CN105861680A - 环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秘鲁鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的LAMP检测方法中所用的特异性引物，由上游外引物(F3)、下游外引物(B3)、上游内引物(FIP)、下游内引物(BIP)组成。本发明还同时提供了一种环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，包括以下步骤：①、待测鱼类样品中基因组DNA的提取；②、秘鲁鱿鱼LAMP扩增引物的设计；③、实时荧光LAMP体系和LAMP染色法体系设置；④、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断。

Description

环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法

技术领域

本发明涉及两种适用于秘鲁鱿鱼及其深加工产品种类的环介导等温扩增检测方法，即，利用实时荧光LAMP法和LAMP染色法鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法。

背景技术

秘鲁鱿鱼(Dosidicus gigas)，又称茎柔鱼，是头足纲(Cephalopoda)、枪形目(Teuthida)、柔鱼科(Ommastrephidae)品种。2003-2012年，秘鲁鱿鱼的渔获量从40万吨增长到95万吨，是渔获量最大的头足类品种，具有很高的商业价值。在中国本土市场，除秘鲁鱿鱼外，最常见的鱿鱼还有阿根廷鱿鱼(Illex argentinus)、日本海鱿鱼(Todarodespacificus)和北太平洋鱿鱼(Ommastrephes bartramii)。鱿鱼肉质鲜美，富含多种人体必需的成分，市场上的鱿鱼除了直接鲜销，还会经加工来供应市场。常见的鱿鱼加工形式有：冻品，如冻鱿鱼胴片、冻鱿鱼圈等；干品，如鱿鱼鲞、鱿鱼耳等；熟食产品，如鱿鱼丝、鱿鱼仔、鱿鱼罐头等。近年来，鱿鱼正作为一种新的鱼糜原料在鱼糜生产中崭露头角,其产量巨大、蛋白含量高、无骨刺、易加工,因而受到鱼糜生产者的青睐。也为鱿鱼的加工利用提供了一条新的途径。

不同品种鱿鱼滋味成分差异显著，直接影响鱿鱼产品的口感，甚至风味。因而不同的鱿鱼价格也不一样，如秘鲁鱿鱼资源丰富，个体大，但含有特殊酸味且肉质较差，所以价格较其它鱿鱼品种低。鉴于此，对鱿鱼产品进行标识，不仅有利于消费者根据自身喜好来选择鱿鱼品种，也为不同品种鱿鱼加工及应用提供一定的理论基础。但是，标签制度的有效实施和掺假造假的判定，必须是建立在快速、准确的鱿鱼品种鉴定的基础上的。目前该领域国内的研究还在起步阶段。因此，为了规范鱿鱼市场，维护消费者的知情权，迫切需要建立灵敏、可靠的检测方法和检测体系来鉴定鱿鱼类产品原鱼料的品种。

目前，已报道的鱼类种类鉴定方法有着不同的技术原理，如传统形态学法、同工酶和蛋白质电泳分析法、DNA分子遗传标记方法。形态学方法依赖的是专业人士长期的工作经验，对亲缘关系比较密切的相似物种的判断并非有效；蛋白质分析方法的不足在于它并不适用于加工鱼类产品的种类鉴别，因为在产品加工过程中，热处理过程会破坏蛋白质的结构完整性及其生化特性。

基于形态学和蛋白质鉴定技术的不足，运用DNA技术的分子生物学方法，突显出了其明显的技术优势：1)DNA分子比蛋白质的耐热性强。经过高温高压的加工处理，虽然部分DNA 也会发生降解断裂，但仍能通过技术手段提取出小片段的DNA，这些小片段DNA分子仍可以满足鉴定的需求；2)DNA作为生物体的主要遗传物质，能够提供更多的遗传信息，使检测结果更具精确性；3)依靠DNA为基础的鉴定方法，不受组织类型、年龄以及生理状态等因素的影响，因为DNA分子较稳定，即在生物体发育的不同阶段均可以进行种类鉴定；4)由于生物体内不同的基因片段的进化速率不同，可以选择不同的目的基因片段进行种类研究和鉴定，多方面的探究该生物体的遗传与种类特征；5)相比蛋白质，DNA分子有着更高的种间多态性，利于对近亲缘关系鱼类种属的鉴定。

