐，费时费力，而且存在溴化乙锭或同位素对人体和环境的危害。而本研究所建立的LAMP技术检测烟草花叶病毒省时、经济且敏感性高。检测结果只需利用LAMP浊度仪或者SYBG的绿色荧光或通过目测是否产生白色沉淀就知道反应是否发生，而不需要烦琐的凝胶电泳检测过程。
本发明采用磁珠法提取TMV的RNA并根据TMV主要株系的外壳蛋白编码基因设计了检测TMV的LAMP扩增的通用型引物，且建立了TMVLAMP检测的体系，通过本体系可以在一个小时内高灵敏度的检测出TMV病毒的存在，检测灵敏度达到10fg，比普通PCR要高出一千倍，且具有较好的特异性。另外本方法不要昂贵的仪器和设备，只需要一个保温箱即可，操作简单，检测结果可以直接通过颜色的反应来判读，非常适合基层一线的使用，在种苗、花卉等繁殖材料病毒检测方面具有广阔的应用前景和非常好的实用价值。
附图说明
图1为本发明LAMP特异性试验结果；
图2为本发明LAMP灵敏度评价的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
本发明以下实施例中所采用材料：
1.1烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV购自美国AGDIA公司。
1.2主要试剂和耗材
(1)RNA扩增反应试剂盒LoopampRNAAmplificationkit；
(2)朗報荧光目视检测试剂盒；
(3)FluorescenceDetectionReagent；
(4)朗報反应试管等均购置于北京蓝谱生物科技有限公司
(5)LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3)均由宝生物工程(大连)有限公司合成；
1.3主要仪器设备
(1)－80℃冷冻冰箱；
(2)Labofuge400R高速冷冻台式离心机；
(3)微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；
(4)超纯水系统，Milli－QAcademic，Millipore公司；
(5)超净工作台；
(6)漩涡混合器；
(7)LAMP实时浊度仪，LA－320C，日本荣研生物公司。
实施例1
一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，包括：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3’；
反向外引物B3：5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3’；
正向内引物FIP：
5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA；
F2：GTGTTCTTGTCATCAGCGT；
反向内引物BIP：
5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA；
B2：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC。
产品规格：40次
特点：
环介导等温扩增法loop-mediatedisothermalamplification,LAMP是一种新型基因扩增方法，仅用一种酶在恒温下进行扩增，由于使用能够识别靶RNA6个特异序列的4条引物,所以特异性高，且扩增效率非常高，能够在短时间大量扩增，反应结果可以目测判定。
本试剂盒采用环介导等温扩增法，以TMV核酸RNA为模板直接进行环介导等温扩增的简易试剂盒，只需将待测样品和本试剂盒中的试剂按照要求混合后置于63℃下反应1小时即可，即可肉眼观查反应结果。
操作方法：
1).试剂的配制：
a.取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
b.在冰上配制预混液：取检测所需的反应量，按照下表比例配制一个反应的量，下表各组分分别分装在另外准备的预混溶液配制用的灭菌管中：
c.分装后轻弹击试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在试管底部；
2).加样：往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的RNA5μL即10ng，使总量达到25μL，阴性对照反应使用去离子水5μL作为样品，阳性对照反应使用带有TMVRNA的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；
3).扩增：将试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
4).检测：使用紫外线照射装置，波长240－260nm,350-370nm，从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查。如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
注意事项及保存条件：
所有试剂于-20℃保存，避免多次反复冻融及造成污染,配制好的预混溶液要立即使用。
有效期：12个月。
实施例2
一种烟草花叶病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、烟草花叶病毒RNA的提取
采用纳米磁珠提取烟草花叶病毒RNA；
1)制样：取0.1g的烟草花叶病毒感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨，得样品；
2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
5)裂解：加入50μLddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为烟草花叶病毒的RNA。
B、建立LAMP反应体系
25μL的LAMP反应体系包括20μL预反应溶液和5μLDNA模板，其中20μL预反应溶液，由以下组分组成:
所述引物的序列包括：
正向外引物F3：5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3’；
反向外引物B3：5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3’；
正向内引物FIP：
5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA；
F2：GTGTTCTTGTCATCAGCGT；
反向内引物BIP：
5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA；
B2：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC；
所述(正向外引物F3+反向外引物B3)：(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1:8。
C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20μL；
D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA5μL，使总量达到25μL；
E、对照反应中，阴性对照反应使用黄瓜花叶病毒的RNA5μL，空白对照反应使用去离子水5μL，阳性对照使用烟草花叶病毒RNA5μL；
F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；
G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60℃恒温反应90min，最后60℃下保温5min以结束反应；
H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果。
本发明中所述的LAMP浊度仪方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。
1.实时浊度检测
使用Loopamp实时浊度测定装置，可以进行实时检测；
2.终点浊度测定：
使用Loopamp终点浊度测定装置，可以检测出检测结束时的浊度；
3.荧光目测检测
使用朗報荧光目视检测试剂盒，可以通过目测对结果进行判定。扩增反应结束后，使用紫外线照射装置(波长240～260nm，350～370nm)从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察。若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性，若与阴性对照一样未发出荧光，则判定为阴性。
SYBRGreenI染料与双链DNA结合后会发绿色荧光，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则说明检测结果阳性。
为了验证本发明引物的特异性和灵敏性，本发明作了以下试验：
1、LAMP特异性试验
以TMVRNA作为LAMP反应的模板，CMVRNA作为阴性对照，用本实验设计的LAMP引物，按照优化好的LAMP反应条件进行LAMP反应，以验证各引物的特异性，利用LAMP浊度仪与SYBRGreen肉眼观察法同步观察反应结果。
结果如图1所示，CH1-7：TMV样品，CH8：CMV阴性对照，由图1可看出，引物只对TMV特异性检出，出峰时间都在39－42分钟之间。
二、LAMP灵敏度评价
将TMVRNA按照10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6倍稀释成浓度梯度，每个稀释度分别取5μl进行LAMP实验，以ddH2O代替RNA模板作为空白对照，按照优化好的LAMP反应条件进行扩增，以确定LAMP反应的灵敏度。
浊度仪的检测结果中，可以看出LAMP反应的检出限能够达到10－5稀释度即10fg，图2所示。

Claims (2)

1.一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，其特征在于包括：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3’；
反向外引物B3：5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3’；
正向内引物FIP：
5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA；
F2：GTGTTCTTGTCATCAGCGT；
反向内引物BIP：
5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA；
B2：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC。
2.根据权利要求1所述的一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，其特征在于该试剂盒产品规格：45次。
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