CN105018625A - 一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，包含以下步骤：(1)提取待测肉制品的基因组DNA；(2)设计并合成SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示的通用引物序列；(3)以待测肉制品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化；(4)对PCR产物进行定量，并等量混样，构建标准文库，然后进行高通量测序；(5)根据测序结果得到待测肉制品的COI序列信息，得出待测肉制品的材料来源。利用该方法可对肉制品的材料组成和来源进行鉴定，由于COI基因序列中碱基序列的差异能很好地区分物种，因此该方法对肉制品材料来源进行鉴定具有较高的准确性。

Description

一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法。
背景技术
随着经济的发展和人民生活水平的提高，肉类和肉制品的消费发展极为迅猛，由于不同品种肉类的价值差异巨大，错误标签和以次充好的现象越来越多。确定产品所用的肉类、进行产品标签信息的验证，能够起到保护消费者权益、打击造假和错误标签，保障进出口产品质量的作用。而确定产品所用肉类必须要有可靠而准确的肉类物种鉴别方法。
肉类的物种鉴定，主要有形态学方法和分子生物学方法。传统的形态学鉴定方法是在演化的背景下依据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料来构建生物物种之间的关系。传统的形态学鉴定方法只适用于完整形态的肉的样品，一旦进行了加工，如鱼肉片、肉糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得困难，也会导致结果不准确。
但无论如何加工，该动物的DNA始终存在和不可改变，因此采用DNA信息对肉制品原料来源进行鉴定，是一个不错的选择。2003年，加拿大动物学家Paul Hebert等提出线粒体细胞色素C氧化酶亚基(COI)基因序列中碱基序列的差异能很好地区分所有的研究物种。该种基于DNA信息鉴定区分物种的方法，具有较高的准确性。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种借助分子生物学手段，对肉制品进行DNA信息采集后，基于短序列高通量测序的方法，以待测肉制品的COI序列信息对肉制品原料来源进行检测鉴定的方法。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，包含下述步骤：
(1)提取待测肉制品的基因组DNA；
(2)设计并合成COI通用引物序列，其中，正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:1：5’-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3’；
SEQ ID NO:2：5’-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3’；
其中，W代表A/T、Y代表C/T、N代表A/G/C/T、R代表A/G。
(3)采用步骤(2)中所述的正向引物和反向引物，以步骤(1)中所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行纯化；
(4)对步骤(3)中纯化后PCR产物进行定量，并等量混样，构建标准文库，然后进行高通量测序；
(5)根据步骤(4)中测序的结果，得到待测肉制品的COI序列信息，由此得出待测肉制品的材料来源。
本发明的实施方式采用短序列高通量测序的方法，对待测肉制品的DNA信息进行采集，并通过COI本地数据库，对样品材料来源及比例进行检测。在以所提取的待测肉制品基因组DNA为模板进行PCR扩增反应时，本发明在对COI保守序列进行充分分析后，选取保守序列设计引物，并在这些引物对中挑选适合Illumia Miseq测序平台读长的引物对，最终确定SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。上述引物是适用于多种脊椎动物和无脊椎动物的COI广谱通用引物，由于一些深加工的肉制品中材料来源多样化，因此本发明所设计的广谱通用引物确保了后续扩增的效率及鉴定的准确性。在通过短序列高通量测序得到待测肉制品基因组DNA的COI序列信息后，对得到的COI序列信息在数据库中进行比对，进而得到物种信息。利用本发明的实施方式所提供的鉴定方法，可对各种肉制品的材料组成和来源进行鉴定，由于COI基因序列中碱基序列的差异能很好地区分物种，因此利用该方法对肉制品材料来源进行检测鉴定具有较高的准确性。
优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的5’端连接7碱基条形码，作为正向引物和反向引物。本发明的实施方式为基于短序列高通量测序技术对肉制品材料来源的检测鉴定方法，而高通量测序平台一个run的数据量很大，比如MiSeq Reagent Kit v3,600-cycles单个run可以产生25M reads，而单个样品测序1000～30000条reads足够分析，所以一般情况下需要几百甚至上千个样品混合后上机。为了能够很好地区分样品，我们设计了7碱基的条形码(barcode)加在通用引物前面，得到条形码通用引物，用于对基因组DNA的PCR扩增，所述7碱基条形码的序列可以为ACACAGT或CAGAGTC。
