CN117535419A - 双峰驼乳脂率相关基因palm2akap2及其作为分子标记的应用 - Google Patents

双峰驼乳脂率相关基因palm2akap2及其作为分子标记的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及双峰驼乳脂率相关基因PALM2AKAP2及其作为分子标记的应用。本发明利用二代测序技术对162头双峰驼进行基因组重测序，通过与骆驼乳脂率性状进行全基因组关联分析，鉴定出PALM2AKAP2基因中与双峰驼驼乳中乳脂率高/低相关的分子标记。该标记位于4号染色体54373173bp位点，发生T>A单碱基突变(g.54373173T>A)，该突变位点可以提高驼奶的乳脂率，利用该标记能针对双峰驼的驼乳脂率性状开展分子标记辅助选择。

Description

双峰驼乳脂率相关基因PALM2AKAP2及其作为分子标记的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及双峰驼乳脂率相关基因PALM2AKAP2及其作为分子标记的应用。
背景技术
我国双峰驼品种原始，未进行过乳用性驼的定向选育，平均产乳水平较低，日产乳量仅1kg/峰左右，而个别驼日产量可达6kg以上，个体间差异极大，选育提高产乳量的空间很大。但有关双峰驼产奶性状相关基因研究报道较少，而利用现代生物分子标记技辅助双峰驼育种提高产奶性能的专利技术尚未见报道。目前乳用性状分子水平上的研究多集中在牛、羊上，而双峰驼乳用性能的研究则主要集中于表型数据的收集与整理及初期泌乳规律和泌乳特性的分析上。因此，亟待进一步从分子遗传水平深入研究双峰驼泌乳机制及调控机理，是加快双峰驼乳用性能提高的主要途径之一。目前双峰驼役用的作用已经大大减弱，正在由传统的单一的生产方式向生产专门化、商品化的方向转变。驼产品主要包括驼乳、驼肉、驼皮、驼骨等。驼乳是其中重要一个组成部分，驼乳因有益于身体健康而深受消费者欢迎，在市场上供不应求的乳品。但与此同时，驼乳的产乳量较低，造成生产效率不高，具有一定的局限性，因此，如何提高产乳量直接关系着驼乳产业的发展，对牧区农牧民增收以及社会稳定具有重要意义。传统的育种方式主要是利用表型信息和系谱信息进行杂交选育，对遗传力低和测量复杂的性状，存在测定成本高、时间长、育种过程复杂的问题。随着高通量测序技术、生物信息学及统计学方法的快速发展，全基因组关联分析(Genome WideAssociation Study,GWAS)已成为禽畜重要性状主效基因挖掘与鉴定的主要手段。
发明内容
基于现有技术中缺少从分子遗传水平深入研究双峰驼泌乳机制及调控机理的现状，本发明提供一种双峰驼产奶性状相关基因PALM2AKAP2及其作为分子标记的应用。
本发明将选择的分子标记应用于筛选出乳脂率高/低的双峰驼，为选育具有优良性状的双峰驼品种提供技术支撑。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种双峰驼产奶性状相关基因PALM2AKAP2作为与双峰驼产奶性状相关的分子遗传标记的应用。
进一步地，所述产奶性状具体是指双峰驼乳脂率。
进一步地，提供一种与双峰驼乳脂率相关的SNP分子标记，位于双峰驼4号染色体54373173处核酸位点，该位点的碱基为T或A，包含在PALM2AKAP2基因内含子内，其中，PALM2AKAP2基因位于骆驼参考基因组4号染色体54171320bp–54596332bp，其核酸序列可在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询获得。
本发明进一步提供所述SNP分子标记进行选育或辅助选育双峰驼泌乳相关品种或品系的方法，具体是选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼。
进一步地，基于所述SNP分子标记选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼详细步骤为：采集双峰驼组织样或血液样本，提取双峰驼基因组DNA，检测双峰驼的第4号染色体54373173核苷酸的序列为T或A，确定待测双峰驼的基因型是TT、TA或AA型，根据需要选择AA基因型或者TT基因型的双峰驼进行下一步选种和/或育种。
