CN106399293A - 一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法 - Google Patents
一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法。本研究通过利用不同剂量雌激素乙烯雌酚(DES)对不同尼罗罗非鱼群体进行了性逆转处理，建立了尼罗罗非鱼伪雌鱼高效诱导方法；进一步应用新开发的性别紧密连锁的微卫星分子标记tlp‑23‑sd及其引物对伪雌鱼进行了鉴定，建立了伪雌鱼微卫星分子标记快速鉴定的方法。本发明诱导伪雌鱼效率高，鉴定快速准确可靠，可用于尼罗罗非鱼伪雌鱼的生产与鉴定。
Description
技术领域
本发明属于水产遗传育种领域，具体涉及一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法。
背景技术
罗非鱼的雌鱼与雄鱼生长存在明显的差异。为了避免过度繁殖，同时利用雄鱼的生长优势，最为实际有效的解决措施是对罗非鱼进行性别控制生产雄性鱼苗，养殖全雄鱼。
在罗非鱼当中存在两套不同的主要性别决定系统，尼罗罗非鱼及莫桑比克罗非鱼等性别主要由LG1和23号连锁群上[6,7]上的XX/XY系统决定，而其他一些如蓝罗非鱼性别主要由LG3上的ZW/ZZ系统决定[2,3]。除了性染色体，常染色体上的小因子也能够影响主要的性别决定系统。然而除此之外，罗非鱼的性别还受到环境中的温度和环境激素的影响。在卵孵化10日后开始的高温处理将导致群体中的雄性比率增高[8]。有研究认为温度对于罗非鱼性别发育的影响可能与表观遗传学上的变化相关，Cyp19a，Foxl2，amh，Sox9a，Sox9b等基因在性别分化和决定中起关键作用[8,9]。雌性激素的使用会导致罗非鱼的雌性化，XY个体性逆转，生理性别表现为雌性，此过程可能与调控cyp19a1b，foxl2，amh，DMRT1等基因的表达相关[11,12]。
为了得到全雄鱼，在生产过程当中，通常使用雄激素处理使雌鱼发育成雄鱼。罗非鱼受精后0-18天是性别分化至关重要的时期。在此时期，胚胎对激素非常敏感[15]。采用口服雄性激素如甲基睾丸酮处理罗非鱼鱼苗，诱导遗传上的雌鱼转换为功能上的雄鱼是雄性罗非鱼生产的主要方式之一。但是近年来研究发现，甲基睾丸酮的后期消解较为缓慢，随着甲基睾丸酮浓度增大，在罗非鱼鱼苗体内残留的时间延长。若无法确保激素在鱼体内全部代谢完，则可能对人体造成危害，存在食品安全问题[17]。与此同时，激素的使用也造成一些环境问题，影响水产品的安全性，造成阴阳鱼和不育雌鱼的产生及形态异常，内分泌紊乱，激素水平改变等负面影响。生产无公害罗非鱼水产品，保障罗非鱼养殖业可持续健康发展的首要条件就是解决罗非鱼养殖的质量控制问题。使用环保安全的方法，生产绿色无公害的水产品有利于我国罗非鱼养殖的良性发展。
培育超雄罗非鱼是解决罗非鱼全雄苗种生产问题的重要途径之一。实验证实尼罗罗非鱼的伪雌鱼(即遗传雄性生理表型为雌性的个体)是可存活的，并且与正常的XX雌性一样是可育的，可以用于全雄鱼的生产。其中，高效诱导伪雌鱼及其快速准确鉴定技术是全雄罗非鱼生产的技术基础。然而，由于鱼类的性染色体构成处于原始状态，所以在形态上难以区分Y和Z，X染色体。由于缺乏准确判断罗非鱼遗传性别的手段，使用传统的选择育种获取全雄鱼存在育种周期长，费时费力的问题。高效诱导伪雌鱼及其鉴定技术是需要解决的核心问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，该方法能够将群体中遗传雄性个体进行性逆转，显著增加群体中表型雌鱼的比例；本发明还提供一种尼罗罗非鱼伪雌鱼微卫星分子标记鉴定方法，在将群体中遗传雄性个体进行性逆转为表型雌鱼后，利用新开发的标记及其引物对群体基因型数据进行分析能够快速准确鉴定表型雌鱼群体中的伪雌鱼。
一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，其特征在于，在尼罗罗非鱼孵化后开始进食时开始投喂含乙烯雌酚(DES)的开口饲料，连续投喂3周以上，然后再进行常规喂养。
优选，所述的含乙烯雌酚的开口饲料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含0.5g-1g乙烯雌酚。
进一步优选，所述的含乙烯雌酚的开口饲料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含1g乙烯雌酚。
所述的含乙烯雌酚的开口饲料的制备方法，将乙烯雌酚溶于足量无水乙醇后与小鱼开口饲料充分搅拌混合，待小鱼开口饲料充分吸收乙烯雌酚后，充分挥发无水乙醇，干燥，得到含乙烯雌酚的开口饲料。
乙烯雌酚在诱导罗非鱼遗传雄鱼性逆转为伪雌鱼中的应用。
优选，所述的罗非鱼为尼罗罗非鱼。
一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引物，其特征在于，所述的微卫星分子标记引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
一种尼罗罗非鱼伪雌鱼微卫星分子标记鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待鉴定尼罗罗非鱼的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，利用上述尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引物的正向引物和反向引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳然后分型，判断是否为伪雌鱼。