优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，所述步骤(3)中进行PCR扩增的反应体系组成为：基因组DNA模板2μl、5U/ul的Q5聚合酶0.25μl、Q5Reaction Buffer(5×)、Q5GC high Enhancer(5×)、2.5μM dNTP 2μl、10μM的正向引物1μl、10μM的反向引物1μl，加ddH2O至25μl。该PCR扩增的反应程序为：98℃预变性30s，然后以98℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s为一个循环，进行27个循环，最后72℃延伸5min，4℃至无穷。本发明的实施方式在针对待测肉制品的基因组DNA进行PCR扩增时，在扩增体系的组成和在扩增反应的反应程序上，都进行了实验条件的优化，所采用的均为最适实验条件。
优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，所述步骤(3)中采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。
优选地，本发明的实施方式中所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，所述步骤(4)中采用美国Biotek FLX800荧光分析仪进行定量。
优选地，本发明的实施方式中所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，所述步骤(4)中采用Illumina文库构建试剂盒进行标准文库的构建。
优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。MiSeq测序平台具有读长较长、数据产出量高的特点，因此较适合用于本发明的实施方式中。
优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，述步骤(4)中根据待测肉制品的COI序列信息得出待测肉制品的材料来源的方法是：将待测肉制品的COI序列信息，与已知物种的COI基因序列进行比对，从而得出待测肉制品的材料来源。
附图说明
图1是实施例1中提取得到的待测肉制品基因组DNA的电泳检测图；
图2是实施例1中待测肉制品基因组DNA的PCR扩增产物的电泳检测图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
实施例1罐头肉制品的材料来源鉴定
1、取肉制品罐头，对罐头内的肉制品进行DNA提取，提取时采用美国Axygen生物科技有限公司的DNA提取试剂盒进行，提取操作步骤为：
1)取20mg肉制品，移入冰水浴预冷的研钵中，快速、用力研磨成匀浆。
2)加入350μl Buffer PBS和0.9μl RNase A后温和地研磨30s。
3)收集350μl研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350μl，补充PBS至350μl。
4)加入150μl Buffer C-L和20μl蛋白酶K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后,将离心管置56℃水浴10min。(不要将蛋白酶K直接加到Buffer C-L中)。
5)加入350μl Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12,000×g离心10min。
6)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤5中的混合液移至制备管中，12,000×g离心1min。
7)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μl BufferW1，12,000×g离心1min。
8)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl BufferW2，12,000×g离心1min，以同样的方法，用700μl Buffer W2再洗涤一次。
9)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12,000×g离心1min。
10)将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200μl Eluent或去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA。
对上述提取得到的基因组DNA做电泳检测，电泳结果如附图1所示。
2、设计并合成广谱通用引物序列(SEQ ID NO:3所示的正向引物和SEQ IDNO:4所示的反向引物)如下：
SEQ ID NO:3：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
SEQ ID NO:4：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
3、采用上述的正向引物和反向引物，以所提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系的组成为：
DNA模板2μl、Q5Polymerase(5U/ul)0.25μl、Q5Reaction Buffer(5×)、Q5GC high Enhancer(5×)、2.5μM dNTP 2μl、10μM的上、下游引物各1μl、加ddH2O至25μl。