进一步说明，所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
本发明还提供一种鉴定如上所述SNP分子标记的方法，具体步骤为：
1)采集并获取双峰驼产奶性状：
采集并获取双峰驼产奶性状，记录其乳脂率及其影响因素，包括群体、年份、胎次、年龄、饲养方式、采样日期；
2)获取双峰驼样本：
采取对应双峰驼耳部组织样本，收集于离心管中，加入无水乙醇浸没样品，密封编号后于-80℃保存备用；
3)基因组DNA提取：
按照动物组织样DNA提取试剂盒说明书的流程，提取骆驼基因组DNA样品，使用NanoDrop 2000检测DNA样品的浓度和质量，并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；
4)基因组重测序
采用Illumina公司标准建库流程制备测序文库，用Hiseq测序平台进行双峰驼基因组重测序，测序深度为4x；
5)检测变异位点：
用PLINK软件对测得的原始文库数据进行过滤处理，以减少碱基错误对结果造成的影响，过滤标准如下：(1)去除带接头的序列；(2)去除无法确定碱基信息的序列；(3)当单端序列含有质量低于5，需要去除此对序列；(4)仅保留双端序列；
6)全基因组关联分析：
采用Vcftools软件对变异中的SNP根据群体变异分布进行过滤，过滤阈值包括：(1)次要等位基因数量大于3；(2)SNP缺失率超过5％；(3)SNP质量大于30；(4)最小测序深度5；(5)最小等位频率低于0.05；最后，通过过滤的SNP用于全基因组关联分析，应用rMVP软件，利用一般线性模型(GLM)、混合线性模型(MLM)、固定和随机模型循环概率统一方法(FarmCPU)进行全基因组关联分析，鉴定影响产奶性状的关键候选基因及位点。
进一步地，步骤5)检测变异位点时，具体方法为：
使用BWA-mem软件将基因组序列比对到骆驼参考基因组(BCGSAC_Cfer_1.0assembly)上，采用Samtools软件对比对结果进行排序和建立索引；然后，使用GATK软件进行下游分析：首先，使用GATK MarkDuplicates去除因PCR造成的序列重复；随后，使用GATK HaplotypeCaller对全基因组范围内的变异进行检索；最后，使用GATKVariantFiltration对变异位点进行硬过滤，其中，SNP过滤的阈值设为“QD<2.0，MQ<40.0，FS>60.0，SOR>3.0，MQRankSum<-12.5，ReadPosRankSum<-8.0”，INDEL过滤的阈值设为“QD<2.0，FS>200.0，SOR>10.0，MQRankSum<-12.5，ReadPosRankSum<-8.0”。
本发明还进一步提供一种双峰驼选育方法，包括如下步骤：
检测供试双峰驼基于SNP分子标记的基因型，根据基因型选育双峰驼，所述检测双峰驼的第4号染色体54373173核苷酸的序列为T或A，确定待测双峰驼的基因型是TT、TA或AA型，所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
本发明公开了与双峰驼产奶性状相关的基因PALM2AKAP2，以及利用其单核苷酸多态性位点(SNP)作为分子标记进行辅助选择的育种方法与应用。本发明首次研究发现了PALM2AKAP2基因与双峰驼产奶性状中乳脂率高/低相关的位点，为选育具有优良性状的双峰驼品种，改善驼奶乳品质提供候选基因。
具体地，本发明利用二代测序技术对162头双峰驼进行基因组重测序，通过与骆驼乳脂率性状进行全基因组关联分析，鉴定出PALM2AKAP2基因中与双峰驼驼乳中乳脂率高/低相关的分子标记。该标记位于第4号染色体54373173bp位点，发生T>A单碱基突变(g.54373173T>A)，该突变位点可以提高驼奶的乳脂率，利用该标记能针对双峰驼的驼乳脂率性状开展分子标记辅助选择。
