CN114457168B - 红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产养殖技术领域，涉及红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用。本发明提供了两对与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO 1和2所示的引物对一和核苷酸序列如SEQ ID NO：3和4所示的引物对二。本发明根据基因型与表现型间关系鉴定出与越冬期体色黑斑性状关联的微卫星标记ltbs2_3809和ltbs8_4298，并筛选微卫星标记ltbs2_3809基因型为ab同时ltbs8_4298基因型为aa的作为亲本的基因型，以有效获得体色稳定无明显的黑斑变异的红罗非鱼群体，保证亲本性状优良，进而保证体色稳定遗传，提高育种效率。

Description

红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其 应用

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体地，涉及红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用。

背景技术

罗非鱼(Oreochromisspp)是一种原产于非洲的慈鲷科鱼类，是世界上第二大淡水养殖鱼类，仅次于鲤鱼。红罗非鱼属于鲈形目(Percifoxrnes)，鲈亚目(Percoidei)，丽鱼科(Cichlidae)，罗非鱼属(Oreochromis)，一般认为是由尼罗罗非鱼(O.niloticus)与体色变异的莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)杂交，经多代选育而成的优良品种。近年来，因其具有腹腔无黑膜、体色艳丽、口感清新、适应性强等众多优点，在东南亚和我国的养殖面积不断扩大。红罗非鱼鲜艳的红色体表迎合了中国人对于红色的喜爱，因此红罗非鱼在中国市场有着巨大的潜力。

红罗非鱼体色较为丰富，据研究报道目前主要存在深红色、橙色、金色、粉红色、粉白色等，呈现的不同体色通常是由其鱼体表皮肤和鳞片含有不同的色素细胞及其不同的数量分布所致。色素细胞分布于表皮和肌节之间的叠加层中，在鳞片皮肤组织中上得以显现。胡萝卜素能让红罗非鱼体色鲜艳，但鱼类本身无法合成，因此该色素来源于食物而非内源性合成。

在生产实际中，经历越冬期的部分红罗非鱼会出现不同程度的黑斑现象。体色作为红罗非鱼重要经济性状之一，其在冬季体色变黑现象严重影响了其经济价值，已成为制约红罗非鱼大规模养殖的重要因素之一。大部分由于越冬期诱导的体表黑斑在恢复适宜温度后会逐渐褪去，但小部分会有保留，然而，其遗传机制不清楚。解析越冬期诱导黑斑性状的遗传机制，筛选出越冬期体色稳定无黑斑的红罗非鱼亲本，对于进行优良红罗非鱼的选育，提高育种效率来说具有至关重要的作用。

获得越冬期体色鲜亮无黑斑且稳定遗传的红罗非鱼对于解决当前制约红罗非鱼生产养殖问题及提高市场价值至关重要。王兰梅等通过研究KEGG通路分析，发现黑色素合成、Wnt和MAPK 3种信号通路很可能影响了红罗非鱼的体色变异过程(王兰梅,朱文彬,董在杰.3种不同体色的红罗非鱼皮肤转录组分析比较[C]//2015年中国水产学会学术年会论文摘要集.2015.)；但是，目前国内外关于红罗非鱼越冬期黑斑性状的遗传机制仍不清楚。

数量性状基因座(QTL)是指控制数量性状的基因在基因组中的位置，基于QTL进行性状关联的分子标记育种，分子标记育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的一种新型育种方法，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。现有技术中虽然也有关于黑斑体色红罗非鱼的分子标记，如中国发明专利公开了红罗非鱼皮肤组织的miR-138-5p，可作为“黑斑”和“红斑”体色的红罗非鱼miRNA分子标记，通过该分子标记可广泛用于红罗非鱼品种鉴别、保种和分子辅助选择育种，但是该分子标记是针对“黑斑”和“红斑”体色的红罗非鱼，并非专门针对越冬期“黑斑”变异的红罗非鱼，这仍然限制了利用分子标记对越冬期“无黑斑”红罗非鱼的辅助育种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有黑斑红罗非鱼分子标记辅助育种的不足，提供红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用。