PCR扩增的条件为：98℃预变性30s，然后98℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，共27个循环，最后72℃延伸5min,4℃至无穷。
PCR产物采用美国AxyPrep生物科技有限公司的DNA胶回收试剂盒纯化，PCR扩增产物的电泳图如附图2所示。
4、使用美国Biotek FLX800荧光分析仪进行定量，并等量混样，用illuminaTruSeq DNA PCR-Free LT Sample Preparation Kit进行标准文库构建，并在miseq平台上机测序。
由高通量测序结果可得到待测肉制品的以下COI序列(SEQ ID NO:5)信息：
GGCCGGTATAGTGGGCACTGCCCTCAGACTCTTAATTCGAGCTGAACTAGGCCAACCAGGTAGATTAATTGGAAACGACCAAATTTATAATGTGATCGTCACAGCCCATGCATTTGTCATAATTTTCTTCATAGTGATACCGATCATGATCGGGGGGTTTGGGAATTGACTACTGCCCCTAATGTTAGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCCCGAATGAATAACATAAGCTTCTGGCTTTTACCCCCATCCCTAACTCTTCTGCTATCAAGGGGGTTAGTTGAAAGAGGTGTTGGGACAGGATGAACTGTATATCCCCCCCTCTCTGCAGGAATTGCCCACGCAGGAGCCTCAGTAGACCTTGGAATCTTTTCTCTACACCTAGCAGGTGTATCATCAATTCTTGGAGCTGTTAACTTCATAACCACAGTTATCAACATACGAACAACTGGAATAACCATAGACCGAATACCGCTGTTTGTTTGAGCTGTATTCTTAACGGCCATCCTTCTTCTTCTAAGACTCCCTGTCTTGGCAGGAGCTATCACTATACTACTAACAGACCGAAACCTTAATACTGCCTTCTTTGATCCTGCTGGCGGGGGTGACCCAATCCTCTATCAACACCTATTCTGATTCTTCGGACACCCAGAAGTTTAA
对所得到的COI序列信息在NCBI数据库中进行比对，由此可判断本实施例中的肉制品罐头内的肉制品材料来源为鼓虾。
实施例2～4以已知新鲜动物组织、高压处理肉制品、肉干的鉴定作验证
分别取已知来源的新鲜动物组织、高压处理肉制品和肉干作为待测肉制品样本，分别按照实施例1中相同的方法步骤进行实验，来验证实施例1中的方法的准确性(步骤相同，因此不重复记载)，分别得到三种肉制品样本的COI序列信息如下：
新鲜动物组织：
COI序列(SEQ ID NO:6)如下：
AACTGGAGTAAAAGTCTTCAGCTGACTGGCCACTCTGCACGGCGGTGCCATTAAATGAGAAACCCCTCTCCTGTGGGCGCTAGGCTTCATTTTCCTCTTTACAGTTGGAGGATTGACCGGAATCGTTCTAGCTAATTCTTCTCTAGACATTATGCTTCACGACACATATTATGTCGTCGCCCACTTCCACTATGTCCTCTCAATAGGAGCCGTTTTCGCCATTGTTGCCGGCTTCGTCCACTGATTCCCCCTATTCTCAGGGTACACGCTTCACGACACTTGAACAAAAATCCACTTTGGGGTTATATTTGTAGGGGTTAACCTTACTTTCTTCCCACAACACTTCCTAGGACTGGCAGGAATGCCTCGACGATACTTCCGACTACCCCGACGCCTACACCCTTTGAAACACAATCTCTTCTATTGGCTCAATAATTTCAATAGTCAGCGAGGAATTATGTGTTTTATTTATTATATTGAGAAGCATTTGCCGCTAAACGAGAAAGTCCTATCAGTGGAACTTACAGCAACAAACGTAGAATGACTTCACGGTTGCCCTCCCCCTTACCACACCTTTGAAGAGCCTGCCTTCGTCCAAGTTCAACAAGCCTGATTAGACTACGGAAAATCTGCTACCACCCCCTCAAAATCCCACTAA，
鉴定结果该新鲜动物组织来源于非洲鲫鱼(与已知的取样对象一致，验证了本发明方法的准确性)。
高压处理肉制品：
COI序列(SEQ ID NO:7)如下：
GGACGTAGACACCCGAGCCTACTTTACATCAGCCACAATAATCATCGCCATCCCAACTGGTATTAAAGTCTTCAGCTGACTAGCAACCCTGCACGGAGGAACAATTAAATGAGACCCCCCTATGCTATGAGCCCTAGGATTCATCTTCCTCTTCACTATCGGAGGCCTAACAGGAATCGTCCTTGCTAACTCATCACTAGATATTGCCCTTCATGACACCTACTATGTAGTCGCCCACTTCCACTATGTCCTCTCAATGGGGGCAGTTTTTGCCATTCTAGCAGGATTTACCCACTGATTTCCCCTCTTCACAGGCTTTACCCTACACCCATCATGAACCAAAGCACATTTCGGAGTAATATTTACCGGAGTTAACCTAACCTTTTTCCCCCAACATTTCCTGGGCCTAGCTGGAATACCCCGACGATACTCAGATTACCCAGACGCCTACACACTATGAAACACACTATCCTCAATCGGCTCCTTAATTTCAATAACAGCCGTAATCATACTCATATTCATCGTCTGAGAAGCCTTCTCAGCAAAACGAAAAGTACTCCAACCCGAATTAACTGCCACTAATATCGAATGAATTCATGGCTGCCCACCCCCATACCACACCTTCGAAGAACCAGCCTTTGTACAAGTGCAAGAAAGG