其中，PALM2AKAP2基因位于骆驼参考基因组4号染色体54171320bp–54596332bp，其核酸序列可在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询获得。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明首次研究发现了PALM2AKAP2基因与双峰驼泌乳中的乳脂率高低相关联的位点，为选育具有优良性状的双峰驼品种提供有效的候选基因。同时，本发明利用标记-性状关联分析方法鉴定出PALM2AKAP2基因中，一个SNP(g.54373173T>A)与双峰驼乳脂率显著相关。该位点可应用于双峰驼产奶性状相关的关联分析中，为双峰驼高/低乳脂率的分子标记辅助选择提供了新的遗传标记资源。简而言之，本发发明采用了基于全基因组关联分析的方法进行双峰驼产奶相关基因的筛选与鉴定。针对鉴定出的候选基因，本发明进一步采用候选基因法策略判定所研究基因中是否存在与双峰驼产奶性状相关联的位点，从而进一步验证候选基因与泌乳性能的关系。此外，通过候选基因法，鉴定出的与产奶性状相关SNP的位点可作为双峰驼优良性状选育的分子标记，有助于双峰驼产奶性能的遗传进展。本发明具有操作简便、耗时短、所选标记准确性高等特点，也为其他畜禽重要经济性状的遗传解析提供技术支撑。
附图说明
图1：全基因组关联分析筛选出与双峰驼乳脂率高低相关的PALM2AKAP2基因与SNP位点。
具体实施方式
本发明提供一种双峰驼产奶性状相关基因PALM2AKAP2作为与双峰驼产奶性状相关的分子遗传标记的应用。所述产奶性状具体是指双峰驼乳脂率。
与双峰驼乳脂率相关的SNP分子标记，位于双峰驼4号染色体54373173处核酸位点，该位点的碱基为T或A，包含在PALM2AKAP2基因内含子内，其中，PALM2AKAP2基因位于骆驼参考基因组4号染色体54171320bp–54596332bp，其核酸序列可在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询获得。
本发明还提供所述SNP分子标记进行选育或辅助选育双峰驼泌乳相关品种或品系的方法，具体是选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼。基于所述SNP分子标记选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼详细步骤为：采集双峰驼组织样或血液样本，提取双峰驼基因组DNA，检测双峰驼的第4号染色体54373173核苷酸的序列为T或A，确定待测双峰驼的基因型是TT、TA或AA型，根据需要选择AA基因型或者TT基因型的双峰驼进行下一步选种和/或育种。所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
全基因组关联分析筛选出与双峰驼乳脂率高低相关的PALM2AKAP2基因与SNP位点如图1所示。
本发明还提供一种鉴定如上所述SNP分子标记的方法，具体步骤为：
1)采集并获取双峰驼产奶性状：
采集并获取双峰驼产奶性状，记录其乳脂率及其影响因素，包括群体、年份、胎次、年龄、饲养方式、采样日期；
2)获取双峰驼样本：
采取对应双峰驼耳部组织样本，收集于离心管中，加入无水乙醇浸没样品，密封编号后于-80℃保存备用；
3)基因组DNA提取：
按照动物组织样DNA提取试剂盒说明书的流程，提取骆驼基因组DNA样品，使用NanoDrop 2000检测DNA样品的浓度和质量，并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；
4)基因组重测序
采用Illumina公司标准建库流程制备测序文库，用Hiseq测序平台进行双峰驼基因组重测序，测序深度为4x；
5)检测变异位点：
用PLINK软件对测得的原始文库数据进行过滤处理，以减少碱基错误对结果造成的影响，过滤标准如下：(1)去除带接头的序列；(2)去除无法确定碱基信息的序列；(3)当单端序列含有质量低于5，需要去除此对序列；(4)仅保留双端序列；
6)全基因组关联分析：
采用Vcftools软件对变异中的SNP根据群体变异分布进行过滤，过滤阈值包括：(1)次要等位基因数量大于3；(2)SNP缺失率超过5％；(3)SNP质量大于30；(4)最小测序深度5；(5)最小等位频率低于0.05；最后，通过过滤的SNP用于全基因组关联分析，应用rMVP软件，利用一般线性模型(GLM)、混合线性模型(MLM)、固定和随机模型循环概率统一方法(FarmCPU)进行全基因组关联分析，鉴定影响产奶性状的关键候选基因及位点。