优选，所述的PCR扩增的反应体系为：2×PCR Mastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，补充ddH2O至总体积20μL；反应条件为：94℃预变性3min；变性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循环数为34；72℃延伸10min。
本发明首先通过构建尼罗罗非鱼家系，并利用含雌激素乙烯雌酚(DES)的开口饲料对家系部分个体(处理组)进行性逆转处理，促使其中的遗传雄性个体发育成生理雌性的伪雌鱼。对照组则投喂未添加雌激素的饲料。通过与对照组表型数据进行比较发现，该方法成功的提高了处理组群体的表型雌性个体的比例(95％-100％；表1)。研究确定了罗非鱼最佳DES性逆转处理剂量(1g DES/kg饲料)及饲料配制方法。进一步基于已有研究所定位出的不同染色体(LG1,LG23)性别决定QTL区域，设计微卫星引物，通过群体QTL连锁作图，分析标记与表型关系，最终筛选出尼罗罗非鱼育种家系中与性别性状连锁的LG23上的QTL区间及微卫星标记；进一步应用新开发的与性别紧密连锁的微卫星分子标记tlp-23-sd的引物对激素处理后的群体进行分析，筛选鉴定发生性逆转的伪雌鱼39尾，为生产全雄鱼奠定基础。尼罗罗非鱼微卫星分子标记tlp-23-sd的引物序列如SEQ ID NO.1(正向引物)和SEQ IDNO.2(反向引物)所示。
实现本发明的技术如下：
一.尼罗罗非鱼伪雌鱼雌激素高效诱导
挑选优质尼罗罗非鱼亲鱼构建全同胞家系。将家系分组进行养殖管理(表1)，并利用雌激素乙烯雌酚(DES,0.5g或1g DES/kg开口饲料)对该家系2个处理组分别进行性逆转处理。其中处理组在孵化后开始进食时即投喂添加雌激素DES的开口饲料，每日三次，连续投喂3周，促使其中的遗传雄性个体发育成表型雌性的伪雌鱼。实验设置对照组1组投喂未添加雌激素DES的开口饲料。通过比较对照组(30％)和处理组(95％-100％)的雌性个体比例，证实雌激素(DES)能成功提高家系表型雌性个体的比例(表1)。研究确定投喂含1g DES/kg开口饲料能高效诱导遗传雄性罗非鱼性逆转为生理雌性的伪雌鱼。
二.尼罗罗非鱼个体动物电子标签标记及伪雌鱼微卫星分子标记鉴定
待鱼生长至性腺发育成熟(约5个月)后，通过人工分辨其外生殖器进行表型性别鉴定，并记录性别和体重，剪取亲本和子一代(对照组96尾雌性个体及96尾雄性个体以及DES处理1组中96尾雌性个体)的鳍条样品保存于无水乙醇中，放入-70℃保存备用。同时，在每条鱼背部注射动物电子标签，记录个体身份信息，用于进一步追踪个体的生长及发育情况。
利用基因组DNA提取试剂盒提取所有取样个体基因组DNA。基于已有研究所定位出的不同染色体(LG1,LG23)性别决定QTL区域基因组序列，设计5对微卫星引物，并从O.Eshel(2012)等的研究当中[7]，选取9对位于性别决定区域内的微卫星分子标记对所有样品DNA进行分析。通过3％PAGE胶电泳及银染显色对PCR产物进行基因分型。通过QTL作图分析验证和筛选性连锁标记。统计学分析显示在所分析的罗非鱼群体中新开发的LG23微卫星标记tlp-23-sd等与罗非鱼性别具有最强的连锁关系(图1)。非DES处理的对照组中，tlp-23-sd标记对于遗传性别为雄性的罗非鱼鉴定准确率达到90.6％。进一步使用验证的性连锁微卫星分子标记tlp-23-sd筛选鉴定处理组中标记和取样的伪雌鱼(PAGE电泳结果示意图如图2)。DES处理1组的96个雌性个体中有90个个体扩增出清晰条带，经微卫星标记鉴定出39个遗传性别为雄性、生理性别为雌性的伪雌鱼。研究显示使用雌激素处理的确使雄性尼罗罗非鱼发生性逆转，遗传性别为雄性的尼罗罗非鱼发育成伪雌鱼。其中用于扩增微卫星分子标记tlp-23-sd的引物，其正向引物序列tlp-23-sd-F：5’-TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列tlp-23-sd-R：5’-GTCAGAATGCACTTTAACACAGAGATACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的优点和效果：
1.本研究通过比较分析确定1g DES/kg开口饲料是罗非鱼高效的DES性逆转处理剂量，这对于高效诱导罗非鱼伪雌鱼具有重要的意义。
2.由于罗非鱼的性别分化受到许多因素影响，除了遗传因素，在性别分化的过程中，环境中的多种因素如温度、环境激素等也可能使其发生性逆转，从而可能导致罗非鱼的遗传性别与生理性别不一致，导致某些个体的基因型和表现型相悖。通过应用尼罗罗非鱼性别决定区紧密连锁的微卫星分子标记tlp-23-sd及其引物开展伪雌鱼的筛选，能缩短育种的周期，提高选育的准确性。
附图说明
图1是所用微卫星分子标记tlp-23-sd在LG23号连锁群上的相对位置及其LOD值。
图2是微卫星分子标记tlp-23-sd的引物筛选鉴定XY伪雌鱼示意图；Marker：100bpDNA ladder；Pf：雌性亲本；Pm：雄性亲本；Of：家系当中的雌性表型个体；Om：家系当中的雄性表型个体；箭头所示为伪雌鱼个体及雄性特异条带。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范畴。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：雌激素乙烯雌酚(DES)开口饲料的配制方法
首先将雌激素乙烯雌酚(DES)按实验要求量(0.5g或1g)溶解入500mL无水乙醇，然后将含有DES的无水乙醇与1kg小鱼开口饲料进行充分搅拌。4度冰箱过夜，让小鱼开口饲料充分吸收DES。将添加DES的小鱼开口饲料置入通风橱，让无水乙醇充分挥发。干燥，由此制备得到0.5g/kg、1g/kg的含DES的开口饲料，然后用塑料袋密封，低温保存备用。
实施例2：家系构建与雌激素处理