本发明的第一个目的是提供红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物。

本发明的第二个目的是提供所述的检测引物在鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述引物在红罗非鱼分子育种中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

本发明通过ddRAD-seq技术、基因分型技术以及全基因组关联分析(GWAS)获得红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的QTL区间，在QTL区间内开发微卫星分子标记，通过微卫星分子标记从遗传上鉴定其体色遗传方式。进而通过已开发的微卫星标记方法，快速鉴定在越冬期体色稳定，无黑斑产生的亲鱼，最终生产越冬期无黑斑发生且体色纯正的红罗非鱼。

本发明要求保护红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物，包括以下引物对中的一对或两对，所述引物对一的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和2所示；引物对二的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和4所示。

优选地，所述检测引物包括引物对中的两对。

本发明还要求保护所述的检测引物在鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星中的应用。

本发明还要求保护所述的检测引物在红罗非鱼分子育种中的应用。

优选地，所述体色为红色。

所述的检测引物在制备鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种检测红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的检测引物。

优选地，所述试剂盒还含有PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应体系为2×PCR DS Mix 8～12μL，所述检测引物的引物对的上下游引物各0.8～1.2μL，模板DNA 2～4μL，补充水1.6～8.4μL至总体积20μL。

更进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应体系为2×PCR DS Mix 10μL，所述检测引物的引物对的上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，补充水5μL至总体积20μL。

进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应条件为94～95℃预变性3min，变性94～95℃30s，退火55.8℃40s，延伸70～72℃30s，循环数为35，70～72℃延伸10min。

更进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应条件为94℃预变性3min，变性94℃30s，退火55.8℃40s，延伸72℃30s，循环数为35，72℃延伸10min。

本发明还要求保护所述的试剂盒在鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星中的应用。

本发明还要求保护所述的试剂盒在红罗非鱼分子育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首先针对红罗非鱼越冬期体色黑斑性状进行了QTL作图，在此基础上开发了性状关联的分子标记。使用该分子标记筛选优质红罗非鱼亲鱼将有助于解决传统体色育种中育种周期长、投入成本高等现实问题，对于红罗非鱼产业发展具有重要的意义。

本发明根据基因型与表现型间关系鉴定出与越冬期体色黑斑性状关联的微卫星标记ltbs2_3809和ltbs8_4298，并筛选微卫星标记ltbs2_3809基因型为ab同时ltbs8_4298基因型为aa的作为亲本的基因型，以有效获得体色稳定无明显的黑斑变异的红罗非鱼群体，从而以建立保证红罗非鱼体色在越冬期诱导下无变异且稳定遗传的科学方法，保证亲本性状优良，进而保证体色稳定遗传，提高育种效率。

附图说明

图1为本发明红罗非鱼群体体色分级参考标准；A：无黑斑红罗非鱼degree1；B：零星黑斑且黑斑面积不超过中线下面积50％为degree2；C：黑斑超过中线下腹部50％单不超过体表总面积50％为degree3；D：黑斑面积超过体表总面积50％为degree4。

图2为本发明GWAS分析中使用GLM模型和PCA为10时绘制的p值QQ图。

图3为本发明采用GWAS方法在ChrLG2上鉴定的与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状显著相关的SNP位点；x轴(横轴)显示chrLG2的基因组位置(bp)。通过GWAS分析，y轴(纵轴)是chrLG2上每个SNP的p值。校正的全基因组显著阈值(3.27e-06)被标示为红线。chrLG2上有4个SNP高于阈值水平。

图4为本发明采用GWAS方法在ChrLG8上鉴定的与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状显著相关的SNP位点；x轴(横轴)显示chrLG8的基因组位置(bp)。通过GWAS分析，y轴(纵轴)是chrLG8上每个SNP的p值。校正的全基因组显著阈值(3.27e-06)被标示为红线。chrLG8上有5个SNP高于阈值水平。