DNA分子技术用于种类鉴定有多种常见方法，如限制性片段长度多态性(RFLP)标记、单碱基多态性(SNP)标记、微卫星(microsatellite)标记、DNA条形码技术(DNAbarcode)、荧光定量PCR技术等。其中荧光定量PCR技术是近年来发展起来的比较成熟的核酸定量检测方法，它在常规的PCR基础上加入荧光信号物质(探针或染料)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过扩增曲线的Ct值对未知模板进行定量分析。它集中了核酸杂交特异性强和PCR扩增灵敏度高、检测范围广、检测限低的优点。但是，荧光PCR实验需要使用较昂贵的荧光PCR仪，且难以适应快速现场检测的需要。

相较上述的以PCR技术为基础的检测方法，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是一种新的DNA扩增方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换的DNA聚合酶，在等温条件下扩增不到1h，可合成10⁹～10¹⁰个数量级的靶标DNA，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，适合于基层的现场快速检测。

由于LAMP扩增产物由多重复靶序列的茎环状DNA和花椰菜状DNA组成，传统的琼脂糖凝胶电泳检测会呈现特有的阶梯状条带，但这种方法耗时较长，且需要打开LAMP反应管进行电泳操作，从而增加了污染的几率。LAMP在扩增形成大量核酸时，可产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，也可以直接通过肉眼观察白色沉淀的存在与否判断扩增结果，但反应产物较少，混浊度较低时，肉眼难以察觉。为了更高效准确地利用LAMP技术，近年来出现了许多闭管检测方法，例如：

1)实时荧光LAMP法：在LAMP反应体系中加入荧光基团，随着扩增反应的进行，DNA浓度快速上升，荧光信号逐渐增强。通过实时荧光监测仪对荧光强度进行实时的监测，可以实现扩增的实时定性或者定量检测。实验室里该方法可以在荧光PCR仪上进行。而近年来出现的便携式等温设备——实时荧光监测仪(ESE-Quant Tube Scanner)使实时荧光LAMP法能在基层得到更广泛是应用；

2)LAMP染色法：提前在LAMP反应管盖内壁滴加SYBRI染料，然后盖紧管盖反应。反应结束后摇晃反应管，使反应液和染料混合，根据反应液颜色变化判断结果(绿色为阳性，橙色为阴性)。反应可在水浴锅、金属浴或PCR仪上进行，成本更低而且反应时间更短，非常适用于现场检测。

这两种方法都具有方便快捷、特异性高、灵敏度高、可从源头上有效的控制气溶胶污染(由于整个LAMP反应过程采用闭管扩增)等特点。LAMP方法得到改进和发展，并被广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等各祌核酸快速检测当中。但是，目前尚没有用于秘鲁鱿鱼或其深加工产品种类鉴定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供两种环介导等温扩增技术(LAMP)，利用该技术高速、灵敏准确的特性，检测秘鲁鱿鱼(Dosidicus gigas)的特异基因，对秘鲁鱿鱼及深加工秘鲁鱿鱼产品进行快速鉴定。

为解决上述技术问题，本发明提供一种秘鲁鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的LAMP检测方法中所用的特异性引物，特异性引物如下表1所述：

表1

。

所述秘鲁鱿鱼特异性引物由其线粒体COI基因中的六个区域组成，其中上游外引物(F3)、下游外引物(B3)分别包含一个区域，上游内引物(FIP)包含F1c、F2两个区域(F1c和F2之间用“-”隔开)，下游内引物(BIP)包含B1c、B2两个区域(B1c和B2之间用“-”隔开)。

这样的引物设计，能使产物形成茎环状结构，以便后续链置换反应的进行。

本发明还同时提供了一种环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法(用于秘鲁鱿鱼种类鉴定的LAMP检测方法)，其特征包括以下步骤：

①、待测鱼类样品中基因组DNA的提取；

②、秘鲁鱿鱼LAMP扩增引物的设计；

③、实时荧光LAMP体系和LAMP染色法体系设置；

④、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断(即，对市售鱿鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符)。

作为本发明的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法的改进：

所述步骤②是对秘鲁鱿鱼的线粒体COI基因的序列进行LAMP检测的特异性鉴定引物的设计。

作为本发明的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法的进一步改进：

所述步骤②中的秘鲁鱿鱼特异性引物如权利要求1所述。

作为本发明的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法的进一步改进：

所述步骤③LAMP扩增体系设置分成如下2种：

第一种，实时荧光LAMP扩增体系：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物(10μM)各0.4μL，上下游内引物(50μM)各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，10μM的9荧光染料0.4μL，DNA模板0.8μL(体系中含量约100ng)，补水至20μL；

