CN105779629B - 一种用于牛肉产品溯源鉴别的微卫星引物组合及其检测试剂盒 - Google Patents

一种用于牛肉产品溯源鉴别的微卫星引物组合及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛肉产品溯源鉴别的微卫星引物组合及其检测试剂盒。本发明提供了本发明提供的用于鉴定牛肉的成套引物，为如下1)或2)：1)由引物对BM1818、ILSTS005、INRA032、INRA035、BM1824、HEL5、HEL13、ILSTS006、CSRM60、INRA005、INRA037、INRA063、ETH10、ETH225、INRA023和TGLA122组成；2)由引物组A、引物组B、引物组C和引物组D组成；所述引物组A由引物对BM1818、ILSTS005、INRA032和INRA035组成；本发明方法中选取的16个微卫星标记具有多态性高、标记间不连锁、扩增片段具有多态性，易于基因分型，且将不同标记位点的引物序列分组并利用不同荧光染料修饰，可实现分组多重PCR检测、节约成本、缩短时间、提高效率。

Description

一种用于牛肉产品溯源鉴别的微卫星引物组合及其检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及溯源检测领域，尤其涉及一种牛肉产品溯源鉴别的微卫星引物组合及其检测试剂盒。
背景技术
近年来由于经济利益驱动，市场上经常出现利用低价值产品冒充高价值产品的现象，比如用马肉冒充牛肉，用淘汰的奶牛肉冒充黄牛肉等现象，不仅扰乱了市场秩序，侵犯了消费者权益，而且还可能因为过敏等问题导致消费者健康的风险。同时针对发现的问题牛肉目前的追溯主要是电子标签追溯系统，但是由于流通环节多容易出现标签仿冒，从而无法实现真正可追溯。因此需要开发一种行之有效的方法对市场上的牛肉进行真假鉴别与溯源。
微卫星(STR)作为一种DNA标记在基因组中数量多、分布广且均匀、多态信息含量高，同时性质稳定，不论生肉还是熟食都很容易检出，与其他分子标记(如AFLP、RFLP、RAPD等)相比，微卫星DNA分析方法方便，适合进行自动化检测和开发试剂盒，因而被广泛用于牛的遗传关系研究中。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于牛肉溯源鉴别的成套引物。
本发明提供的用于牛肉溯源鉴别的成套引物，为如下1)或2)：
1)由引物对BM1818、ILSTS005、INRA032、INRA035、BM1824、HEL5、HEL13、ILSTS006、CSRM60、INRA005、INRA037、INRA063、ETH10、ETH225、INRA023和TGLA122组成；
2)由引物组A、引物组B、引物组C和引物组D组成；
所述引物组A由引物对BM1818、ILSTS005、INRA032和INRA035组成；
所述引物组B由引物对BM1824、HEL5、HEL13和ILSTS006组成；
所述引物组C由引物对CSRM60、INRA005、INRA037和INRA063组成；
所述引物组D由引物对ETH10、ETH225、INRA023和TGLA122组成；
所述引物对BM1818由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对BM1824由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对CSRM60由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ETH10由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ETH225由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对HEL5由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对HEL13由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ILSTS005由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ILSTS006由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA005由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA023由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA032由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA035由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA037由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA063由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；
所述引物对TGLA122由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成。
上述成套引物中，所述引物对中一条引物末端标记荧光基因。
上述成套引物中，所述引物对BM1818中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对ILSTS005中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对INRA032中一条引物的5’末端标记TET；
所述引物对INRA035中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对BM1824中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对HEL5中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对HEL13中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对ILSTS006中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对CSRM60中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对INRA005中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对INRA037中一条引物的5’末端标记TET；
