CN113637764A - 一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。本发明根据基因型与表现型间关系鉴定出与体色控制关联的微卫星标记，筛选亲本的基因型，以建立保证红罗非鱼体色稳定遗传的科学方法，保证亲本性状优良，从而保证体色稳定遗传，提高育种效率。

Description

一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体地，涉及一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引 物及其应用。

背景技术

罗非鱼作为世界上第二大养殖的淡水鱼类，也是全世界农业和经济上重要的水生鱼类。 红罗非鱼(Oreochromisniloticus)作为罗非鱼的主要养殖品种之一，它是由尼罗罗非鱼和莫 桑比克罗非鱼杂交得到的突变种，属丽鱼科(Cichlidae)，罗非鱼属(Tilapia)，学名Red Tilapia。红罗非鱼身体呈红色，体腔无黑膜，形似真鲷，生长速度快，产量高。

一般市场上罗非鱼以黑色为主，但艳丽的颜色往往更能吸引消费者，因此红罗非鱼的 价格更高，成为养殖罗非鱼的重要经济性状。红罗非鱼体色较为丰富，据研究报道目前主 要存在深红色，橙色，金色，粉红色，粉白色等。类胡萝卜素能让红罗非鱼体色鲜艳，但鱼类本身无法合成。为了获得体色纯正的红罗非鱼，在生产过程当中，通常在饲料中添加增色剂是较为普遍的人工增色办法。往饲料中添加类胡萝卜素，虾青素等物质，往往能够极大促进鱼类体色鲜艳。锦鲤养殖中，在基础饲料中添加虾青素，叶黄素等物质能够显著影响锦鲤的生长、体色、抗氧化能力等，但这往往极大的增加了生产成本，且添加增色剂 并不能从根本解决问题，无法稳定遗传。

然而，罗非鱼体色易分化为不同的颜色，同时还存在斑点问题，包括红色斑点、斑纹， 黑色斑点、斑纹等，一直是制约红罗非鱼市场发展的重要因素。虽然罗非鱼的颜色可以通 过肉眼直接观察，但是，表型呈红色的罗非鱼，也有可能是携带了黑斑基因等不利基因，其后代就会出现携带黑斑的个体，不符合市场需求。目前市场上红罗非鱼的差别较大，有偏红，有偏白的，只有去除黑斑等不利基因的影响的稳定遗传的红罗非鱼才符合市场需求。

关于红罗非鱼的斑点研究已有不少，与红色斑点显著相关的QTL(数量性状基因座)区 间已被发现位于LG5和15号连锁群上，挖掘到候选基因SLC45A1，ASIP存在调控红斑性 状可能性。同时，黑斑性状近年来一直被广泛研究。黑斑的产生是因为色素沉积，黑色素积累后至体表呈现黑斑性状。在哺乳动物中，黑色素的合成受多种基因，蛋白及转录因子等调控，据Slominki等人的研究，黑皮质激素(MCH)及其受体(Mc1r)在黑色素合成途径 中是正调控因子，另外，络氨酸酶(tyr)，络氨酸酶蛋白1及蛋白2(tyrp1，tyrp2)及其 产物typ1、typ2/DCT被发现了刺激真黑素合成，提高黑色素含量。

获得体色纯正的红罗非鱼是解决当前红罗非鱼生产养殖问题的办法之一。中国专利 “CN200810219394.4遗传雄性红罗非杂种鱼的制种方法”公开了一种遗传雄性红罗非杂种鱼的制种方法，采用红罗非鱼雌鱼与YY型超雄尼罗罗非鱼进行杂交繁殖。但是其限制 了雌鱼的来源，不利于广泛应用。通过红罗非鱼与吉富罗非鱼杂交获得体色分离的后代， 对于研究红罗非鱼颜色具有重要帮助。但是，传统的杂交育种获取的纯红罗非鱼存在周期长，投入成本大等缺陷，另外红罗非鱼体色极易退化，受环境因素影响大，很难稳定遗传。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种罗非鱼体色相关的微卫星的 检测引物及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物。

本发明的第二个目的是提供所述的检测引物在鉴定罗非鱼体色相关的微卫星中的应 用。

本发明的第三个目的是提供所述的检测引物在制备鉴定罗非鱼体色相关的微卫星的 试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种检测罗非鱼体色相关的微卫星的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供所述引物和/或所述的试剂盒在罗非鱼分子育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明通过ddRAD-seq测序技术，结合全基因组关联分析(GWAS)获得与体色相关的QTL区间，在QTL区间内开发微卫星分子标记，通过微卫星分子标记从遗传上鉴定其 体色遗传方式。通过ddRAD-seq测序技术辅助筛选罗非鱼体色控制微卫星标记的方法， 快速鉴定体色，辅助选择体色纯正个体，获得体色纯正个体。

