CN109536624A - 用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法 - Google Patents
用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为一种用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法。该技术是基于半滑舌鳎的Z/W性染色体间DNA序列上的基于单核苷酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphism)位点而开发成功的。分子标记的设计和检测是基于五引物扩增阻碍突变体系(即PARMS，Penta‑primer amplification refractory mutation system)。利用对半滑舌鳎Z/W性染色体DNA序列的生物信息学分析和分子生物学方法成功寻找和确认Z/W性染色体间DNA序列上的SNP多态性位点(命名为SNP_chr_8935925_C_T)，并设计和验证了1组基于PARMS的荧光分子标记。通过对60条性别已知半滑舌鳎鱼样本的高通量qPCR分型实验验证表明该PARMS分子标记可成功鉴定所有样本中的真伪雄鱼。相比于目前鉴定方法和标记，该标记和相应的检测方法在保证准确率的前提下，使操作更快捷，成本更低廉，检出率更高，并可实现高通量检测。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术中的海水鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，是一种基于半滑舌鳎性染色体Z/W之间的SNP位点开发出来的能甄别其性别的共显性高通量荧光分子标记。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是我国海域特有的一种暖温性近海大型底层鱼类，主要分布于以黄海、渤海的沿岸地区。由于半滑舌鳎自然资源量少，味鲜鲜美，口感爽滑，营养丰富，因此具有广阔的养殖前景，是重要的名贵海水养殖鱼类。半滑舌鳎作为比目鱼，雌性个体的生长速率是雄性个体的3倍以上(陈松林等，2013)，而雄鱼具有生长缓慢、个体体型小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，同时使养殖成本增加。半滑舌鳎养成中雄鱼甚至可以达到80％—90％。研究发现在80％—90％比例的雄鱼中有一部分是伪雄鱼。有研究表明半滑舌鳎性别决定机制为性染色体Z和W，其中同型染色体ZZ为遗传雄性个体，异型染色体ZW型为遗传雌性个体(Zhuang et al.,2006；周丽青等,2005)。半滑舌鳎正常雄鱼具有ZZ型的染色体，正常雌鱼具有ZW型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，基因型都是ZW型。但从其体貌特征和生殖器官上均表现为雄性特征，也可以像雄鱼一样产生可育精子和繁育后代。而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父本的特征成为伪雄鱼。这样通过逐代积累，就导致了半滑舌鳎养殖群体中生理雌性的比例的失衡(即雄鱼越来越多，雌鱼越来越少)，从而严重影响半滑舌鳎养殖产量。因此，对快速鉴定半滑舌鳎性别尤其是真伪雄鱼甄别的高效分子标记和检测方法的开发，对其遗传性别鉴定及生产养殖，具有重要的科学意义和应用价值。
在半滑舌鳎性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定方面，前人通过AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记(Chen et al.，2007)，由于AFLP标记是显性遗传，应用中不能区分ZW雌性和WW超雌个体，难以避免假阴性的结果，从而对ZZ雄鱼和ZW雌鱼产生误判。通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星scaffold68-2标记筛选(刘洋等，2014)，可针对共显性性别特异标记位点设计引物对半滑舌鳎遗传性别进行鉴定，但实际应用中微卫星内INDEL短(小于50bp)，导致来自Z染色体和W染色体的两种PCR扩增产物片段长度差异较小，对在凝胶电泳判定其长短时造成不小的困难。同时该技术检测中需用浓度为4％的琼脂糖凝胶以助于区分小的长度差异的条带(如小于50bp)，而高浓度的琼脂糖又不易配制、电泳用时长、费用高等问题，这都进一步限制了该方法的推广。
因此，发明一种基于SNP的共显性能甄别半滑舌鳎性别包括真伪雄鱼的荧光分子标记来解决上述问题尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法，利用半滑舌鳎性别特异性SNP位点分型，来解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，包括以下步骤：
步骤一：下载已公开无知识产权的公用ZW染色体基因组序列；
步骤二：在寻找到的ZW染色体同源等位基因序列进行比对分析，筛选出能区分ZW性染色体的候选SNP位点；
步骤三：基于上述筛选的SNP位点SNP_chr_8935925_C_T，设计出一组可用于半滑舌鳎性别鉴定的PARMS荧光标记引物；引物序列如下表：
| 8935925_PF_C | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGGTCAGCTCTCTCAGATACA<u>c</u> |
| 8935925_PF_T | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGGTCAGCTCTCTCAGATACA<u>t</u> |
| 8935925_PR | AGTCAGGCCTGGGTTTATTTTCTC |
注：FAM:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT HEX:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT
步骤四：利用酚氯仿提取法从半滑舌鳎鱼鳍组织提取基因组DNA；
步骤五：利用实时定量PCR(qPCR)进行分型实验，验证PARMS荧光标记是否可鉴定出雌雄半滑舌鳎。
本发明的技术效果和优点：本发明基于发现的半滑舌鳎ZW性染色体间的SNP位点，只需通过qPCR分型实验即可实现雌雄性别鉴定。该方法只需5ul反应体系即可实现自动分型并鉴定出雌雄。相比于目前鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，该方法在保证准确率的前提下，操作更快捷，成本更低廉，检测通量更高，一次反应可检测上百个样本。