所述引物对INRA063中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对ETH10中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对ETH225中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对INRA023中一条引物的5’末端标记TET；
所述引物对TGLA122中一条引物的5’末端标记TET。
本发明另一个目的是提供用于牛肉溯源鉴别的PCR试剂。
本发明提供的用于牛肉溯源鉴别的PCR试剂，为如下1)或2)：
1)包括上述引物中的1)；
2)由包括上述引物组A的PCR试剂A、包括上述引物组B的PCR试剂B、包括上述引物组C的PCR试剂C和包括上述引物组D的PCR试剂D组成；
所述PCR试剂A中，所述引物组A中的引物对BM1818中每条引物、ILSTS005中每条引物、INRA032中每条引物和INRA035中每条引物的摩尔比均为2∶2∶3∶5；
所述PCR试剂B中，所述引物组B中的引物对BM1824中每条引物、HEL5中每条引物、HEL13中每条引物和ILSTS006中每条引物的摩尔比均为5∶2.5∶3∶2.5；
所述PCR试剂C中，所述引物组C中的引物对CSRM60中每条引物、INRA005中每条引物、INRA037中每条引物和INRA063中每条引物的摩尔比均为2.5∶2.5∶5∶5；
所述PCR试剂D中，所述引物组D中的引物对ETH10中每条引物、ETH225中每条引物、INRA023中每条引物和TGLA122中每条引物的摩尔比均为3∶2∶3.5∶5。
上述PCR试剂中，
所述PCR试剂A中，所述引物对BMl818中每条引物的终浓度为0.2μmol/L；
所述引物对ILSTS005中每条引物的终浓度为0.2μmol/L；
所述引物对INRA032中每条引物的终浓度为0.3μmol/L；
所述引物对INRA035中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述PCR试剂B中，所述引物对BM1824中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述引物对HEL5中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述引物对HEL13中每条引物的终浓度为0.3μmol/L；
所述引物对ILSTS006中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述PCR试剂C中，所述引物对CSRM60中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述引物对INRA005中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述引物对INRA037中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述引物对INRA063中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述PCR试剂D中，所述引物对ETH10中每条引物的终浓度为0.3μmol/L；
所述引物对ETH225中每条引物的终浓度为0.2μmol/L；
所述引物对INRA023中每条引物的终浓度为0.35μmol/L；
所述引物对TGLA122中每条引物的终浓度为0.5μmol/L。
本发明第三个目的是提供用于牛肉溯源鉴别的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物或上述的PCR试剂。
上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定牛肉个体中的应用也是本发明保护的范围。
上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定牛肉品种中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述牛肉品种具体为利木赞牛或安多牦牛；
和/或，所述牛肉品种具体为日本和牛、郏县红牛或南阳黄牛。
上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在对牛肉产品溯源中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第四个目的是提供一种鉴定待测牛肉品种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的引物中的2)所示的4个引物组分别对待测牛肉进行PCR扩增，得到4组PCR产物；再将所述4组PCR产物进行毛细管电泳检测，根据PCR扩增产物鉴定待测牛肉品种。
根据PCR扩增产物鉴定待测牛肉品种为将待测牛的成套引物中所有引物对的PCR产物与实施例2或3中的不同品种的牛的PCR产物进行统计学分析，从而判断待测牛肉属于哪个品种。
所述品种具体为利木赞牛或安多牦牛；
和/或，所述品种具体为日本和牛、郏县红牛或南阳黄牛。
本发明的有益效果：
(1)本发明方法中选取的16个微卫星标记为申请人经创造性劳动挑选，并经我国本土大量样本验证后优选得到，其引物序列可在联合国粮农组织(FAO)与国际动物遗传学会(ISAG)联合推荐的用于动物遗传多样性研究的微卫星标记组合(http：//dad.fao.org)中查询到。其具有多态性高、标记间不连锁、扩增片段具有多态性，易于基因分型。
(2)本发明方法尝试将不同标记位点的引物序列分组并利用不同荧光染料修饰，可实现分组多重PCR检测、节约成本、缩短时间、提高效率。
(3)本发明实现了微卫星标记用于牛肉产品的个体溯源鉴定以及部分品种的鉴别，进一步完善了当前单一电子耳标的追溯系统存在的不足，保证上市牛肉的全程可追溯的唯一性、准确性。