2015年6月份在广州市五龙岗水产发展有限公司挑选优质尼罗罗非鱼亲鱼(遗传雄性亲本和遗传雌性亲本)1对成功构建了1个全同胞家系(共1356尾)。实验鱼在广州市五龙岗水产发展有限公司进行养殖及实验处理。
将该家系不分性别随机分成3组(2个处理组及1个对照组)进行养殖管理(表1)。其中2个处理组在孵化后开始进食时投喂含DES的开口饲料，连续投喂3周，促使其中的遗传雄性个体发育成伪雌鱼。对照组则投喂未添加雌激素的小鱼开口饲料。
表1尼罗罗非鱼全同胞家系DES处理表型性别统计
待尼罗罗非鱼生长至5个月性腺发育成熟后，通过人工分辨其外生殖器进行表型性别鉴定并记录性别(表1)和体重，剪取亲本和子一代的鳍条样品保存于无水乙醇中，放入-70℃保存备用。同时，基于体重及性别性状，在处理1组中挑选出96条雌鱼作为育种群体，为每条鱼注射电子标签，记录个体身份信息用于育种。数据分析显示实验成功的提高了处理组中的表型雌性个体的比例(95％-100％；表1)。研究确定投喂1g/kg的含DES的开口饲料能高效诱导遗传雄性鱼性逆转为生理雌性的伪雌鱼。
实施例3：基因组DNA来源与制备及标记筛选
1.亲代及子代基因组DNA样品提取
本实验用于伪雌鱼性别连锁分子标记的鉴定的样品有：实施例2中的雌性和雄性亲本、对照组96尾雌性(表型)个体及96尾雄性(表型)个体、处理1组96尾雌性(表型)个体。
2.DNA提取方法
(1)亲本DNA
使用东盛基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，提取的DNA稀释5倍后放入-20℃保存备用。
(2)子一代DNA
a.取一1.5mL的96孔板，置于冰上，每孔加入300μL的STE buffer(10mM TrispH8.0，50mM EDTA pH 8.0，200mM NaCl，0.5％SDS)，50μL蛋白酶K(20mg/mL)；
b.用灭过菌的剪刀剪下3*3mm2大小的鱼鳍样品，放在滤纸上，按压吸干样品上残留的无水乙醇，放入裂解液中；
c.简单离心后放入摇床中，将温度设置为55℃，转速70-100r/min，裂解3hr；
d.取硅胶柱(96孔)，下面用96孔板承接滤液，每孔加入240μL 6M NaI，再加入80μL的裂解液，2000g离心1min，倒去滤液；
e.每孔加入240μL的wash buffer(10mM Tris pH7.5，1mM EDTA pH7.5，100mMNaCl，50％乙醇)，2000g离心3min后，静置干燥2-5min；
f.每孔加入120μL的纯水，在室温下静置2min后，2000g离心2min得到DNA样品；
g.1％琼脂糖凝胶电泳，120v电泳30min，凝胶成像系统拍照。提取的DNA稀释5倍后放入-20℃保存备用。
3.标记筛选
基于已有研究所定位出的不同染色体(LG1，LG23)性别决定QTL区域基因组序列，设计5对微卫星引物，并从O.Eshel(2012)等的研究当中[7]，选取9对位于性别决定区域内的微卫星分子标记对所有样品DNA进行分析。标记引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
4.PCR反应
反应体系为：2×PCR Mastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，补充ddH2O至总体积20μL。反应条件为：94℃预变性3min；变性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循环数为34；72℃延伸10min。取扩增产物3μL进行凝胶电泳检测，拍照。
5.聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测
1)制胶
取纯水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％)280μL，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入梳子，静置1-2小时，待其凝固。
2)电泳
待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次序进行点样，每孔3μL；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10分钟后，将电压调到600v，继续电泳1.5小时。
3)银染
电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500mL的染色液(1％AgNO3)，染色约5分钟后将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5-10秒，倒掉纯水，加入显色液(20g NaOH+0.5g Na2CO3+4mL甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入冰中预冷)，显色约10-15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察条带并拍照。
6.遗传图的制作和基因定位
