CN109943646B - 黄牛plag1基因cnv分子标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄牛PLAG1基因CNV分子标记辅助检测生长性状的方法及其应用：以黄牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增PLAG1基因拷贝数变异区域和内参基因BTF3的部分片段，根据2‑ΔΔCt方法将定量结果分为多拷贝型和正常型，从而鉴定黄牛个体PLAG1基因的拷贝数变异类型。本发明在DNA水平上检测与黄牛生长性状密切相关的拷贝数变异，该拷贝数变异可作为中国黄牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，用于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作。
Description
技术领域
本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于实时荧光定量PCR(qPCR) 技术检测黄牛PLAG1基因CNV标记的方法。该方法以基因组DNA为模板，利用实时定量PCR，以BTF3基因为参照，根据-ΔΔCt值确定个体的拷贝数变异类型。
背景技术
随着基因组学和生物信息学的不断发展，肉牛育种的方向由表型选育向分子育种发展。分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该育种技术是借助 DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的。
拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)与简单重复序列(Simple sequencerepeat, SSR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)均为基因组结构变异 (srtuctural variation,SV)类型，在物种表型变异、物种演化等方面起着重要作用。拷贝数变异主要指1kb～5Mb的DNA片段拷贝数改变，这些片段的缺失、重复、倒位和异位统称为CNV。CNV是一种亚显微水平结构变异类型，包括拷贝数增加(Copy number gain) 和拷贝数减少(Copy number loss)。随着新一代测序技术和相应运算程序的结合发展，越来越小的具有拷贝数变异性质的DNA片段被识别，CNV的定义也不断发生改变。
染色体结构的改变主要表现为同源重组(homologous recombination,HR)和非等位同源重组(Non-allelic homologous recombination,NAHR)两种机制。NAHR是产生CNV的重要机制，主要发生在减数分裂时期的DNA损伤修复过程中，往往位于同源重复区(Segmental duplication,SD)或低拷贝的重复区内(Low copy repeats,LCRs)。同源序列的倒位、重复或缺失都会造成特定基因拷贝数的改变进而导致染色体结构的改变。此外，基于DNA损伤及错误重复修复的非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)、重复叉停滞及模板交换(Fork stalling and template switching,FoSTeS)和微同源序列介导重复(Microhomol-ogy-mediated replication-dependent recombination,MMBIR)也是产生 CNV的重要途径。NHEJ与NAHR的形成特征不同，它是在两个重组末端之间不具有高同源序列的基础上仍然能够发生DNA断端连接，导致染色体重排的发生。
众多的研究表明，生长因子在调节机体生长发育的过程当中起着至关重要的作用，而多形性腺瘤基因(pleomorphic adenoma gene,PLAG)就起着这样的作用。作为PLAG家族的重要成员之一，PLAG1基因编码500个氨基酸的锌指蛋白，位于人的8号染色体，cDNA 全长为7317bp，包含5个外显子，编码框长度为1503bp，从第4外显子的最后端和第5 外显子的起始端开始编码。PLAG1基因是最常见的存在于唾液腺的多形性腺瘤中的突变基因，它的作用与抑制基因p53相似，可调节细胞周期和细胞凋亡。然而，PLAG家族特别是PLAG1基因在牛的生长发育过程中的详细机制尚未研究清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄牛PLAG1基因CNV分子标记辅助检测生长性状的方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测黄牛PLAG1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
以待测黄牛血液基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增PLAG1基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛PLAG1基因的拷贝数变异类型；所述的PLAG1基因的拷贝数变异区域位于牛PLAG1基因参考基因组序列AC_000171.1的37024位至38623位。
优选的，所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的两类：多拷贝型， -ΔΔCt>0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。
优选的，所述的引物对P1为：
上游引物F1：5’-TGTGTATGCAAAGTCGCCCT-3’
下游引物R1：5’-CTTCAGAATCCCTGCCCAGT-3’；
所述的引物对P2为：
上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’
下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。
优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：50ng/μL模板DNA 1.25μL、10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.625μL、2×SYBR GreenQPCR Mix 6.25μL以及去离子水3.75μL。
