CN105506069A - Lamp技术鉴别鱼翅真伪用的试剂盒 - Google Patents

Lamp技术鉴别鱼翅真伪用的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于包括：LAMP反应液缓冲液0.6mL；引物250μL；荧光染料50μL；酶溶液50μL；阳性对照50μL；去离子水1000Μl。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的试剂盒；采用本发明试剂盒检测鉴别鱼翅真伪方法具有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。

Description

LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
鱼翅作为我国传统的海产珍品，被誉为“海味八珍”之一，属于高级滋补品，常与燕窝、鲍鱼、海参等相提并论，它是鱼翅是鲨、鳐、鲛的鳍或尾端部分，经过一系列复杂的加工过程精制而成，主要产于日本、墨西哥、巴西、非洲、中东、印度、南美洲及澳洲，我国的东海、南海也有出产，但是我国是主要的进口国，每年进口约3500吨各种形式的鱼翅。
鲨鱼隶属于软骨鱼纲Chondrichthyes、板鳃亚纲Elasmobranchii、鲨目Selachoidei、星鲨属Mustelus，是海洋生物链中最高层的重要鱼类，全世界共有鲨鱼约370种，可是用来割取鱼翅的约20来种，由于其珍贵且稀有，加上市场对它的需求持续的增长，导致各类仿鱼翅、参假鱼翅等泛滥流行，极大地扰乱了我国市场次序，极大地侵害了消费者的权益，甚至危害了消费者的身体健康。急需研究灵敏度高且操作方便适合基层实验室检测的方法来打击假冒伪劣鱼翅产品，以保护消费者的合法权益。
目前国内外已有人报道用PCR和FINS方法来鉴定鱼翅的种类，但存在PCR扩增片段过大难以扩增出来，还有设计的引物范围不宽，存在漏检的可能，而且PCR方法需要昂贵仪器设备，操作复杂。目前制备鱼翅的主要鲨鱼种类包括有犁头沙KJ170949.1：Sphyrnalewini；JX827259.1，Sphyrnalewini；HM239662.1Sphyrnalewini、平滑锤头鲨KM489157.1Sphyrnazygaena、公牛鲨KF646785.1Carcharhinusleucas、灰色真鲨KC470543.1Carcharhinusobscurus、黑翼鲨KJ720818.1Carcharhinusmelanopterus、白斑星鲨AB015962.1Mustelusmanazo、欧氏尖吻鲨EU528659.1Mitsukurinaowstoni、海洋白鳍鲨AY820736.1Carcharhinuslongimanus、褐星鲨EU099503.1Mustelushenlei、KJ010763.1Mustelushenlei、沙虎鲨KF569943.1Carchariastaurus、大青鲨GU324148.1Prionaceglauca、鼬鲨KF111728.1Galeocerdocuvier、姥鲨KF597303.1Cetorhinusmaximus、灰星鲨KF889325.1Mustelusgriseus等鲨鱼。
目前已有的检测方法，其检测步骤繁琐，采用仪器昂贵，不能快速、方便的实现鉴别鱼翅真伪。故此，现有鉴别鱼翅真伪的检测方法有待进一步完善。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的试剂盒；
采用本发明试剂盒检测鉴别鱼翅真伪方法具有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于包括：
如上所述的一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于所述的引物包括：
正向外引物F3：5’-CAGGATTTCCTGATCAATG-3’；
反向外引物B3：5’-GTGTGAACTCAGATCACGT-3’；
正向内引物FIP：
5’-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；
F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
反向内引物BIP：
5’-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：TACGGCCTCGATGTTGGATC；
B2：AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
如上所述的一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于该试剂盒产品规格：45次。
一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、鱼翅DNA的提取
采用纳米磁珠提取鱼翅DNA；
B、建立LAMP反应体系
25μL的LAMP反应体系包括20μL预反应溶液和5μLDNA模板，其中20μL预反应溶液，由以下组分组成：
所述引物的序列包括：
正向外引物F3：5’-CAGGATTTCCTGATCAATG-3’；
反向外引物B3：5’-GTGTGAACTCAGATCACGT-3’；
正向内引物FIP：
5’-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；
F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
反向内引物BIP：
5’-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：TACGGCCTCGATGTTGGATC；
B2：AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20μL；
D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA5μL，使总量达到25μL；
E、对照反应中，阴性对照反应使用普通鲤鱼DNA5μL，空白对照反应使用去离子水5μL，阳性对照使用鱼翅本身提取的DNA5μL；
F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；
G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60-70℃恒温反应90min，最后60-80℃下保温5min以结束反应；
H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果。