用表格记录每个个体的基因型，使用软件Joinmap 4和MapQTL 6对遗传图谱数据和表型数据分析，计算每个标记的LOD值，获得显著性相关的微卫星标记，鉴定尼罗罗非鱼性别性状紧密连锁的分子标记(如图1所示)。使用Joinmap 4和MapQTL 6对对照组中96个雄性(表型)个体和96个雌性(表型)个体的基因型数据进行连锁作图，结果显示标记tlp-23-sd的LOD最高，为19.79。LOD值的大小用于判定连锁关系，本研究当中的LOD值表示微卫星标记与尼罗罗非鱼性别的连锁关系。该微卫星分子标记tlp-23-sd的序列如下所示：TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACATGGTAGCAAAAAAACGTGTGATTACGACCCCC(CA)nCGCACACACCCACTGTGTTACATCATTTCAGCCACTTTATACTTGTTCCCATGGTACGGATGGAAATAACCTTGCTGAAGCAGAAGCTGGTATCTCTGTGTTAAAGTGCATTCTGAC，其含有(CA)n微卫星序列重复。在雌雄个体间存在CA碱基重复次数的差异从而区别不同性别的个体。通过该标记对实验群体雄性亲本DNA进行PCR扩增，PAGE电泳银染后有两条雄性特异带，其分别代表雄性亲本该基因标记的2个等位基因(分子量大小分别为197及213bp；如图2所示)。对照组中，该微卫星分子标记tlp-23-sd对于遗传性别为雄性的尼罗罗非鱼鉴定的准确率达到90.6％，即对照组雄性(表型)个体中有90.6％的个体能扩增出相应的雄性特异带，而对照组雌性(表型)个体的基因组DNA经扩增后无雄性特异带。准确率无法到达100％的原因可能是由于罗非鱼的性别受到许多因素影响。除了遗传因素，在性别分化的过程中，环境中的多种因素如温度、环境激素等也可能使其发生性逆转，导致某些个体的基因型和表现型相悖。通过微卫星分子标记tlp-23-sd可以快速准确的鉴定和区分不同遗传成分的个体，其中用于扩增微卫星分子标记tlp-23-sd的引物，其正向引物序列tlp-23-sd-F：5’-TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列tlp-23-sd-R：5’-GTCAGAATGCACTTTAACACAGAGATACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
实施例4：伪雌鱼分子标记筛选
进一步使用验证的性连锁微卫星分子标记tlp-23-sd的引物(如SEQ ID NO.1和2所示)对实施例2中处理1组的96个雌性(表型)个体的基因组DNA进行了PCR扩增、PAGE胶电泳、银染显色及基因型分析。结果表明，处理1组的96个雌性(表型)个体中有90个个体扩增出清晰条带，利用微卫星分子标记tlp-23-sd的引物鉴定出39个遗传性别为雄性、但生理性别为雌性的伪雌鱼(图2)，其都扩增出雄性特异带。
Claims (9)
1.一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，其特征在于，在尼罗罗非鱼孵化后开始进食时开始投喂含乙烯雌酚的开口饲料，连续投喂3周以上，然后再进行常规喂养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含0.5g-1g乙烯雌酚。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含1g乙烯雌酚。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含乙烯雌酚的开口饲料的制备方法为：将乙烯雌酚溶于足量无水乙醇后与小鱼开口饲料充分搅拌混合，待小鱼开口饲料充分吸收乙烯雌酚后，充分挥发无水乙醇，干燥，得到含乙烯雌酚的开口饲料。
5.乙烯雌酚在诱导罗非鱼遗传雄鱼性逆转为伪雌鱼中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的罗非鱼为尼罗罗非鱼。
7.一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引物，其特征在于，所述的微卫星分子标记引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种尼罗罗非鱼伪雌鱼微卫星分子标记鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待鉴定尼罗罗非鱼的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，利用权利要求7所述的尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引物的正向引物和反向引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳然后分型，判断是否为伪雌鱼。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为：2×PCRMastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，补充ddH2O至总体积20μL；反应条件为：94℃预变性3min；变性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循环数为34；72℃延伸10min。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107079844A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-08-22 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种超雄鲤鱼和遗传雄性而生理雌性鲤鱼的制备方法 |
| CN108315442A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-07-24 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种黄唇鱼微卫星dna标记及其筛选方法 |