鉴定结果高压处理肉制品来源于南丹瑶鸡(与已知的取样对象一致，验证了本发明方法的准确性)。
肉干(两种)：
第一种的COI序列(SEQ ID NO:8)如下：
AATAGACGTCGACACACGAGCCTACTTCACATCAGCCACTATAATTATTGCTATTCCAACCGGGGTAAAAGTCTTCAGCTGATTGGCAACACTTCATGGAGGTAATATCAAATGGTCTCCTGCTATAATGTGAGCCCTAGGCTTTATTTTCTTATTTACAGTAGGGGGTTTAACTGGAATTGTCTTAGCCAACTCTTCCCTCGATATTGTTCTTCACGACACATACTACGTTGTCGCACATTTCCACTATGTTTTATCAATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGGGGGATTTGTTCATTGATTCCCACTATTCTCAGGTTATACTCTCAACGATACATGAGCCAAAATCCACTTCGCAATTATATTTGTAGGCGTCAATATAACCTTCTTCCCACAACACTTTCTAGGACTATCTGGCATGCCTCGACGATACTCCGACTACCCAGATGCATACACAATATGAAATACTATCTCATCAATAGGCTCATTCATTTCCCTAACAGCAGTTATACTAATAGTTTTCATCATCTGAGAAGCATTTGCATCTAAACGAGAAGTCTTGACTGTAGACTTAACCACGACAAATCTAGAATGATTAAACGGATGCCCTCCACCATATCACACATTTGAAGAACCCACCTATGTTAACCTAAAATAA；
第二种的COI序列(SEQ ID NO:9)如下：
AATAGACGTAGATACCCGAGCATACTTTACATCTGCTACAATAATCATTGCTATTCCCACTGGAGTAAAAGTATTTAGTTGATTAGCTACCCTGCACGGCGGCAATATTAAATGATCACCCGCAATACTATGAGCTCTGGGCTTCATCTTCCTATTCACCGTAGGAGGTCTAACGGGCATTGTACTAGCTAATTCCTCCCTAGACATTGTATTACATGATACATATTATGTAGTCGCACACTTCCACTATGTCTTATCTATAGGAGCAGTGTTCGCCATTATAGGGGGCTTTGTTCACTGATTCCCCCTATTCTCCGGGTACACACTCAACCAAGCATGAGCAAAAATTCACTTTGTAATCATATTCGTAGGAGTAAATATAACATTCTTTCCACAACACTTTCTAGGACTATCCGGAATACCTCGACGATACTCCGATTATCCTGACGCATACACAGCATGAAATACTATTTCCTCAATAGGCTCATTCATCTCACTAACAGCAGTGATATTAATAATCTTCATTATCTGAGAAGCATTCGCATCAAAACGAGAAGTATCTGCAGTAGAACTGACAAGCACAAACCTAGAATGACTACACGGATGTCCTCCTCCCTATCACACATTTGAAGAACCAACATATATCAACCTAAAATAA；
鉴定结果该两种肉干分别来源于水牛、瑞典野猪(与已知取样对象一致，验证了本发明方法的准确性)。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)提取待测肉制品的基因组DNA；
(2)设计并合成COI通用引物序列，其中，正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；
(3)采用步骤(2)中所述的正向引物和反向引物，以步骤(1)中所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行纯化；
(4)对步骤(3)中纯化后PCR产物进行定量，并等量混样，构建标准文库，然后进行高通量测序；
(5)根据步骤(4)中测序的结果，得到待测肉制品的COI序列信息，由此得出待测肉制品的材料来源。
2.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的5’端连接7碱基条形码，得到条形码通用引物，用于所述PCR扩增反应。
3.根据权利要求2所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述7碱基条形码的序列为ACACAGT或CAGAGTC。
4.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(3)中进行PCR扩增的反应体系组成为：基因组DNA模板2μl、5U/ul的Q5聚合酶0.25μl、Q5 Reaction Buffer(5×)、Q5 GC high Enhancer(5×)、2.5μM dNTP 2μl、10μM的正向引物1μl、10μM的反向引物1μl，加ddH2O至25μl。
5.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(3)中进行PCR扩增的反应程序为：98℃预变性30s，然后以98℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s为一个循环，进行27个循环，最后72℃延伸5min，4℃至无穷。