优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性0.5～1min；(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。
优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为74bp，基于引物对P2扩增的 PCR产物片段大小为166bp。
上述检测黄牛PLAG1基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，具有正常型拷贝数变异类型的黄牛(柴达木黄牛、夏南牛)个体在生长性状 (管围、十字部高)上显著优于具有多拷贝型拷贝数变异类型的黄牛个体。
一种检测黄牛PLAG1基因拷贝数变异的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对P1和引物对P2。
本发明的有益效果体现在：
本发明公开的检测黄牛PLAG1基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数类型，便于推广应用。本发明在DNA水平上检测与黄牛生长性状密切相关的PLAG1基因拷贝数变异位点，该拷贝数变异位点的正常型拷贝数变异类型可作为中国黄牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记(CNV标记)，用于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作。
本发明对黄牛PLAG1基因(PLAG1基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行了检测和类型频率统计，并将CNV位点与黄牛的生长性状进行关联分析。结果表明该位点中， Normal类型(正常型)的频率最高，而且该位点的Duplication类型(多拷贝型)对黄牛的管围和十字部高有显著的负效应。黄牛PLAG1基因拷贝数变异与黄牛重要生长性状的关联分析结果，可以为黄牛分子育种提供理论依据，便于中国黄牛生长性状的分子标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
附图说明
图1为PLAG1基因CNV检测PCR产物熔解曲线(a)及熔解峰(b)图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对发明做详细说明，所述实施例仅是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
在前期的黄牛基因组重测序研究当中，发现牛PLAG1基因组序列的37024位至38623 位发生了拷贝数变异，因此，基于PLAG1基因的生理作用以及CNV的调节机制，研究PLAG1基因的拷贝数变异与生长性状的关联性是十分必要的，可为黄牛分子育种提供重要的理论依据。
本发明根据重测序得到的牛PLAG1基因组序列中发生拷贝数变异的区域为模板设计特异性引物，然后以黄牛基因组DNA为模板，进行qPCR扩增，并以BTF3基因为内参基因，利用2-ΔΔCt方法，判定个体的拷贝数类型。2-△△Ct方法是指实验组拷贝数相对于对照组的倍数，将基因表达丰度指数化(Log22-△△Ct)，进行方差齐性检验，统计各组间差异。
本发明利用qPCR技术，检测黄牛PLAG1基因的拷贝数变异情况，并将不同的拷贝数变异类型与生长性状进行关联分析，寻找具有优势生长性状的拷贝数类型，从而为黄牛的分子育种工作提供基础资料，加快中国黄牛的种质资源改良工作。
1.样品的采集及基因组DNA提取
(1)血样的采集
本发明中采集的柴达木黄牛来自于青海省海西州都兰县(采集时间为2013年12月)，均为24月龄，共计55头，采集的夏南牛来自于河南省驻马店市泌阳县(采集时间为2015年6月)，均为24月龄，共计100头，血液的采集方法为颈静脉采血。并记录它们的生长性状数据，如体高、体长、管围、胸围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。
(2)血样DNA的提取
①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。
②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。
③加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。
④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。
⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。
⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。
⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。
⑧4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2 次。
⑨4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。
⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。
2.目的基因及内参基因的扩增用特异性引物的设计
以NCBI所公布的牛PLAG1基因(AC_000171.1)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即PLAG1基因(目的基因)参考基因组序列AC_000171.1 的37024位至38623位，利用Prime 5.0软件设计包含此区域的引物，并在NCBI_BLAST 中进行比对。其引物(引物对P1，引物设计时间2018年3月)序列如下：
上游引物F1：5’-TGTGTATGCAAAGTCGCCCT-3’
下游引物R1：5’-CTTCAGAATCCCTGCCCAGT-3’；
同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(BTF3基因)中特定片段(166bp)的引物，其引物(引物对P2，引物设计时间2018年3月)序列如下：