(4)本发明的进一步应用，对于打击市场上屡见不鲜的制假售假、仿冒品牌及产地、仿冒名优产品等诸多违法行为提供了一种高效、准确的鉴别方法。
附图说明
图1为利用16对STR引物进行牛肉的个体鉴定。
图2为鲁西黄牛、郏县红牛、南阳黄牛和日本和牛用16对STR引物PCR产物的OPLS-DA判别分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合实例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
实施例1、用于鉴定牛肉品种的引物对及其试剂盒
一、用于鉴定牛肉品种的引物对设计合成
设计合成如下16个牛微卫星引物对，序列及引物名称如表1所示：
表1为16个牛微卫星引物对
二、用于鉴定牛肉品种的复合引物组及其反应体系
为提高PCR扩增效率，经过反复试验，通过将16对引物合理分组得到4个复合引物组(表2)，筛选得到最佳的PCR组成体系及扩增条件(表3)，建立了16个标记位点的最佳复合扩增方法。使16个标记座位仅通过4次PCR反应即可得到所有目的片段。
表2为用于鉴定牛肉品种的复合引物组
表3为PCR体系主要组分及终浓度
每个反应体系中还包括10×PCR扩增缓冲液(Takara Taq HotStart)和ddH2O。
三、用于鉴定牛肉品种的试剂盒
用于鉴定牛肉品种的试剂盒包括上述一的16个引物对或上述二的4个引物组或上述二的4个PCR体系。
四、用于鉴定牛肉品种的检测方法
1、提取牛肉产品基因组DNA；
2、用上述二的4个PCR体系分别对基因组DNA进行多重PCR扩增，得到4组PCR扩增产物。
PCR扩增程序如下表4所示：
表4为PCR扩增程序
3、结果分析
采用荧光标记毛细管电泳检测上述4组PCR扩增产物，根据PCR扩增产物的大小及荧光的颜色，判断微卫星扩增结果，结合该品种已知牛肉微卫星扩增结果，通过统计学分析，进行鉴定品种。
实施例2、16个引物对鉴定牛肉个体
1、基因组DNA提取
采集日本和牛(H)肉样15个、郏县红牛(J)肉样16个、南阳黄牛(N)肉样15个、鲁西黄牛(LX)肉样23个、利木赞牛(LM)肉样15个、安多牦牛(A)肉样16个共计100个牛肉样品。
分别提取100个牛肉样品的基因组DNA。
2、多重PCR扩增
分别以100个牛肉样品的基因组DNA作为模板，用实施例1中的表3的4个反应体系进行PCR扩增，扩增程序如表4。
3、上机检测
将所有牛肉样品的4组PCR扩增产物进行毛细管电泳上机检测，使用3730XL测序仪进行检测。在96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，PCR产物1.0μl；95℃变性3min，上机检测。
4、个体鉴定结果分析
得到所有个体扩增结果，结果见表5所示。
表5所有个体扩增结果(大小为bp)
通过对每头牛的每个引物扩增结果进行分析，可以发现每头牛都有自己特定的扩增图谱。
通过SIMCA-P 14软件，利用偏最小二乘(OPLS-DA)判别法对这100个牛肉样品进行判别，结果如图1所示，利木赞牛(LM-▲，红色)、安多牦牛(A-■，蓝色)、鲁西黄牛(黄色)、郏县红牛(紫色)、南阳黄牛(N绿色)、日本和牛(H-◇，浅蓝色)所示，可以看出，所有的牛肉样品(每个点代表一份牛肉样品)均独立分布于该谱图中。
因此，利用本方法可以鉴定来自不同个体的牛肉。
实施例3、16个引物对用于不同品种牛肉的鉴别
1、基因组DNA提取
与实施例2的1相同；
2、多重PCR扩增
与实施例2的2相同；
3、上机检测
与实施例2的3相同；
4、结果分析
将所有6个品种共计100头牛的16种引物组合扩增结果进行偏最小二乘(OPLS-DA)判别法分析。首先从图1可以看出，利木赞牛(LM)和安多牦牛(A)可以很容易的和其他品种鉴别开。
对剩下的4个品种进一步进行OPLS-DA判别分析，从图2可以看出，除了鲁西黄牛(黄色)与郏县红牛(色)及南阳黄牛(N绿色)无法区分外，日本和牛(H-◇浅蓝色)、郏县红牛以及南阳黄牛(N)可以比较好的区分。
因此利用本发明的16种引物组合，也可以对部分牛肉品种如日本和牛、郏县红牛以及南阳黄牛进行鉴别。
实施例4、16个引物对在牛肉产品溯源中的应用
1、基因组DNA提取
选择某肉牛养殖场，取3头牛血样冻存，分别记为NX1、NX2、NX3。同时人为追踪记录三头牛从养殖场到屠宰场最后到农贸市场或超市的全过程。最后从农贸市场或超市采集这三头牛的肉样，分别记为NR1、NR2、NR3。
提取NX1、NX2、NX3、NR1、NR2、NR3的基因组DNA。
2、多重PCR扩增
与实施例2的2相同；
3、上机检测
与实施例2的3相同；
4、结果分析
结果见表6，比对发现，从市场取得3头牛的肉样和当时留存的血样用16个引物对进行扩增后的结果谱图是完全一致的。这说明本引物组合可以用于市场问题的追溯，当然前提是养殖场要留有血样毛发等样本。
表6为16个引物对溯源三头牛的血样及肉样扩增结果
<u>检材</u> <u>BM1818</u> <u>BM1824</u> <u>CSRM60</u> <u>ETH10</u> <u>ETH225</u> <u>HEL5</u>
<u>NX<sub>1</sub></u> <u>261，263</u> <u>177，177</u> <u>90，100</u> <u>206，210</u> <u>142，150</u> <u>163，165</u>
<u>NR<sub>1</sub></u> <u>261，263</u> <u>177，177</u> <u>90，100</u> <u>206，210</u> <u>142，150</u> <u>163，165</u>
<u>NX<sub>2</sub></u> <u>258，263</u> <u>177，177</u> <u>86，102</u> <u>210，214</u> <u>144，154</u> <u>163，163</u>
<u>NR<sub>2</sub></u> <u>258，263</u> <u>177，177</u> <u>86，102</u> <u>210，214</u> <u>144，154</u> <u>163，163</u>
<u>NX<sub>3</sub></u> <u>261，263</u> <u>179，181</u> <u>90，96</u> <u>206，208</u> <u>154，164</u> <u>150，150</u>