6.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。
7.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用美国Biotek FLX800荧光分析仪进行定量。
8.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用Illumina文库构建试剂盒进行标准文库的构建。
9.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。
10.根据权利要求1所述的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，其特征在于，述步骤(5)中根据待测肉制品的COI序列信息得出待测肉制品的材料来源的方法是：将待测肉制品的COI序列信息，与已知物种的COI基因序列进行比对，从而得出待测肉制品的材料来源。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255880A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 万超 一种海胆物种特异性检测引物及应用
CN106048034A (zh) * 2016-07-01 2016-10-26 北京市食品安全监控和风险评估中心 基于pcr‑rlfp‑dhplc技术扫描分析食品中动物源性成份组成
CN106811534A (zh) * 2017-03-08 2017-06-09 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒
CN106834461A (zh) * 2017-01-22 2017-06-13 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104032004A (zh) * 2014-06-12 2014-09-10 北方民族大学 一种清真肉类食品的分子鉴定方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104032004A (zh) * 2014-06-12 2014-09-10 北方民族大学 一种清真肉类食品的分子鉴定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GELLER ET AL.: "Redesign of PCR primers for mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I for marine invertebrates and application in all-taxa biotic surveys.", 《MOLECULAR ECOLOGY RESOURCES》 *
LERAY ET AL.: "A new versatile primer set targeting a short fragment of the mitochondrial COI region for metabarcoding metazoan diversity: application for characterizing coral reef fish gut contents.", 《FRONTIERS IN ZOOLOGY》 *
翟正晓: "基于RAD简化基因组测序技术的13种中国地方优良鸡品种 SNPs 多态性图谱构建及群体遗传学分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
邱德义等: "DNA条形码技术在肉品防欺诈鉴别中的应用", 《肉类研究》 *
马兰: "DNA微型条形码和复合条形码研究进展", 《农业灾害研究》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255880A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 万超 一种海胆物种特异性检测引物及应用
CN106048034A (zh) * 2016-07-01 2016-10-26 北京市食品安全监控和风险评估中心 基于pcr‑rlfp‑dhplc技术扫描分析食品中动物源性成份组成
CN106834461A (zh) * 2017-01-22 2017-06-13 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法
CN106834461B (zh) * 2017-01-22 2021-01-15 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法
CN106811534A (zh) * 2017-03-08 2017-06-09 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒
CN106811534B (zh) * 2017-03-08 2020-04-28 中山海关技术中心 一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒

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