| CN110055335A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-07-26 | 中山大学 | 一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物、试剂盒和快速鉴定方法 |
| CN113637764A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-11-12 | 中山大学 | 一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用 |
| CN114342873A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-04-15 | 浙江万里学院 | 一种利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101406165A (zh) * | 2008-11-25 | 2009-04-15 | 广州鹭业水产有限公司 | 超雄尼奥罗非鱼的制种方法 |
| CN101962641A (zh) * | 2010-10-09 | 2011-02-02 | 西南大学 | 尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN105368948A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-03-02 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 尼罗罗非鱼性别鉴定用引物及pcr鉴定方法 |
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2016
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101406165A (zh) * | 2008-11-25 | 2009-04-15 | 广州鹭业水产有限公司 | 超雄尼奥罗非鱼的制种方法 |
| CN101962641A (zh) * | 2010-10-09 | 2011-02-02 | 西南大学 | 尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN105368948A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-03-02 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 尼罗罗非鱼性别鉴定用引物及pcr鉴定方法 |
Non-Patent Citations (8)
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107079844A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-08-22 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种超雄鲤鱼和遗传雄性而生理雌性鲤鱼的制备方法 |
| CN107079844B (zh) * | 2017-05-08 | 2018-02-13 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种超雄鲤鱼和遗传雄性而生理雌性鲤鱼的制备方法 |
| CN108315442A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-07-24 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种黄唇鱼微卫星dna标记及其筛选方法 |
| CN108315442B (zh) * | 2018-03-30 | 2021-07-27 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种黄唇鱼微卫星dna标记及其筛选方法 |
| CN110055335A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-07-26 | 中山大学 | 一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物、试剂盒和快速鉴定方法 |
| CN113637764A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-11-12 | 中山大学 | 一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用 |
| CN113637764B (zh) * | 2021-05-14 | 2023-05-30 | 中山大学 | 一种罗非鱼体色相关的微卫星的检测引物及其应用 |
| CN114342873A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-04-15 | 浙江万里学院 | 一种利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法 |
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Legal Events
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Granted publication date: 20191231 Termination date: 20200824 |
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