<u>NR<sub>3</sub></u> <u>261，263</u> <u>179，181</u> <u>90，96</u> <u>206，208</u> <u>154，164</u> <u>150，150</u>
<u>检材</u> <u>HEL13</u> <u>ILSTS005</u> <u>ILSTS006</u> <u>INRA005</u> <u>INRA023</u> <u>INRA032</u>
<u>NX<sub>1</sub></u> <u>180，186</u> <u>179，183</u> <u>293，299</u> <u>139，141</u> <u>206，206</u> <u>155，173</u>
<u>NR<sub>1</sub></u> <u>180，186</u> <u>179，183</u> <u>293，299</u> <u>139，141</u> <u>206，206</u> <u>155，173</u>
<u>NX<sub>2</sub></u> <u>184，192</u> <u>181，183</u> <u>293，295</u> <u>137，137</u> <u>211，211</u> <u>176，178</u>
<u>NR<sub>2</sub></u> <u>184，192</u> <u>181，183</u> <u>293，295</u> <u>137，137</u> <u>211，211</u> <u>176，178</u>
<u>NX<sub>3</sub></u> <u>180，180</u> <u>183，183</u> <u>293，299</u> <u>135，139</u> <u>203，211</u> <u>167，173</u>
<u>NR<sub>3</sub></u> <u>180，180</u> <u>183，183</u> <u>293，299</u> <u>135，139</u> <u>203，211</u> <u>167，173</u>
<u>检材</u> <u>INRA035</u> <u>INRA037</u> <u>INRA063</u> <u>TGLA122</u> —— ——
<u>NX<sub>1</sub></u> <u>98，116</u> <u>123，127</u> <u>172，178</u> <u>142，148</u> —— ——
<u>NR<sub>1</sub></u> <u>98，116</u> <u>123，127</u> <u>172，178</u> <u>142，148</u> —— ——
<u>NX<sub>2</sub></u> <u>100，104</u> <u>125，129</u> <u>172，180</u> <u>146，150</u> —— ——
<u>NR<sub>2</sub></u> <u>100，104</u> <u>125，129</u> <u>172，180</u> <u>146，150</u> —— ——
<u>NX<sub>3</sub></u> <u>100，120</u> <u>128，130</u> <u>168，180</u> <u>142，160</u> —— ——
<u>NR<sub>3</sub></u> <u>100，120</u> <u>128，130</u> <u>168，180</u> <u>142，160</u> —— ——

Claims (10)

1.用于鉴定牛肉的成套引物，为如下1）或2）：
1）由引物对BM1818、ILSTS005、INRA032、INRA035、BM1824、HEL5、HEL13、ILSTS006、CSRM60、INRA005、INRA037、INRA063、ETH10、ETH225、INRA023和TGLA122组成；
2）由引物组A、引物组B、引物组C和引物组D组成；
所述引物组A由引物对BM1818、ILSTS005、INRA032和INRA035组成；
所述引物组B由引物对BM1824、HEL5、HEL13和ILSTS006组成；
所述引物组C由引物对CSRM60、INRA005、INRA037和INRA063组成；
所述引物组D由引物对ETH10、ETH225、INRA023和TGLA122组成；
所述引物对BM1818由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对BM1824由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对CSRM60由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ETH10由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ETH225由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对HEL5由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对HEL13由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ILSTS005由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对ILSTS006由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA005由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA023由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA032由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA035由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA037由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；
所述引物对INRA063由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；