因此本发明要求保护一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

SSR-BC-1-F(SEQ ID NO:1)：5’-ATGTGAAGGAAGGCAAGCAT-3’；

SSR-BC-1-R(SEQ ID NO:2)：5’-ACAGCTTTTAGGAAGGTCATGG-3’。

本发明还要求保护所述的检测引物在鉴定罗非鱼体色相关的微卫星中的应用。

以及，所述的检测引物在制备鉴定罗非鱼体色相关的微卫星的试剂盒中的应用。

优选地，所述体色相关为表型为红色。

本发明还要求一种检测罗非鱼体色相关的微卫星的试剂盒，包括所述的检测引物。

优选地，还含有PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

本发明还要求保护所述的试剂盒在鉴定罗非鱼体色相关的微卫星中的应用。

所述引物和/或所述的试剂盒在罗非鱼分子育种中的应用，在红色罗非鱼分子育种中 的应用，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明根据基因型与表现型间关系鉴定出与体色控制关联的微卫星标记，筛选亲本的 基因型，以建立保证红罗非鱼体色稳定遗传的科学方法，保证亲本性状优良，从而保证体 色稳定遗传，提高育种效率。

附图说明

图1为杂交的F1代全同胞家系的体色进行评价结果。

图2为ddRAD技术鉴定并用MLM模型和主成分分析绘制GWAS分析中p值的QQ 图。

图3为采用GWAS方法鉴定红罗非鱼与尼罗罗非鱼杂交F1代全基因组显著性QTL 区间及位点。

图4为使用微卫星标记SSR-bc-1筛选鉴定红罗非鱼与尼罗罗非鱼杂交F1代基因型示 意图。

图5为养殖尼罗罗非鱼群体验证微卫星标记SSR-bc-1示意图。

图6为养殖红罗非鱼群体验证微卫星标记SSR-bc-1示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用 于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说 明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。

实施例1杂交全同胞家系的建立及全基因组关联分析

一、实验方法

1、红罗非鱼体色分化基因池构建

选择体色纯正，无斑点且生长速度快的红罗非鱼为父本，选择性状优良的吉富罗非鱼 为母本，构建杂交全同胞家系。

待F1代鱼生长至性腺发育成熟(约5个月)后，通过图像采集设备对其体色进行摄影记录，并通过人工分辨其外生殖器进行表型性别鉴定，并记录性别、体重、体长、体宽， 以判断日龄。将所有FI代个体置于同一光线条件下，并在同一背景板下进行摄影记录。 根据最后的照片来对体色性状进行评价，建立颜色评价机制。根据罗非鱼形态将红罗非鱼 全身分为鳍条(pf,df,vf,af,utf,mtf,ltf)，头(he)，身躯(bal,bar,bml,bmr,bel,ber)， 其中头部，身躯左右两边存在颜色差异，故分开评价，总共21块区域，根据区域有无黑 色斑点进行评价。每个区块有斑点则记作1，无斑点则记作0，以此来累计评分。

剪取亲本和子一代(共112尾鱼)的鳍条样品保存于无水乙醇中，放入-20℃保存备用。同时，在每条鱼背部注射动物电子标签，记录个体身份信息，用于进一步追踪个体的 体色分化及生长发育情况。

2、罗非鱼DNA文库的构建。

利用基因组DNA提取试剂盒提取所有取样个体基因组DNA，利用琼脂糖凝胶检测所有个体DNA质量，并利用Qubit 3.0检测DNA浓度，保证用于构建基因文库的DNA质 量与浓度达标。采取ddRADseq构建文库，即利用EcoR1和Msp1两种常见的限制性内切 酶进行双酶切，得到限制性酶切片段，后根据方法中提供的接头序列利用T4连接酶进行 连接后，得到两端是接头，中间是限制性内切酶片段的序列对。再之后进行PCR扩增， 根据方法中提供的PCR引物分别使用，确保能区分每个个体。对PCR扩增后的产物采用 磁珠法进行纯化，对纯化DNA目的片段采用低熔点琼脂糖凝胶电泳进行片段分布，检查 和质量检测，观察到一条弥散的条带，并且片段主要集中在280～480bp之间即可，然后 对PCR扩增产物采用磁珠法纯化，后使用Qubit 3.0对其进行浓度测定后等量混合成一个 DNA文库，然后将DNA文库进行琼脂糖凝胶电泳分离回收得到目标DNA片段，将最终 得到的DNA片段进行高通量测序。