反应在实时荧光PCR仪上进行(采用FAM通道)；反应程序：①65℃预反应13sec；②65℃反应47sec；③维持65℃收集荧光信号，并返回步骤②循环44～50次；收集荧光信号需13sec，所以每个循环相当于1min，即反应每分钟收集一次荧光信号。

备注说明：同时设置三个重复和非模板空白对照管；

第二种，LAMP染色法扩增体系：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物(10μM)各0.4μL，上下游内引物(50μM)各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，DNA模板0.8μL(体系中含量约100ng)，补水至20μL；

在上述LAMP染色法扩增体系中加入16μL石蜡油，维持65℃反应30min(反应可在水浴锅、金属浴或PCR仪上进行)；反应结束后震荡反应管，使反应所得物与预先埋设在反应管盖中的0.8μL的1：10(体积比)稀释的SYBRI染料混合。

备注说明：在扩增体系中加入上述石蜡油，只是为了防止反应液蒸发而额外添加的；石蜡油不参与反应过程(不与反应液、染料互溶)；上述反应在试管内进行，在管盖内事先设置上述0.8μL的1：10稀释的SYBRI染料，等反应结束后，使管盖内的SYBRI染料与反应液混合，然后观察颜色变化。染色结果在黑白图片中无法看出颜色变化，但是阳性扩增有白色沉淀物，阴性和空白对照无沉淀产生。

同时设置三个重复和非模板空白对照管。

作为本发明的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法的进一步改进：

当所述步骤①的待测样品为深加工样品(鱿鱼丝、鱿鱼罐头等)，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂(Cat#9178)提取基因组DNA；

当所述步骤①的待测样品为生鲜样品或冻藏样品，采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。

备注说明：所得的DNA模板中，DNA浓度范围为57.6ng/μL-139.0ng/μL(备注：DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测，要求OD260/OD280在1.8-2.0之间)。

作为本发明的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法的进一步改进：

所述步骤④的扩增结果分析及结果判断分为以下两种：

当为第一种的实时荧光LAMP扩增体系时：

根据实时荧光LAMP反应中的特异性扩增曲线与对应的检出时间判断被检鱿鱼样品的种类是否与标签所述相符；检测基因无扩增曲线产生或检出时间≥30min者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；检出时间小于30min者，可判定该样品结果为阳性；

当为第二种的LAMP染色法扩增体系时：

第二种，反应30min后，根据加入SYBRI染料后反应液的颜色变化判断被检鱿鱼样品的种类是否与标签所述相符；反应液颜色保持橙色，判定结果为阴性；颜色变为绿色，可判定结果为阳性。

即，具体为：在秘鲁鱿鱼特异性引物作用下，若实时荧光LAMP法不产生扩增曲线或检出时间≥30min，或LAMP染色法不产生阳性结果(加入SYBRI染料后反应液维持橙色)，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；若实时荧光LAMP法产生扩增曲线且检出时间小于30min，或LAMP染色法能产生阳性结果(加入SYBRI染料后反应液变成绿色)，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼。根据检测结果，对比标签标识的商品鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。

本发明根据实验室检测和现场检测的需要，建立两套合适的扩增和分析体系(即实时荧光LAMP方法和LAMP染色法)，对深加工秘鲁鱿鱼产品进行快速鉴定；即，本发明将两种环等温扩增技术(实时荧光LAMP法和LAMP染色法)应用于秘鲁鱿鱼及其深加工产品的品种鉴定标记研究。本发明具有良好的特异性、准确性和灵敏度，且检测时间短，操作简便，可以满足现场检测的需要。本发明为秘鲁鱿鱼及其深加工产品种类的快速检测提供了有效方法，为水产品和食品进出口提供技术保障。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为使用本发明特异性引物进行两种LAMP方法扩增阳性对照、阴性对照以及空白对照的扩增曲线图谱；

a.实时荧光LAMP方法检测。以秘鲁鱿鱼(DG)的样本为阳性对照；以其他五种头足类品种(北太平洋鱿鱼鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼、虎斑乌贼、真蛸)的样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

b.LAMP染色法。以秘鲁鱿鱼(DG)的样本为阳性对照；以其他五种头足类品种样本为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。从左到右顺序为：1秘鲁鱿鱼、2北太平洋鱿鱼鱿鱼、3阿根廷鱿鱼、4日本海鱿鱼、5虎斑乌贼、6真蛸、7空白对照。