进一步地，步骤5)检测变异位点时，具体方法为：
使用BWA-mem软件将基因组序列比对到骆驼参考基因组(BCGSAC_Cfer_1.0assembly)上，采用Samtools软件对比对结果进行排序和建立索引；然后，使用GATK软件进行下游分析：首先，使用GATK MarkDuplicates去除因PCR造成的序列重复；随后，使用GATK HaplotypeCaller对全基因组范围内的变异进行检索；最后，使用GATKVariantFiltration对变异位点进行硬过滤，其中，SNP过滤的阈值设为“QD<2.0，MQ<40.0，FS>60.0，SOR>3.0，MQRankSum<-12.5，ReadPosRankSum<-8.0”，INDEL过滤的阈值设为“QD<2.0，FS>200.0，SOR>10.0，MQRankSum<-12.5，ReadPosRankSum<-8.0”。
本发明还进一步提供一种双峰驼选育方法，包括如下步骤：
检测供试双峰驼基于SNP分子标记的基因型，根据基因型选育双峰驼，所述检测双峰驼的第4号染色体54373173核苷酸的序列为T或A，确定待测双峰驼的基因型是TT、TA或AA型，所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
本发明公开了与双峰驼产奶性状相关的基因PALM2AKAP2，以及利用其单核苷酸多态性位点(SNP)作为分子标记进行辅助选择的育种方法与应用。本发明首次研究发现了PALM2AKAP2基因与双峰驼产奶性状中乳脂率高/低相关的位点，为选育具有优良性状的双峰驼品种，改善驼奶乳品质提供候选基因。
具体地，本发明利用二代测序技术对162头双峰驼进行基因组重测序，通过与骆驼乳脂率性状进行全基因组关联分析，鉴定出PALM2AKAP2基因中与双峰驼驼乳中乳脂率高/低相关的分子标记。该标记位于第4号染色体54373173bp位点，发生T>A单碱基突变(g.54373173T>A)，该突变位点可以提高驼奶的乳脂率，利用该标记能针对双峰驼的驼乳脂率性状开展分子标记辅助选择。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
选择具有详细产奶记录的双峰驼162峰，乳脂率测定数据如表1所示。采取对应双峰驼耳部组织30～50mg，收集于5mL离心管中，离心管中加入无水乙醇浸没样品，密封编号后于-80℃保存备用。
表1双峰驼162峰的乳脂率
剪双峰驼耳组织样本约30mg于离心管中，加入1mlPBS洗涤以基本去除乙醇，将组织转移到新的离心管中并尽量剪碎。移取200μl蛋白酶K于离心管中，颠倒混匀，在56℃震荡水浴或金属浴至组织完全溶解(约6小时)。按照动物组织样DNA提取试剂盒说明书的流程，提取骆驼基因组DNA样品。使用分光光度计NanoDrop 2000检测DNA样品的浓度和质量。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
对质控合格的基因组DNA样本，采用Illumina公司标准建库流程制备测序文库，用Hiseq测序平台进行双峰驼基因组重测序，测序深度为4x。
对测序所得原始数据，安装本专利介绍方法，首先用PLINK软件进行过滤处理。然后，使用BWA-mem软件将基因组序列比对到骆驼参考基因组上。其次，再采用Samtools软件对比对结果进行排序和建立索引，并使用GATK软件进行对变异位点进行硬过滤。进一步，采用Vcftools软件对变异中的SNP根据群体变异分布进行过滤。经过质控后，最终获得3,102,334个SNP变异位点可用于乳脂率性状的全基因组关联分析。
应用rMVP软件，分别采用利用一般线性模型(GLM)、混合线性模型(MLM)、固定和随机模型循环概率统一方法(FarmCPU)进行全基因组关联分析。筛选并鉴定出36个与双峰驼乳脂率相关的显著SNP位点，其显著标记水平为P<1.61×10-8。对显著位点所在基因位置进行定位，g.54373173T>A变异位点被定位在PALM2AKAP2基因内，利用FarmCPU模型鉴定对应P值为3.94×10-14。