上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’
下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’
通过绘制的熔解曲线和熔解峰确定引物对P1(图1)和P2适用于qPCR分析。
3.实时荧光定量PCR
qPCR反应体系如表1所示。
表1.qPCR的反应体系
PCR反应程序为：
(1)95℃预变性1min，然后按照(2)进行扩增反应；
(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。
4.个体CNV类型判定
实验结果采用2-△△Ct方法进行计算，具体的计算方法为：ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(参照组)，ΔCt(实验组)＝Ct(实验组目的基因)-Ct(实验组内参基因)，ΔCt(参照组)＝Ct(参照组目的基因)-Ct(参照组内参基因)
公式中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本。参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组黄牛个体。Ct即Cyclethreshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
根据公式计算得出每个待测个体的-ΔΔCt，并根据CNV类型的判定标准，判定检测的黄牛个体的拷贝数类型：-ΔΔCt>0.5为多拷贝型(Duplication)；-0.5≤-ΔΔCt≤0.5为正常型(Normal)，-ΔΔCt<-0.5为缺失型(Deltion)。
5.数据处理
生产数据：体高、体长、管围、胸围、尻长、坐骨端宽、十字部高。
统计检测群体中各种拷贝数类型(Duplication、Normal和Deltion)的个体数，并统计各种类型的频率。计算公式如下：
PC＝NC/N
其中，PC代表某种拷贝数类型的频率；NC代表群体中具有C这种CNV类型的个体数；N代表检测个体的总数量。
利用SPSS 23.0进行关联性分析。在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、性别、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：
Yijk＝μ+Gj+Eijk
其中，Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Gj为各位点的拷贝数类型；Eijk为随机误差。
数据处理的结果如表2、表3所示。
表2.柴达木黄牛PLAG1基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05；括号里面的数值表示拷贝数类型的频数。
表3.夏南牛PLAG1基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05；括号里面的数值表示拷贝数类型的频数。
参见表2、表3，本发明所检测的柴达木黄牛PLAG1基因的拷贝数变异位点与管围这个生长性状具有显著的关联性，检测的夏南牛PLAG1基因的拷贝数变异位点与十字部高这个生长性状具有显著的关联性。其中，Normal类型的个体在相应生长性状显著优于Duplication类型的个体。结果表明，PLAG1基因的Normal类型可以作为柴达木黄牛管围和夏南牛十字部高性状早期选择的分子标记，用于柴达木黄牛和夏南牛的快速选育。
<110> 西北农林科技大学
<120> 黄牛PLAG1基因CNV分子标记辅助检测生长性状的方法及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tgtgtatgca aagtcgccct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cttcagaatc cctgcccagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aaccaggaga aactcgccaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ttcggtgaaa tgccctctcg 20
Claims (2)
1.检测黄牛PLAG1基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测黄牛PLAG1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
以待测黄牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增PLAG1基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛PLAG1基因的拷贝数变异类型；所述的PLAG1基因的拷贝数变异区域位于PLAG1基因参考基因组序列AC_000171.1的37024位至38623位；
所述的PLAG1基因的拷贝数变异区域的扩增引物对为：
上游引物F1：5’- TGTGTATGCAAAGTCGCCCT-3’
下游引物R1：5’- CTTCAGAATCCCTGCCCAGT-3’；
所述的BTF3基因的部分片段的扩增引物对为：
上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’
下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’；
所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的两类：多拷贝型，-ΔΔCt>0.5；正常型，-0.5≤ -ΔΔCt ≤0.5；
具有正常型拷贝数变异类型的柴达木黄牛个体在生长性状管围上优于具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体；具有正常型拷贝数变异类型的夏南牛个体在生长性状十字部高上优于具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30~60 s；95℃变性10 s，60℃退火30 s，共40个循环。
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