备注说明：

1、图1a：实时荧光LAMP扩增体系为：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物(10μM)各0.4μL，上下游内引物(50μM)各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，10μM的9荧光染料0.4μL，DNA模板0.8μL(体系中含量100ng)，补水至20μL。

反应在实时荧光PCR仪上进行，采用FAM通道。反应程序：①65℃预反应13sec；②65℃反应47sec；③维持65℃收集荧光信号，并返回步骤②循环44次。

2、图1b：LAMP染色法扩增体系为：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物(10μM)各0.4μL，上下游内引物(50μM)各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，DNA模板0.8μL(体系中含量100ng)，补水至20μL，并加入石蜡油16μL。将体积比1：10稀释的SYBRI染料0.8μL预先加在管盖内壁后盖紧管盖。反应在水浴锅中进行，维持65℃反应30min。反应结束后震荡反应管，使上述SYBRI染料与20μL反应液混合，观察颜色变化(石蜡油不参与反应，也不与反应液、染料互溶)。

3、上述每个样品的LAMP扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图1b中得以体现，但平行结果均符合以下条件，即：有且仅有这三个秘鲁鱿鱼DNA样品出现LAMP扩增，三平行结果完全一致。

4、图1a中由于受检测板孔位数的限制，空白对照的结果没有在图中得以体现，但空白对照的结果均符合以下条件，即：样品无LAMP扩增；根据该结果，我们得知关于空白对照的以下结论：空白对照的无扩增结果说明了实验组中加入的无菌ddH₂O无DNA模板影响。

5、图1中的结果，显示每组引物和探针均能特异性地扩增目标样品，而且对照组的阴性样品都没有扩增。染色结果在黑白图片中无法看出颜色变化，但是阳性扩增有白色沉淀物，阴性和空白对照无沉淀产生。

图2为LAMP检测方法灵敏度(绝对检出限)示意图。

a.实时荧光LAMP方法检测。将秘鲁鱿鱼的DNA(100ng/μL)进行10倍梯度稀释，获得浓度为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、10pg/μL、1pg/μL的DNA，再以这些DNA为模板进行实时荧光LAMP鉴定。同时以灭菌蒸馏水为模板的空白对照进行反应。结果以折线图表示，以DNA含量的log值作为横坐标，以对应DNA含量的检出时间的平均值作为纵坐标。

b.LAMP染色法。样品准备步骤同上，再以这些DNA为模板进行LAMP染色法检测。同时以灭菌蒸馏水为模板的空白对照进行反应。图中反应管从左到右的DNA模板含量分别为：100ng(标号1)、10ng(标号2)、1ng(标号3)、0.1ng(标号4)、10pg(标号5)、1pg(标号6)，第7个样品为空白对照。

备注说明：

1、上述每个样品的LAMP扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图2b中得以体现，但平行结果均符合以下条件，即：三平行结果完全一致，实验重复性良好。

2、染色结果在黑白图片中无法看出颜色变化，但是阳性扩增有白色沉淀物，阴性和空白对照无沉淀产生。

3、根据图2a检出时间的折线图，得出：

当反应液中模板DNA含量介于10pg到10ng，其DNA含量对数与检出时间呈线性关系，且反应重复性非常高；当含量小于10pg，检出时间大于30min，且检出时间的标准差也开始变大。

4、比较图2a、b的结果，得出：

当反应液中模板DNA含量大于10pg时，样品都可以在30min内产生阳性信号(检出)。而DNA含量1pg的样品都无法在30min内检出，表明本次发明的两个实验方法灵敏度相当，绝对检出限都为每个反应10pg。

图3采用建立的LAMP检测体系对混合样本进行检测。其中a表示用实时荧光LAMP体系对混合样本进行检测；b表示用LAMP染色法进行检测。

a.实时荧光LAMP方法检测。采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒提取含有0.01-10％(w/w)秘鲁鱿鱼混合样品的DNA，再以这些DNA为模板进行实时荧光LAMP鉴定。同时以未混入秘鲁鱿鱼的混合物(0％)DNA为模板作对照。结果以散点图表示，以秘鲁鱿鱼含量的百分比作为横坐标，以对应百分比的检出时间的平均值作为纵坐标。

b.LAMP染色法。样品准备步骤同上。以这些DNA为模板进行LAMP染色法鉴定。同 时以未混入秘鲁鱿鱼的混合物(0％)DNA为模板作对照。图中秘鲁鱿鱼含量百分比从左到右分别为：10％、1％、0.1％、0.01％、0％。