最后，对筛选出目的位点g.41245716C>T所对应的基因型与双峰驼乳脂率进行方差分析，鉴定g.41245716C>T具有提高驼奶乳脂率的变异位点。AA基因型双峰驼乳脂率(6.98±0.54％)高于TA基因型(5.95±0.54％)和TT基因型(4.87±0.11％)双峰驼。因此，可选择TT型基因双峰驼进行下一步选种或育种以提高驼奶乳脂率。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双峰驼产奶性状相关基因PALM2AKAP2作为与双峰驼产奶性状相关的分子遗传标记的应用，其特征在于，PALM2AKAP2基因位于骆驼参考基因组4号染色体54171320bp–54596332bp。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产奶性状具体是指双峰驼乳脂率。
3.一种与双峰驼乳脂率相关的SNP分子标记，其特征在于，位于双峰驼4号染色体54373173处核酸位点，该位点的碱基为T或A，包含在PALM2AKAP2基因内含子内，其中，PALM2AKAP2基因位于骆驼参考基因组4号染色体54171320bp–54596332bp。
4.权利要求3所述SNP分子标记进行选育或辅助选育双峰驼泌乳相关品种或品系的方法，其特征在于，是选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼。
5.根据权利要求4所述SNP分子标记进行选育或辅助选育双峰驼泌乳相关品种或品系的方法，其特征在于，基于所述SNP分子标记选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼详细步骤为：采集双峰驼组织样或血液样本，提取双峰驼基因组DNA，检测双峰驼的第4号染色体54373173核苷酸的序列为T或A，确定待测双峰驼的基因型是TT、TA或AA型，根据需要选择AA基因型或者TT基因型的双峰驼进行下一步选种和/或育种。
6.根据权利要求5所述SNP分子标记进行选育或辅助选育双峰驼泌乳相关品种或品系的方法，其特征在于，所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
7.一种鉴定权利要求3所述SNP分子标记的方法，其特征在于，具体步骤为：
所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5)检测变异位点时，具体方法为：
使用BWA-mem软件将基因组序列比对到骆驼参考基因组(BCGSAC_Cfer_1.0assembly)上，采用Samtools软件对比对结果进行排序和建立索引；然后，使用GATK软件进行下游分析：首先，使用GATK MarkDuplicates去除因PCR造成的序列重复；随后，使用GATKHaplotypeCaller对全基因组范围内的变异进行检索；最后，使用GATK VariantFiltration对变异位点进行硬过滤，其中，SNP过滤的阈值设为“QD<2.0，MQ<40.0，FS>60.0，SOR>3.0，MQRankSum<-12.5，ReadPosRankSum<-8.0”，INDEL过滤的阈值设为“QD<2.0，FS>200.0，SOR>10.0，MQRankSum<-12.5，ReadPosRankSum<-8.0”。
9.一种双峰驼选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
检测供试双峰驼基于SNP分子标记的基因型，根据基因型选育双峰驼，所述检测双峰驼的第4号染色体54373173核苷酸的序列为T或A，确定待测双峰驼的基因型是TT、TA或AA型，所述AA基因型双峰驼乳脂率高于TA型双峰驼，TA基因型双峰驼乳脂率则高于TT基因型双峰驼。
10.根据权利要求9所述的一种双峰驼选育方法，其特征在于，发生T>A单碱基突变(g.54373173T>A)，该突变位点可以提高驼奶的乳脂率，利用该标记能针对双峰驼的驼乳脂率性状开展分子标记辅助选择。
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