CN110305974A - 基于检测五个snp位点区分常见小鼠近交系的pcr分析引物及其分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的PCR分析引物及其分析方法，旨在提供一种稳定、快速、高效检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的引物及其方法；其SNP1检测引物为P1、P2和P3，核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示；SNP2检测引物为P4、P5和P6，核苷酸序列如SEQ ID NO：4‑6所示；SNP3检测引物为P7、P8和P9，核苷酸序列如SEQ ID NO：7‑9所示；SNP4检测引物为P10、P11和P12，核苷酸序列如SEQ ID NO：10‑12所示；SNP5检测引物为P13、P14和P15，核苷酸序列如SEQ ID NO：13‑15所示；属于实验动物的遗传检测领域。
Description
技术领域
本发明属于实验动物的遗传检测领域，具体涉及一种基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的PCR分析引物，本发明还涉及基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的PCR分析方法。
背景技术
近交系小鼠具有同基因性、长期遗传稳定性、均一性、个体性、背景资料和数据较完善等特点，是近代医学和生物学实验中应用最为广泛的实验动物之一，其遗传质量直接影响到动物实验的准确性、重复性和科学性。定期对其进行遗传监测是保证其遗传质量的重要措施，国家实验动物管理条例也规定每年至少要对近交系动物监测一次。
传统的小鼠遗传检测方法有形态学方法(毛色基因测试法、下领骨测试法)，免疫学方法(皮肤移植法、混合淋巴细胞培养发、肿瘤移植法、血清反应法等)，统计学方法(监测生长发育、繁殖等数量性状)，生物化学方法(监测生化基因标记)和细胞遗传学方法(监测染色体带型)。随着一系列分子遗传标记的发现，产生了分子生物学检测方法，应用于实验动物遗传检测，主要基于限制性片段长度多态性(Restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)、随机引物多态性(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、微卫星(Microsatellite)和DNA指纹(DNA Fingerprints)等。尽管这些方法各有特点优势，但是由于有的操作复杂，成本高昂，不适合大规模基因研究，未能得到推广应用。
近年来，第三代分子标记SNP(single nucleotide polymorphism)技术也被用于近交系小鼠遗传质量检测。与传统的遗传检测方法相比，SNP检测方法具有以下优点：①对于生物化学法和免疫学方法很难鉴别的一些同基因型和同源品系也能鉴别；②SNP方法准备工作简单容易、快速；③与SSLP(Simple sequence length polymorphism)检测方法相比，SNP方法速度快，效率高，同时可以检测多个动物和多个位点；④不需处死动物，所有基因纯度在他们产生下一代之前就可以得到保证；⑤SNP检测法能实现高通量、自动化和低成本，满足开展大规模检测的要求。
近年来随着小鼠数据库的建立，SNP技术也被用于近交系小鼠遗传质量检测，如动态两管等位基因特异PCR、TaqMan、Invader、Amplifuor、单管双向等位基因专一性扩增(single-tube bi-directional allele specific amplification，SB-ASA)等，这些新方法虽各具优点，但都只能对单一SNP位点进行检测，费时费力，较难实现对大量样本的快速检测，从而制约了这些技术的广泛应用。这些新方法虽各具优点，但稳定性不足，成本也相对较高。
现基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)，建立了一个稳定、快速、高效的SNP检测平台，实现对近交系小鼠品系的快速鉴定，以满足不断发展的生命科学对其遗传品质越来越高的要求。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种能快速鉴定近交系小鼠品系的引物。
本发明的第二个目的是提供一种了稳定、快速、高效检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的方法。
为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的PCR分析引物，所述五个位点对应的SNP ID为依次如下：SNP1对应的SNP ID为AF067836_350A_1；SNP2对应的SNP ID为M22381_169_2；SNP3对应的SNP ID为M-02187_2；SNP4对应的SNP ID为M-05537_1；SNP5对应的SNP ID为的SNP ID为M-04659_1；每个位点对应的引物核苷酸序列如下所示：
SNP1检测引物为P1、P2和P3，引物P1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物P2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物P3核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
SNP2检测引物为P4、P5和P6，引物P4核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物P5SEQID NO：5所示，引物P6核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
SNP3检测引物为P7、P8和P9，引物P7核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，引物P8核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物P9核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示
SNP4检测引物为P10、P11和P12，引物P10核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，引物P11核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，引物P12核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
SNP5检测引物为P13、P14和P15，引物P13核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，引物P14核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，引物P15核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
本发明提供的第二个技术方案是这样的：
一种基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，依次包括下述步骤：
1)提取不同品系的小鼠基因组；
2)以步骤1)提取的小鼠基因组为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
3)对步骤2)扩增后PCR产物读取反应后荧光，进行SNP分型。
进一步的，上述的基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，步骤2)所述的PCR扩增方法为：针对每个SNP位点，分别配置PCR扩增的反应体系，并于ABI7500上读取反应前荧光；然后按照如下条件进行扩增：
1)94℃，15分钟，循环1次；
2)94℃，20秒，61-55℃，60秒，每次循环降落0.6℃，循环10次；
3)94℃，20秒，55℃，60秒，循环26次；
4)94℃，20秒，57℃，60秒，循环12-18次。
进一步的，上述的基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，所述的PCR扩增的反应体系为：96孔板，10μL体系，其中5μL DNA，5μL KASP master mix，0.14μL对应引物。
进一步的，上述的基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，步骤1)中提取不同品系的小鼠基因组的方法是搜集不同品系的鼠尾，用天根的组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组。