备注说明：

1、混合物制备，先将北太平洋鱿鱼、阿根廷鱿鱼、日本海鱿鱼、真蛸、虎斑乌贼生鲜样品以1：1：1：1：1比例混合，然后将秘鲁鱿鱼和该混合物以10：90、1：99、0.1：99.9和0.01：99.99的比例混合，混合物中秘鲁鱿鱼含量分别为10％、1％、0.1％、0.01％。

2、上述每个样品的LAMP扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图3b中得以体现，但平行结果均符合以下条件，即：三平行结果完全一致，实验重复性良好。

3、染色结果在黑白图片中无法看出颜色变化，但是阳性扩增有白色沉淀物，阴性和空白对照无沉淀产生。

4、比较图3a、b的结果，得出：

当秘鲁鱿鱼和其他样品混合在一起时，占总量0.01-10％(w/w)的秘鲁鱿鱼均能被这两种LAMP方法在30min内成功检测出来，表明这两种方法的相对检出限都能达到0.01％。所以这两种方法在混合DNA检测中有高特异性，可以应用到后续对深加工样品的检测。

具体实施方式

实施例1、采用两种LAMP检测方法对市场上随机购买的鱿鱼冷冻产品(冻鱿鱼圈、冻鱿鱼胴片等)或其它水产品种类鉴定，包括进行以下步骤：

①待测样品中基因组DNA的提取；采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒提取样品DNA，于-20℃保存。

②对秘鲁鱿鱼特异性鉴定引物的设计；

特异性引物具体如上述表1所述。

③LAMP扩增体系设置；

以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物，进行实时荧光LAMP检测或LAMP染色法检测。

具体如下：

实时荧光LAMP扩增体系设置：

反应体系为：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物(10μM)各0.4μL，上下游内引物(50μM)各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，10μM的9荧光染料0.4μL，DNA模板0.8μL，补水至20μL。同时设置三个重复和非模板空白对照管；

所述反应缓冲液为：20mM Tris-HCl、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)₂SO4、0.1％Tween-20、0.4M甜菜碱、1.4mM dNTPs。

Bst聚合酶具体为：Bst DNA聚合酶，NEB(New England Biolabs)公司，#M0275V，800units，8U/μL。

实时荧光LAMP反应在实时荧光PCR仪上进行，采用FAM通道。反应程序：①65℃预反应13sec；②65℃反应47sec；③维持65℃收集荧光信号(13sec)，并返回步骤②循环50次。

LAMP染色法扩增体系设置：

反应体系为：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物(10μM)各0.4μL，上下游内引物(50μM)各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，DNA模板0.8μL，补水至20μL。LAMP染色法扩增体系中的反应缓冲液、Bst聚合酶同实时荧光LAMP扩增体系中所用。

LAMP染色法扩增反应可在金属浴上进行，在上述LAMP染色法扩增体系中加入石蜡油16μL；维持65℃反应30min。

将体积比1：10稀释的SYBRI染料0.8μL预先设置在管盖内壁后盖紧管盖。

反应结束后震荡反应管；使SYBRI染料与20μL反应液混合，观察颜色变化(石蜡油不参与反应，也不与反应液、染料互溶)。

④根据任意一种LAMP检测结果进行判断(即，对市售鱿鱼样品的种类鉴定，判断是否是秘鲁鱿鱼、是否与标签所述相符)。

扩增结果分析及结果判断的依据有两种：

第一种，根据实时荧光LAMP反应中的特异性扩增曲线与对应的检出时间长短判断被检样品中是否是秘鲁鱿鱼；检测基因无特异性扩增曲线产生或检出时间≥30min者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；有特异性扩增曲线产生且检出时间小于30min者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼。

第二种，根据LAMP染色法反应结束后的颜色变化判断被检样品中是否是秘鲁鱿鱼；反应液与SYBRI染料混合后，若反应液维持橙色，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；若反应液变成绿色，判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼。

实验1、将事先已经确定商品名称与实际相符的以下鱼的样品(冻鱼片)按照实施例1所述方法进行检测，所得结果如下表2所述。

表2

实施例2、采用上述两种LAMP检测方法对市场上随机购买的鱿鱼罐头商品进行种类鉴定：

从市场上随机购买标识为鱿鱼罐头或成分中包含鱿鱼的罐头商品，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂(Cat#9178)提取样品DNA，于-20℃保存。利用两种LAMP检测方法对其进行种类鉴定。采用实时荧光LAMP法检测，若检测基因无特异性扩增曲线产生或检出时间≥30min者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；有特异性扩增曲线产生且检出时间小于30min者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼；采用LAMP染色法检测，反应液与SYBRI染料混合后，若反应液维持橙色，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；若反应液变成绿色，判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼。根据检测结果，对比标签标识的商品鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。