图5为本发明越冬期后无黑斑红罗非群体微卫星标记SSR-ltbs2-3809 PAGE胶基因分型；图中a、b、c为四种等位基因，ab、bb、bc为三种基因型。

图6为本发明越冬期后有黑斑红罗非群体微卫星标记SSR-ltbs2-3809 PAGE胶基因分型；图中所示a、b、c为四种等位基因，ab、bb、bc为三种基因型。

图7为本发明越冬期后无黑斑红罗非群体微卫星标记SSR-ltbs8-4298 PAGE胶基因分型；图中所示为a、b、c、d为四种等位基因，aa，bb、bd、cd为四种基因型。

图8为本发明越冬期后有黑斑红罗非群体微卫星标记SSR-ltbs8-4298PAGE胶基因分型；图中所示为a、b、c、d为四种等位基因，aa，bb、bc、cd为四种基因型。

图9为本发明红罗非鱼群体(红罗非鱼黑斑群体和无黑斑群体各96尾)微卫星标记SSR-ltbs2-3809基因型统计图。

图10为本发明红罗非鱼群体(红罗非鱼黑斑群体和无黑斑群体各64尾)微卫星标记SSR-ltbs8-4298基因型统计图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本申请中极端群体即指无黑斑的红罗非鱼群体及极端黑斑红罗非鱼群体。

实施例1混合家系个体越冬期体色黑斑性状的全基因组关联分析

一、实验方法

1、红罗非鱼体色评定及样本采集和保存

2021年3月在广州市五龙岗水产发展有限公司选取经过越冬期胁迫的红罗非鱼715尾，取鳍条组织并拍照后，进行体色评定。红罗非鱼群体体色分级参考标准如图1。

体色鲜亮无黑斑的优质红罗非鱼个体体色性状评分定为degree1；经低温诱导产生黑斑的红罗非鱼群体，根据黑斑程度进行综合评定后，将其分为三个等级：具有零星黑斑且不超过中线下面积50％的评定为degree2；黑斑超过中线下腹部50％但不超过体表面积50％的个体的体色性状值评定为degree3；黑斑超过体表总面积50％的被评为degree4。

剪取的所有鳍条样品保存于无水乙醇中，放入-20℃保存备用。同时在取鳍条的过程对于那些体表无黑斑的个体以及极端黑斑个体背部注射动物电子标签，记录个体身份信息，用于进一步追踪个体的体色分化及用于构建子二代进行验证。

2、罗非鱼DNA文库的构建

利用基因组DNA提取试剂盒提取所有取样个体基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳技术检测所有个体DNA质量，并利用Qubit 3.0检测DNA浓度，保证用于构建基因文库的DNA质量与浓度达标。

采取ddRAD-seq技术构建文库。利用EcoR1和Msp1两种常见的限制性内切酶进行双酶切，得到限制性酶切片段；利用T4连接酶进行接头连接，其后进行PCR扩增；对PCR扩增后的产物采用磁珠法进行纯化。对纯化的DNA目的片段采用低熔点琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，观察到一条主要集中在280～480bp之间弥散的条带；使用Qubit 3.0对其进行浓度测定后，等量混合成一个DNA文库，然后将DNA文库进行琼脂糖凝胶电泳，分离回收得到目标DNA片段，将最终得到的DNA片段进行高通量测序。

3、混合DNA文库的高通量测序

采用Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM进行高通量测序，对测序得到的原始测序序列，即raw data，进行过滤，去掉低质量的reads、接头、过多的N的reads，获得clean data。

4、SNP的获取与过滤

利用bowtie将clean data与已经在NCBI上公布的罗非鱼基因组进行比对，然后使用samtools、bcftool等生物信息软件进行分析，获得SNP位点。然后对获得的SNP位点进行进一步过滤，过滤掉个体测序深度小于10，总深度小于1000的个体。并删除群体中最小等位基因频率小于0.2，缺失率大于10％的SNP。

5、全基因组关联分析

使用TASSEL软件分析越冬期体色黑斑性状与红罗非鱼基因组的SNP的关联性。

首先运行主成分分析以检测群体中可能的群体结构情况。主成分分析的主成分数量是由QQ plot的分布、以及是否满足使基因组膨胀因子(λ)值最接近1.00来决定的。基因组膨胀因子λ值反映了p值经验观察值与预期值之比。理想化的λ值为1，当实际膨胀因子越偏离1，说明存在群体分层的现象越严重，容易有假阳性结果，需要重新矫正群体分层。