3、混合DNA文库的高通量测序。

采用Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM进行高通量测序得到原始测序序列，即rawdata， 以FASTQ(简称fq)文件格式存储。对数据进行过滤，去掉低质量的reads，去掉包含接头的reads，去掉包含过多的N的的reads，得到clean data。

4、SNP的获取与过滤。

SNP是单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。首先识别罗非鱼全基因组的SNP，然后再和体色关联起来分析，找到与体色 最相关的SNP位点，通常就认为这个SNP位点附近一点存在调控体色的基因或者其它调控原件。虽然SNP不是属于微卫星一种，而是微卫星标记是根据SNP位置开发的。

对于杂交获得全同胞家系测序的clean data，利用bowtie2生物信息学软件与已经在 NCBI上公布的罗非鱼基因组进行比对，然后使用samtools，bcftools生信软件进行分析， 获得SNP位点。然后对获得的SNP进行进一步过滤，过滤掉个体测序深度小于10，总深度小于1000的个体。并删除群体中最小等位基因频率小于0.2，缺失率大于2.5％的SNP。。

五、全同胞家系全基因组关联分析

使用TASSEL软件将杂交F1代体色性状与分析获得的罗非鱼基因组中每个SNP进行关联分析。

首先运行一个等位基因共享系数矩阵(K)，以检测群体中可能的家系情况以及SNP的主成分分析。主成分分析的主成分数量是由QQ plot的分布，以及满足使基因组膨胀因子(λ)值最接近1.00来决定的。基因组膨胀因子λ值是基于p值得为经验观察到的检 验统计分布与预期中位数的中值之比，将会因膨胀导致的结果的假阳性率进行量化。理想 化的p值膨胀系数为1，而往往实际的膨胀因子会偏离1，当实际膨胀因子越偏离1，说 明存在群体分层的现象越严重，容易有假阳性结果，需要重新矫正群体分层。

使用QQ图来评估它们与性状相关的SNP的预期分布偏差，再使用TASSEL软件中 的混合线性模型(MLM)对体色性状进行了分析。使用R函数对关联数据和QQ图的曼 哈顿图进行了曼哈顿图。应用Bonferroni方法调整多个SNP位点。全基因组范围内的显着 SNP定义为原始p值<0.05/n，此研究中设定的SNP数量为n。

二、实验结果

根据建立的颜色评价机制，对杂交的F1代全同胞家系的体色进行评价，结果如图1所示，其中得分最低个体为1分，通体几乎没有黑色分布，得分最高个体为20分，通体 都是黑色。另外，我们通过GWAS分析获得QQ plot(图2)、Manhattan图(图3)以及 定位位于同一染色体(LG3)体色控制QTL区域。

实施例2样本的DNA和体色的采集

一、实验方法

基于已有分析出罗非鱼全基因组微卫星序列，与ddRAD测序技术和GWAS分析所定位出位于LG3上的体色控制QTL区域基因组序列结合分析，在SNP峰值附近开发微卫星 标记，共设计10对微卫星引物，选取实施例1中的体色得分最高与体色得分最低的极端 个体各6个检验微卫星分子标记，标记引物均由艾基生物(广州)贸易有限公司合成。其 中10对微卫星引物如表1所示。

表1：

PCR反应的反应体系为：2×PCR DS Mix 10μL，上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，补充水5μL至总体积20μL。

PCR反应的反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30sec，退火55.8℃40sec， 延伸72℃30sec，循环数为35，72℃延伸10min。

取扩增产物3μL进行通过8％PAGE胶(聚丙烯酰胺凝胶)电泳及银染显色对PCR 产物进行基因分型检测，银染显色拍照对PCR产物进行基因分型。其中聚丙烯酰胺凝胶 电泳和银染检测实物步骤如下：

1)制胶

取纯水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％) 280μL，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入 梳子，静置半小时，待其凝固。

2)电泳

待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次进行点样，每孔3μL； 盖好上盖，将电压调到200V，电泳10分钟后，将电压调到600V，继续电泳1.5小时。

3)银染

电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将 凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500mL的染色液 (1‰AgNO3)，染色约5分钟后将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5-10秒，倒掉纯水， 加入显色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4mL甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入 冰中预冷)，显色约10～15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min， 观察条带并拍照。