即，将实施例1中的步骤①作了上述更改，其余内容等同于实施例1。

实验2、将事先已经确定商品名称与实际相符的鱼罐头的样品按照实施例2所述方法进行检测，所得结果如下表3所述。

表3

实施例3、采用上述两种LAMP检测方法对市场上随机购买的鱿鱼深加工商品进行种类鉴定：

从市场上随机购买标识为鱿鱼丝、鱿鱼片及产品成分中包含鱿鱼的商品，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂(Cat#9178)提取样品DNA，于-20℃保存。采用实时荧光LAMP法检测，若检测基因无特异性扩增曲线产生或检出时间≥30min者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；有特异性扩增曲线产生且检出时间小于30min者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼；采用LAMP染色法检测，反应液与SYBRI染料混合后，若反应液维持橙色，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含秘鲁鱿鱼；若反应液变成绿色，判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有秘鲁鱿鱼。根据检测结果，对比标签标识的商品鱿鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。

即，将实施例1中的步骤①作了上述更改，其余内容等同于实施例1。

实验3、将事先已经确定商品名称与实际相符的鱼片干的样品按照实施例3所述方法进行检测，所得结果如下表4所述。

表4

对比例1：

将实施例1中所用的特异性引物改成如表5所示的序列，其余等同于实施例1。

表5

然后将实验1所述样品按照此对比例1所述方法进行检测，所得结果如下表6所述。

表6

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.秘鲁鱿鱼或其深加工产品种类鉴定的LAMP检测方法中所用的特异性引物，其特征是如下所述：

。

2.环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，其特征包括以下步骤：

①、待测鱼类样品中基因组DNA的提取；

②、秘鲁鱿鱼LAMP扩增引物的设计；

③、实时荧光LAMP体系和LAMP染色法体系设置；

④、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断。

3.根据权利要求2所述的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，其特征是：

所述步骤②是对秘鲁鱿鱼的线粒体COI基因的序列进行LAMP检测的特异性鉴定引物的设计。

4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，其特征是：

所述步骤②中的秘鲁鱿鱼特异性引物如权利要求1所述。

5.根据权利要求2～4任一所述的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，其特征是：

所述步骤③LAMP扩增体系设置分成如下2种：

第一种，实时荧光LAMP扩增体系：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物各0.4μL，上下游内引物各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，10μM的9荧光染料0.4μL，DNA模板0.8μL，补水至20μL；

反应在实时荧光PCR仪上进行；反应程序：①65℃预反应13sec；②65℃反应47sec；③维持65℃收集荧光信号，并返回步骤②循环44～50次；

第二种，LAMP染色法扩增体系：20μL反应体系中含有反应缓冲液10μL，秘鲁鱿鱼的上下游外引物各0.4μL，上下游内引物各0.64μL，Bst聚合酶0.8μL，DNA模板0.8μL，补水至20μL；

在上述LAMP染色法扩增体系中加入16μL石蜡油，维持65℃反应30min；反应结束后震荡反应管，使反应所得物与预先埋设在反应管盖中的0.8μL的1：10(体积比)稀释的SYBRI染料混合。

6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，其特征是：

当所述步骤①的待测样品为深加工样品，采用TAKARA肉制品DNA提取试剂提取基因组DNA；

当所述步骤①的待测样品为生鲜样品或冻藏样品，采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。

7.根据权利要求5所述的环介导等温扩增技术鉴定秘鲁鱿鱼及其深加工产品的方法，其特征是：

所述步骤④的扩增结果分析及结果判断分为以下两种：

当为第一种的实时荧光LAMP扩增体系时：

根据实时荧光LAMP反应中的特异性扩增曲线与对应的检出时间判断被检鱿鱼样品的种类是否与标签所述相符；检测基因无扩增曲线产生或检出时间≥30min者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；检出时间小于30min者，可判定该样品结果为阳性；

当为第二种的LAMP染色法扩增体系时：

第二种，反应30min后，根据加入SYBRI染料后反应液的颜色变化判断被检鱿鱼样品的种类是否与标签所述相符；反应液颜色保持橙色，判定结果为阴性；颜色变为绿色，可判定结果为阳性。