本发明的有益效果是：
1)本发明提供的技术方案选了5个区分度较高的SNP位点，速对5个小鼠SNP位点进行检测足以区分国内常见的小鼠近交系；
2)本发明方法准确性好，仅需提供鼠尾类似的少量样品，对实验设备要求不高，无需测序，操作简单，重复性好，快速稳定，可大大降低检测成本。
附图说明
图1是SNP1的分型图；
X表示阴性对照，方形表示Aelle1(Y)，圆表示Aelle2(X)；
图2是SNP2的分型图；
X表示阴性对照，方形表示Aelle1(Y)，圆表示Aelle2(X)；
图3是SNP3的分型图；
X表示阴性对照，方形表示Aelle1(Y)，圆表示Aelle2(X)；
图4是SNP4的分型图；
X表示阴性对照，方形表示Aelle1(Y)，圆表示Aelle2(X)；
图5是SNP5的分型图；
X表示阴性对照，方形表示Aelle1(Y)，圆表示Aelle2(X)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 引物设计
本申请所述的五个位点对应的SNP ID为依次如下：SNP1对应的SNP ID为AF067836_350A_1；SNP2对应的SNP ID为M22381_169_2；SNP3对应的SNP ID为M-02187_2；SNP4对应的SNP ID为M-05537_1；SNP5对应的SNP ID为的SNP ID为M-04659_1；
经过对所设计的大量引物进行筛选后，其筛选方法是针对SNP位点上下50bp的序列，在正义链或反义链上选择位点，两条上游引物最末一个碱基不同，且5’端分别连接两种通用的接头序列，用以区分不同的等位基因。下游引物为常规引物，无需修饰。若该组引物在进行分型检测时，能较好的聚类分区，且分型正确，说明该组引物符合要求，发现引物组1(P1、P2、P3)、引物组2(P4、P5、P6)、引物组3(P7、P8、P9)、引物组4(P10、P11、P12)、引物组5(P13、P14、P15)依次对SNP1至SNP5五个SNP位点分型效果最佳，其中，五个位点对应的SNPID为依次如下：SNP1对应的SNP ID为AF067836_350A_1；SNP2对应的SNP ID为M22381_169_2；SNP3对应的SNP ID为M-02187_2；SNP4对应的SNP ID为M-05537_1；SNP5对应的SNP ID为的SNP ID为M-04659_1；
SNP1检测引物为P1、P2和P3，引物P1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物P2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物P3核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
SNP2检测引物为P4、P5和P6，引物P4核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物P5SEQID NO：5所示，引物P6核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
SNP3检测引物为P7、P8和P9，引物P7核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，引物P8核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物P9核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示
SNP4检测引物为P10、P11和P12，引物P10核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，引物P11核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，引物P12核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
SNP5检测引物为P13、P14和P15，引物P13核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，引物P14核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，引物P15核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
其核苷酸序列如下所示。
SNP1检测引物：
引物P1(SEQ ID NO：1)：
AAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGAAGGGAGTCAGCTCTGA
引物P2(SEQ ID NO：2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGAAGGGAGTCAGCTCTGT
引物P3(SEQ ID NO：3)：
AAAATCAAGATCCAGATGCGAGG
SNP2检测引物：
引物P4(SEQ ID NO：4)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAGAATGTCAAGCCAGCTC
引物P5(SEQ ID NO：5)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAGAATGTCAAGCCAGCTT
引物P6(SEQ ID NO：6)：
TGTTACTCTCCTCGGTGCACTGG
SNP3检测引物：
引物P7(SEQ ID NO：7)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCTATATTTACATGAGAATC
引物P8(SEQ ID NO：8)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCTATATTTACATGAGAATA
引物P9(SEQ ID NO：9)：
GGTAAGGGATAACTGTGGGGA
SNP4检测引物：
引物P10(SEQ ID NO：10)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGACAATCAGGTAGACCATA
引物P11(SEQ ID NO：11)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGACAATCAGGTAGACCATG
引物P12(SEQ ID NO：12)：
GGATGTGATACAAGTGCCCGT
SNP5检测引物：
引物P13(SEQ ID NO：13)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGTTTCAGGTACCTCACA
引物P14(SEQ ID NO：14)：
AAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGTTTCAGGTACCTCACG
引物P15(SEQ ID NO：15)：
GAGGGTGGAGACCGGAGATTT
实施例2 一种基于检测5个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法的建立
(1)基因组的提取
搜集不同品系的鼠尾，用天根的组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组。
(2)PCR扩增
用实施例1所述的引物组分别对对步骤1)提取的小鼠基因组分别进行KASP扩增。
其扩增条件：
96孔板，10μL体系，其中5μLDNA，5μLKASPmastermix，0.14μL引物组1或引物组2或引物组3或引物组4或引物组5；配好后反应体系后先于ABI7500上读取反应前荧光，然后按如下反应条件进行PCR反应。
反应条件：
上述的PCR产物在低于40℃条件下，用ABI7500或其他可收集FRET荧光的设备读取反应后荧光，然后进行SNP分型。
需要说明的是，在扩增过程中确保每个品系的鼠尾分别与含引物组1或引物组2或引物组3或引物组4或引物组5的扩增体系进行扩增。
分型判定标准如下表：
该方法利用了通用荧光探针，采用了touch-downPCR方法，确保了不同引物组在相同的标准程序下，都可以进行有效扩增。随着PCR循环数增加，扩增呈指数增长，对应的荧光探针不断地退火结合到新合成的互补链上，发出荧光，不同颜色的荧光，代表不同的SNP分型。