如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述(正向外引物F3+反向外引物B3)：(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1∶2-1∶10。
如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述的FIP和BIP各1.6μM，各40pmol；F3和B3各0.2μM，各5pmol。
如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于步骤A中所述的纳米磁珠提取鱼翅DNA具体步骤：
1)制样：将不同鱼翅样品用锉刀磨碎，取磨碎样品0.1-0.5g的鱼翅组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨制成样品；
2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
5)裂解：加入50μLddH2O到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为鱼翅DNA。
如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述的LAMP浊度仪方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。
如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述荧光目测的方法：
使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
本发明采用环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification，简称LAMP是一种新的核酸检测方法，其原理是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1小时内能扩增出109靶序列拷贝，扩增产物电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。传统的PCR技术，PCR结束后，需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测，操作步骤繁琐，费时费力，而且存在溴化乙锭或同位素对人体和环境的危害。而本研究所建立的LAMP技术检测鱼翅省时、经济且敏感性高。检测结果只需利用LAMP浊度仪或者SYBG的绿色荧光或通过目测是否产生白色沉淀就知道反应是否发生，而不需要烦琐的凝胶电泳检测过程。
综上所述，本发明的有益效果：
本发明采用磁珠法提取鱼翅的DNA并根据鱼翅鲨鱼的线粒体COI基因序列设计了鱼翅LAMP检测的通用性特异性引物，通过对不同鲨鱼类特异性检测，建立了LAMP方法鉴别鱼翅真伪的方法，其绝对检测限为10fg/μL。本发明中引物特异性和通用性较好，灵敏度高；本发明方法可成功检测市售鱼翅制品中真假鉴别提供了一种有效的技术手段。通过本体系可以在一个小时内高灵敏度的鉴别出鱼翅的真伪，检测灵敏度达到10fg。另外本发明方法不需要昂贵的仪器和设备，只需要一个保温箱即可，操作简单，结果直接可以判读，非常适合基层一线的使用，在食品掺假、非法添加的检测方面具有广阔的应用前景和非常好的实用价值。
附图说明
图1为本发明LAMP特异性试验结果；
图2为本发明LAMP灵敏度评价的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
本发明以下实施例中所采用材料：
1、各种鱼翅实验样品均购自食品公司和商场。
2、主要试剂
DNA扩增反应试剂盒LoopampDNAAmplificationkit， 荧光目视检测试剂盒，FluorescenceDetectionReagent，反应试管均购置于北京蓝谱生物科技有限公司。
3、主要仪器设备
(1)-80℃冷冻冰箱；
(2)Labofuge400R高速冷冻台式离心机；
(3微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；
(4超纯水系统，Milli-QAcademic，Millipore公司；
(5超净工作台；
(6漩涡混合器；
(7LAMP实时浊度仪，LA-320C，日本荣研生物公司。
实施例1
一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，包括：
产品规格：45次
特点：
环介导等温扩增法loop-mediatedisothermalamplification，LAMP是一种新型基因扩增方法，仅用一种酶在恒温下进行扩增，由于使用能够识别靶DNA6个特异序列的4条引物，所以特异性高，且扩增效率非常高，能够在短时间大量扩增，反应结果可以目测判定。
本试剂盒采用环介导等温扩增法，以鱼翅核酸DNA为模板直接进行环介导等温扩增的简易试剂盒，只需将待测样品和本试剂盒中的试剂按照要求混合后置于一定63℃下反应1小时即可(，即可肉眼观查反应结果。
操作方法：
1).试剂的配制：
a.取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
b.在冰上配制预混液：取检测所需的反应量，按照下表比例配制一个反应的量，下表各组分分别分装在另外准备的预混溶液配制用的灭菌管中：
c.分装后轻弹击试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在试管底部；
2).加样：往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的DNA5μL(10ng)，使总量达到25μL，阴性对照反应使用去离子水5μL作为样品，阳性对照反应使用带有鱼翅DNA的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；
3).扩增：将试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
4).检测：使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查。如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
注意事项及保存条件：
所有试剂于-20℃保存，避免多次反复冻融及造成污染，配制好的预混溶液要立即使用。
有效期：12个月。
实施例2
本发明LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，包括以下步骤：