使用TASSEL软件中的一般线性模型(GLM)对体色性状进行了关联分析。使用R函数对关联数据做了QQ图(QQ plot)和曼哈顿图。应用Bonferroni方法调整全基因组范围内的p值显著性水平，显著SNP定义为原始p值<0.05/n，此研究中设定的SNP数量为n。

二、实验结果

通过高通量测序，获得约90Gb的原始数据，经过质控，拆分和过滤及变异分析后，在红罗非鱼染色体上一共检测到15282个SNP位点。利用GLM模型对低温诱导的黑斑性状数据与基因分型数据进行关联分析。当PC值调整为10时，估计膨胀因子λ为1.088(λ＝1.088)，最接近最优的膨胀系数1。用R绘制的QQ plot如图2。应用Bonferroni方法(p＝3.27e-06)，在ChrLG2上鉴定的与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状显著相关的SNP位点的曼哈顿图如图3，发现在chrLG2上有4个全基因组范围显著性SNP；在ChrLG8上鉴定的与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状显著相关的SNP位点的曼哈顿图如图4，发现chrLG8上有5个全基因组范围显著性SNP。其中两个与越冬期体色黑斑性状关联较显著的QTLs区间为：ChrLG2：4656691-4924453bp，ChrLG8：4917703-5166732bp。

实施例2样本DNA的检验

一、实验方法

基于已有的罗非鱼全基因组微卫星序列，采用ddRAD测序技术和GWAS分析技术在染色体LG2和LG8上定位了与越冬期体色黑斑性状相关的QTL区域，在SNP峰值附近开发微卫星标记，共设计6对微卫星标记引物，标记引物均由艾基生物(广州)贸易有限公司合成。6对微卫星标记引物如表1所示。

表1

PCR反应体系为：2×PCR DS Mix 10μL，上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，补充水5μL至总体积20μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30s，退火55.8℃40s，延伸72℃30s，循环数为35，72℃延伸10min。

取扩增产物3μL通过8％PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳及银染显色对PCR产物进行基因分型检测，银染显色拍照，通过人工读带的方式对PCR产物进行基因分型。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测具体步骤如下：

(1)制胶

取纯水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％)280μL，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入梳子，静置半小时，待其凝固。

(2)电泳

待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次进行点样，每孔3μL；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10min后，将电压调到600V，继续电泳1.5h。

(3)银染

电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500mL的染色液(1‰AgNO₃)，染色约5min后，将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5～10s，倒掉纯水，加入显色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4mL甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入冰中预冷)，显色约10～15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察条带并拍照。

二、实验结果

不同基因型会扩增出不同大小的产物，不同的片段长短在聚丙烯酰胺凝胶上移动速度也会不同，最后呈现出不同的位置。本发明开发的位于LG2和LG8上的6个微卫星标记中，微卫星标记ltbs2_3809和ltbs8_4298与目标性状控制连锁，条带存在多态性。红罗非鱼无黑斑(red)和有黑斑(black spot)的微卫星标记ltbs2_3809电泳图如图5和图6所示；红罗非鱼无黑斑(red)和有黑斑(black spot)的微卫星标记ltbs8_4298电泳图如图7和图8所示。

ltbs2_3809目的产物在230bp～280bp附近，在红罗非鱼有黑斑表型和红罗非鱼无黑斑表型的两个极端群体中，共发现了三种基因型。以最长的那条带为a，中间的为b，最短的为c，在红罗非鱼有黑斑表型和红罗非鱼无黑斑表型的两个极端群体中均发现三种基因型分别为ab、bb、bc，图5和图6中已经注明了部分代表性个体的基因型。

ltbs8_4298的目标产物的大小在220～280bp之间，等位基因数目较多，按照条带长度从大到小的顺序分别命名为a、b、c、d四种。在红罗非鱼有黑斑表型和红罗非鱼无黑斑表型的两个极端群体中共发现五种基因型，分别为aa、bb、bc、cd、bd，图7和图8中已经注明了部分代表性个体的基因型。