二、实验结果

通过银染胶图结果显示，不同基因型会扩增出不同大小的片段，在聚丙烯酰胺凝胶上 移动速度不同，最后呈现出不同的位置。开发的位于LG3上的10个微卫星标记中，只有微卫星标记SSR-BC-1与体色控制连锁，条带存在多态性，其中目的产物在大小170bp附 近，红色表型的罗非鱼会有两个条带，其中片段较小的条带为特异性条带，将此特异性条 带定义为c带，在图4中已经标识出来；而黑色表型的罗非鱼在170bp附近位置只有一条 带，将此条带定义为b带。所以表型为黑色个体其基因型为bb型，表型为红色个体其基 因型bc型(图4所示)。

实施例3一种鉴定罗非鱼体色的方法

一、提取样本DNA

利用基因组DNA提取试剂盒提取样本个体基因组DNA。

二、PCR反应

PCR反应的引物为：

SSR-BC-1-F(SEQ ID NO:1)：5’-ATGTGAAGGAAGGCAAGCAT-3’；

SSR-BC-1-R(SEQ ID NO:2)：5’-ACAGCTTTTAGGAAGGTCATGG-3’。

PCR反应的反应体系为：2×PCR DS Mix 10μL，上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，补充水5μL至总体积20μL。

PCR反应的反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30sec，退火55.8℃40sec， 延伸72℃30sec，循环数为35，72℃延伸10min。

三、PAGE胶(聚丙烯酰胺凝胶)电泳

1)制胶

取纯水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％) 280μL，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插 入梳子，静置半小时，待其凝固。

2)电泳

待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次进行点样，每孔3μL；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10分钟后，将电压调到600V，继续电泳1.5小 时。

四、银染显色

电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将 凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500mL的染色液(1‰AgNO₃)，染色约5分钟后将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5～10秒，倒掉纯水，加入 显色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4mL甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入冰中 预冷)，显色约10～15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察 条带并拍照。

五、结果判定

根据银染结果进行判断，当目的产物在大小170bp附近有两个条带，则说明样本带有 红色基因；当目的产物在大小170bp附近只有一个条带，则说明样本不带有红色基因。

实施例4一种鉴定罗非鱼体色的试剂盒

一、组成

SEQ ID NO:1～2所示的引物、PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

二、实验方法

同实施例3。

实施例5 F1代个体样本的检测

一、实验方法

使用实施例4的试剂盒对实施例1中的F1代112个体检测。

二、实验结果

结果如下表2显示，对112个个体进行基因型分析，得到基因型为bc个体为49个，基因型为bb个体为63，基本上与表型一致。

表2：

表型	红色表型	黑色表型
			基因型	bc	bb
数量(个)	49	63

实施例6养殖的尼罗罗非鱼群体的检测

一、实验方法

使用实施例4的试剂盒测养殖的表型为黑色的尼罗罗非鱼群体，选取了48尾鱼进行 检测。

二、实验结果

部分结果如图5所示，所有个体基因型均为bb，有效率为100％。

实施例7养殖的红罗非鱼群体的检测

一、实验方法

使用实施例4的试剂盒检测养殖的红罗非鱼群体。

二、实验结果

对于养殖的红罗非鱼群体，选取了30尾鱼进行检测，部分结果如图6所示，发现出现两种新的带型，这代表该群体出现了新的等位基因，其中在原来bc带型下有新的条带d，并其该条带同bc条带不同的是在400～500bp位置没有附属条带，另外在b与c条带之间 出现了新的条带e，并且e条带在400bp附近有附属条带，与bc带型不同。所以，我们认 为该群体出现新的等位基因e和d，其中基因型为bc个体5尾，基因型为be个体8尾， 基因型为bd个体13，基因型为bb个体4尾，其有效率为86.7％。

说明实施例4的试剂盒有效率是高于85％的，能够有效针对排除不利的黑色基因，保 留想要的红色基因。因为群体不同，所以遗传背景不相同，标记的结果也不尽相同，但bb型在多个群体都发现是黑色表型，则证明其和黑色基因相关。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范 围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它 不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神 和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围 之内。

序列表

<110> 中山大学

湖南银鱼农业科技有限公司

<120> 一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgaagga aggcaagcat 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acagctttta ggaaggtcat gg 22

Claims (8)

1.一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1～2所示。

2.权利要求1所述的检测引物在鉴定罗非鱼体色相关的微卫星中的应用。

3.权利要求1所述的检测引物在制备鉴定罗非鱼体色相关的微卫星的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述体色相关为表型为红色。

5.一种检测罗非鱼体色相关的微卫星的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

7.权利要求5或6所述的试剂盒在鉴定罗非鱼体色相关的微卫星中的应用。

8.权利要求1所述引物和/或权利要求5所述的试剂盒在罗非鱼分子育种中的应用，其特征在于，在红色罗非鱼分子育种中的应用。

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