A、鱼翅DNA的提取
采用纳米磁珠提取鱼翅DNA；
1)制样：将不同鱼翅样品用锉刀磨碎，取磨碎样品0.3g的鱼翅组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨制成样品；
2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
5)裂解：加入50μLddH2O到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为鱼翅DNA。
B、建立LAMP反应体系
25μL的LAMP反应体系包括20μL预反应溶液和5μLDNA模板，其中20μL预反应溶液，由以下组分组成：
所述引物的序列包括：
正向外引物F3：5’-CAGGATTTCCTGATCAATG-3’；
反向外引物B3：5’-GTGTGAACTCAGATCACGT-3’；
正向内引物FIP：
5’-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；
F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
反向内引物BIP：
5’-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：TACGGCCTCGATGTTGGATC；
B2：AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
其中所述(正向外引物F3+反向外引物B3)：(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1∶8。
C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20μL；
D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA5μL，使总量达到25μL；
E、对照反应中，阴性对照反应使用普通鲤鱼DNA5μL，空白对照反应使用去离子水5μL，阳性对照使用鱼翅本身提取的DNA5μL；
F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；
G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60℃恒温反应90min，最后60℃下保温5min以结束反应；
H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果。
本发明中所述的LAMP浊度仪方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。
1.实时浊度检测
使用Loopamp实时浊度测定装置，可以进行实时检测；
2.终点浊度测定：
使用Loopamp终点浊度测定装置，可以检测出检测结束时的浊度；
3.荧光目测检测
使用荧光目视检测试剂盒，可以通过目测对结果进行判定。扩增反应结束后，使用紫外线照射装置(波长240～260nm，350～370nm)从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察。若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性，若与阴性对照一样未发出荧光，则判定为阴性。
SYBRGreenI染料与双链DNA结合后会发绿色荧光，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则说明检测结果阳性。
为了验证本发明引物的特异性和灵敏性，本发明作了以下试验：
一、LAMP特异性试验
以鱼翅DNA作为LAMP反应的模板，鲤鱼DNA作为阴性对照，用本实验设计的LAMP引物，按照优化好的LAMP反应条件进行LAMP反应，以验证各引物的特异性，利用LAMP浊度仪与SYBRGreen肉眼观察法同步观察反应结果。
结果如图1所示，CH1-7：不同鱼翅DNA样品(犁头沙、平滑锤头鲨、公牛鲨、灰色真鲨、黑翼鲨、白斑星鲨、褐星鲨)，CH8：鲤鱼阴性对照。
由图1可看出，引物只对鱼翅特异性检出，出峰时间都在39-42分钟之间。
二、LAMP灵敏度评价
将鱼翅DNA按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释成浓度梯度，每个稀释度分别取2μl进行LAMP实验，以ddH2O代替DNA模板作为空白对照，按照优化好的LAMP反应条件进行扩增，以确定LAMP反应的灵敏度，同时分别取2μl用于MNP-PCR扩增反应。
将鱼翅(白斑星鲨)DNA上述比例稀释成一系列的浓度梯度，分别用于进行LAMP反应结果如图2所示，在LAMP浊度仪的检测结果中，可以看出LAMP反应的检出限能够达到10-5稀释度(10fg/μL)。其中图2中CH1：阴性对照(鲤鱼)；CH2-7分别为稀释度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

Claims (3)

1.一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于包括：
2.根据权利要求1所述的一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于所述的引物包括：
正向外引物F3：5'-CAGGATTTCCTGATCAATG-3’；
反向外引物B3：5'-GTGTGAACTCAGATCACGT-3’；
正向内引物FIP：
5'-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：
F1c：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；
F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
反向内引物BIP：
5'-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3’
所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：
B1c：TACGGCCTCGATGTTGGATC；
B2：AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
3.根据权利要求1所述的一种用于LAMP技术鉴别鱼翅真伪的试剂盒，其特征在于该试剂盒产品规格：45次。
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