附图说明
图1：对样本1-30号半滑舌鳎鱼的SNP_chr_8935925_C_T位点PARMS荧光标记qPCR分型结果示图，蓝色点为纯合子ZZ雄性个体×30(每个样本3个重复)；绿色点为杂合子ZW雌性个体×30(每个样本3个重复)。
图2：对样本31-60号半滑舌鳎鱼的SNP_chr_8935925_C_T位点PARMS荧光标记qPCR分型结果示图，蓝色点为纯合子ZZ雄性个体×30(每个样本3个重复)；绿色点为杂合子ZW雌性个体×30(每个样本3个重复)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创新性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
本发明所用基因组序列来源于已公开发表无产权保护的中国水产科学研究院黄海水产研究所水产基因组与细胞工程研究室完成的半滑舌鳎全基因组测序数据。
本发明提供了一种用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法，包括以下步骤：
步骤一：选定ZW染色体同源等位基因序列和寻找候选SNP位点；
步骤二：结合Primer3Plus在线引物设计软件设计出能扩增含候选SNP位点的等位基因序列的引物对；
步骤三：将第二步扩增出的PCR产物送一代测序，通过对一代测序结果确定性别特异性SNP位点SNP_chr_8935925_C_T。
步骤四：基于第三步所验证的SNP位点SNP_chr_8935925_C_T，结合Primer3Plus在线引物设计软件设计出一组可用于半滑舌鳎性别鉴定的PARMS荧光标记引物(每个PARMS标记含3条引物；武汉景肽生物科技有限公司)。PARMS荧光标记引物如下表：
| 8935925_PF_C | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGGTCAGCTCTCTCAGATACA<u>c</u> |
| 8935925_PF_T | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGGTCAGCTCTCTCAGATACA<u>t</u> |
| 8935925_PR | AGTCAGGCCTGGGTTTATTTTCTC |
注：FAM:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT HEX:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT
步骤五：利用酚-氯仿提取法从60条已知遗传性别的半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA。
步骤六：配置10×PARMS引物母液，按照200个反应需求配置：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 引物8935925_PF_C(10μM) | 15 |
| 引物8935925_PF_T(10μM) | 15 |
| 8935925_PR(10μM) | 40 |
| ddH<sub>2</sub>O | 30 |
| 总体积 | 100 |
步骤七：使用5μl的PARMS Touchdown PCR反应体系和ABI Q6平台及自带分析软件进行自动分型。
| 试剂/样品 | 用量 |
| 2×PARMS Master Mix(武汉景肽生物) | 2.5μl |
| 10×PARMS引物母液 | 0.5μl |
| DNA template(50ng) | 补水至5μl |
| 单个反应总体积 | 5μl |
qPCR PARMS TouchDown PCR反应程序：
步骤1：94℃3min，步骤2：94℃20s，步骤3：65℃(-0.8℃每循环)1min，步骤4：回第2步，10个循环，步骤5：94℃20s，步骤6：57℃1min，步骤8：回第5步，30个循环。
步骤八：通过qPCR自动分型结果判断半滑舌鳎性别。
表1：60条半滑舌鳎SNP_chr_8935925_C_T位点PARMS标记鉴定结果。以半滑舌鳎形态学和目前广泛使用的SSR标记性别鉴定结果为比照，确定本技术一次性鉴定的检出率和准确度。
序列表
<110> 天津渤海水产研究所
安徽微分基因科技有限公司
<120> 用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgaggtcagc tctctcagat acac 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tgaggtcagc tctctcagat acat 44
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtcaggcct gggtttattt tctc 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 荧光探针(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 荧光探针(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
Claims (2)
1.一种能甄别半滑舌鳎真伪雄鱼的高通量荧光分子标记，其特征在于，在半滑舌鳎ZW性染色体DNA序列中筛选出性别特异性SNP位点SNP_chr_8935925_C_T：GAGGTCAGCTCTCTCAGATACA[C/T],其中C为雌鱼特异性变异；C/T基因型为雌鱼或伪雄鱼，T/T基因型为真雄鱼。
2.根据权利要求1一种基于半滑舌鳎性别特异性SNP位点的PARMS荧光分子标记，其特征在于：所述PARMS荧光标记引物序列为：
8935925_PF_C取GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGGTCAGCTCTCTCAGATACAc；
8935925_PF_T取GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGGTCAGCTCTCTCAGATACAt；
8935925_PR取AGTCAGGCCTGGGTTTATTTTCTC；
其中，8935925_PR_C连接FAM荧光基团，记为：FAM:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；8935925_PR_G连接HEX荧光基团，记为HEX:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
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