实施例3一种检验红罗非鱼越冬期体色黑斑性状的方法

一、实验方法

1.提取样本DNA

利用基因组DNA提取试剂盒提取样本个体基因组DNA。

2.PCR反应

PCR反应的引物为：

Ltbs2_3809-F(SEQ ID NO.1)：5’-AAAGTCGAGGGGGAAAGCTA-3’；

Ltbs2_3809-R(SEQ ID NO.2)：5’-GCATCAGATGACAGGATGGA-3’。

Ltbs8_4298-F(SEQ ID NO.3)：5’-TGCAGGAACCCCTCATTAAC-3’；

Ltbs8_4298-R(SEQ ID NO.4)：5’-CTGAGGTGTTGGCACTCAGA-3’。

以Ltbs2_3809-F和Ltbs2_3809-R、Ltbs8_4298–F和Ltbs8_4298-R分别作为引物对进行PCR反应。

PCR反应的反应体系为：2×PCR DS Mix 10μL，上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，补充水5μL至总体积20μL。

PCR反应的反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30s，退火55.8℃40s，延伸72℃30s，循环数为35，72℃延伸10min。

3.PAGE胶(聚丙烯酰胺凝胶)电泳

(1)制胶

取纯水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％)280μL，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入梳子，静置半小时，待其凝固。

(2)电泳

待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次进行点样，每孔3μL；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10分钟后，将电压调到600V，继续电泳1.5小时。

4.银染显色

电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500mL的染色液(1‰AgNO₃)，染色约5min后将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5～10s，倒掉纯水，加入显色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4mL甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入冰中预冷)，显色约10～15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察条带并拍照。

二、实验结果

对经历越冬期无黑斑的红罗非鱼以及极端黑斑红罗非鱼群体PAGE胶电泳图进行基因型统计分析后，统计图如图9和图10，从图9可以看出用于检验微卫星标记ltbs2_3809的96尾无黑斑红罗非鱼的基因型分布为：ab型13尾、bb型59尾、bc型24尾，96尾极端黑斑红罗非鱼的基因型分布为：ab型6尾、bb型54尾、bc型36尾。经过卡方检验后，两个群体间达到显著性水平的差异(p＝0.012)，筛选基因型为ab的红罗非鱼个体越冬期无黑斑的概率达到68.4％。

从图10可以看出用于检验微卫星标记ltbs8_4298的64尾无黑斑红罗非鱼的基因型分布为：aa型47尾、bb型14尾、bd型1尾、cd型2尾，而64尾极端黑斑红罗非鱼的基因型分布为aa型24尾、bb型14尾、bc型14尾、cd型7尾、bd型5尾。经过卡方检验后，两个极端群体间达到显著性水平(p<0.01)。筛选基因型为aa的个体越冬期无黑斑红罗非鱼的效率达到64.4％。对同时满足这两种基因型的对星洲红罗非鱼进行筛选，可以有效获得体色稳定无明显的黑斑变异的红罗非鱼群体。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagtcgagg gggaaagcta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatcagatg acaggatgga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcaggaacc cctcattaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaggtgtt ggcactcaga 20

Claims (6)

1.红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物，其特征在于，包括以下引物对中的一对或两对，引物对一的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和2所示；引物对二的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和4所示。

2.一种检测红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还含有PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂的反应体系为2×PCR DS Mix8～12μL，权利要求1所述检测引物的引物对的上下游引物各0.8～1.2μL，模板DNA 2～4μL，补充水1.6～8.4μL至总体积20μL。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂的反应条件为94～95℃预变性3min，变性94～95℃30s，退火55.8℃40s，延伸70～72℃30s，循环数为35，70～72℃延伸10min。

6.权利要求1所述引物或权利要求2所述的试剂盒在红罗非鱼越冬期体色黑斑性状分子育种中的应用，其特征在于，所述体色为红色。

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