以C57BL/6J小鼠为例，在SNP1分型时聚在Alle2的区域内，表示其等位基因为T；依次地，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5分别聚在Alle2、Alle1、Alle1、Alle1，表示其对应的碱基分别为T、G、A、A。反推回去，若5个位点检测结果依次为T、T、G、A、A，结合来源和表型，也可以判定其为C57BL/6J小鼠。
实施例3 代表性临床样品的检测
从北京、天津和广州三地搜集的14个样品(含13个品系)的近交系小鼠组织样品，用天根的组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组。
采用上述基于检测5个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法方法进行检测，结果如图1-5所示，可见本发明建立的方法能够准确快速地对小鼠品系进行鉴定。该方法利用了通用荧光探针，采用了touch-downPCR方法，确保了不同引物组在相同的标准程序下，都可以进行有效扩增。该方法既有金标Taqman探针法的准确度，又不需要针对每个单独的引物设计荧光探针，大大降低了检测成本。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的PCR分析引物及其分析方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 2
aaggtgacca agttcatgct tagaagggag tcagctctga 40
<210> 2
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat ttagaaggga gtcagctctg t 41
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 3
aaaatcaaga tccagatgcg agg 23
<210> 4
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tagagaatgt caagccagct c 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tagagaatgt caagccagct t 41
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 6
tgttactctc ctcggtgcac tgg 23
<210> 7
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tctctatatt tacatgagaa tc 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tctctatatt tacatgagaa ta 42
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 9
ggtaagggat aactgtgggg a 21
<210> 10
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tctgacaatc aggtagacca ta 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tctgacaatc aggtagacca tg 42
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 12
ggatgtgata caagtgcccg t 21
<210> 13
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tgggtttcag gtacctcaca 40
<210> 14
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 14
aaggtcggag tcaacggatt gggtttcagg tacctcacg 39
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mus)
<400> 15
gagggtggag accggagatt t 21
Claims (5)
1.一种基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的PCR分析引物，所述五个位点对应的SNP ID为依次如下：SNP1对应的SNP ID为AF067836_350A_1；SNP2对应的SNP ID为M22381_169_2；SNP3对应的SNP ID为M-02187_2；SNP4对应的SNP ID为M-05537_1；SNP5对应的SNP ID为的SNP ID为M-04659_1；其特征在于，每个位点对应的引物核苷酸序列如下所示：
SNP1检测引物为P1、P2和P3，引物P1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物P2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物P3核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
SNP2检测引物为P4、P5和P6，引物P4核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物P5SEQ IDNO：5所示，引物P6核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
SNP3检测引物为P7、P8和P9，引物P7核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，引物P8核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物P9核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
SNP4检测引物为P10、P11和P12，引物P10核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，引物P11核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，引物P12核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
SNP5检测引物为P13、P14和P15，引物P13核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，引物P14核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，引物P15核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
2.一种基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)提取不同品系的小鼠基因组；
2)以步骤1)提取的小鼠基因组为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
3)对步骤2)扩增后PCR产物读取反应后荧光，进行SNP分型。
3.根据权利要求2所述的基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，其特征在于，步骤2)所述的PCR扩增方法为：针对每个SNP位点，分别配置PCR扩增的反应体系，并于ABI7500上读取反应前荧光；然后按照如下条件进行扩增：
1)94℃，15分钟，循环1次；
2)94℃，20秒，61-55℃，60秒，每次循环降落0.6℃，循环10次；
3)94℃，20秒，55℃，60秒，循环26次；
4)94℃，20秒，57℃，60秒，循环12-18次。
4.根据权利要求3所述的基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为：96孔板，10μL体系，其中5μL DNA，5μL KASP mastermix，0.14μL对应引物。
5.根据权利要求2所述的基于检测五个SNP位点区分常见小鼠近交系的分析方法，其特征在于，步骤1)中提取不同品系的小鼠基因组的方法是搜集不同品系的鼠尾，用天根的组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组。
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