所述引物对TGLA122由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成。
2.根据权利要求1所述成套引物，其特征在于：所述每个引物对中一条引物末端标记荧光基因。
3.根据权利要求1或2所述成套引物，其特征在于：
所述引物对BM1818中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对ILSTS005中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对INRA032中一条引物的5’末端标记TET；
所述引物对INRA035中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对BM1824中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对HEL5中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对HEL13中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对ILSTS006中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对CSRM60中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对INRA005中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对INRA037中一条引物的5’末端标记TET；
所述引物对INRA063 中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对ETH10中一条引物的5’末端标记FAM；
所述引物对ETH225中一条引物的5’末端标记HEX；
所述引物对INRA023中一条引物的5’末端标记TET；
所述引物对TGLA122中一条引物的5’末端标记TET。
4.用于鉴定牛肉的PCR试剂，为如下1）或2）：
1）包括权利要求1-3任一项所述成套引物中的1）；
2）由包括权利要求1-3任一项所述成套引物中的引物组A的PCR试剂A、包括权利要求1-3任一项成套引物中的引物组B的PCR试剂B、包括权利要求1-3任一项成套引物中的引物组C的PCR试剂C和包括权利要求1-3任一项成套引物中的引物组D的PCR试剂D组成；
所述PCR试剂A中，所述引物组A中的引物对BM1818中每条引物、ILSTS005中每条引物、INRA032中每条引物和INRA035中每条引物的摩尔比均为2:2:3:5；
所述PCR试剂B中，所述引物组B中的引物对BM1824中每条引物、HEL5中每条引物、HEL13中每条引物和ILSTS006中每条引物的摩尔比均为5:2.5：3:2.5；
所述PCR试剂C中，所述引物组C中的引物对CSRM60中每条引物、INRA005中每条引物、INRA037中每条引物和INRA063中每条引物的摩尔比均为2.5:2.5:5:5；
所述PCR试剂D中，所述引物组D中的引物对ETH10中每条引物、ETH225中每条引物、INRA023中每条引物和TGLA122中每条引物的摩尔比均为3:2:3.5:5。
5.根据权利要求4所述PCR试剂，其特征在于:
所述PCR试剂A中，所述引物对BM1818中每条引物的终浓度为0.2μmol/L；
所述引物对ILSTS005中每条引物的终浓度为0.2μmol/L；
所述引物对INRA032中每条引物的终浓度为0.3μmol/L；
所述引物对INRA035中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述PCR试剂B中，所述引物对BM1824中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述引物对HEL5中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述引物对HEL13中每条引物的终浓度为0.3μmol/L；
所述引物对ILSTS006中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述PCR试剂C中，所述引物对CSRM60中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述引物对INRA005中每条引物的终浓度为0.25μmol/L；
所述引物对INRA037中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述引物对INRA063中每条引物的终浓度为0.5μmol/L；
所述PCR试剂D中，所述引物对ETH10中每条引物的终浓度为0.3μmol/L；
所述引物对ETH225中每条引物的终浓度为0.2μmol/L；
所述引物对INRA023中每条引物的终浓度为0.35μmol/L；
所述引物对TGLA122中每条引物的终浓度为0.5μmol/L。
6.用于鉴定牛肉的试剂盒，包括权利要求1-3任一项所述成套引物或权利要求4或5所述PCR试剂。
7.权利要求1-3任一项所述成套引物或权利要求4或5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒在鉴定牛肉个体中的应用。
8.权利要求1-3任一项所述成套引物或权利要求4或5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒在鉴定牛肉品种中的应用；
所述牛肉品种具体为利木赞牛或安多牦牛；
和/或，所述牛肉品种具体为日本和牛、郏县红牛或南阳黄牛。
9.权利要求1-3任一项所述成套引物或权利要求4或5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒在对牛肉产品溯源中的应用。
10.一种鉴定待测牛肉品种的方法，包括如下步骤：用权利要求1-3任一项所述成套引物中的2）所示的4个引物组分别对待测牛肉进行PCR扩增，得到4组PCR产物；再将所述4组PCR产物毛细管电泳检测，根据PCR扩增产物鉴定待测牛肉品种。
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