CN113151490B - 基于黄牛loc107131166基因cnv标记的生长性状分子标记辅助选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于黄牛LOC107131166基因CNV标记的生长性状分子标记辅助选择方法：利用QPCR技术，以待测牛基因组DNA为模板，分别用两对引物P1、P2对LOC107131166基因的CNV区域和内参基因BTF3的部分片段进行扩增，最后利用2*2^‑ΔΔCt的方法计算并判定个体的拷贝数变异类型，并将结果分为多拷贝型、缺失型和正常型。本发明可在DNA水平上检测与牛生长性状密切相关的CNV标记，方法简单、快速，便于推广应用。

Description

基于黄牛LOC107131166基因CNV标记的生长性状分子标记辅 助选择方法

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于QPCR技术检测牛LOC107131166基因CNV标记的方法。

背景技术

DNA分子标记(DNA molecular marker)，是反映个体和种群间基因组特异性的DNA片段。分子标记包括限制性片段长度多态性标记(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增基因组DNA多态性标记(Random Amplified PolymorphicDNA，RAPD)、扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、微卫星DNA(Microsatellite，MS)和单核苷酸多态性标记(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)。

拷贝数变异(CNV)是指长度为1kb至数Mb的有关DNA片段拷贝数突变，包括DNA单一片段的扩增、缺失、插入、倒置等，也包括复杂的染色体扩增、缺失和插入的各种组合，其比SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)和Indels覆盖范围更广，因此，遗传效应更大。近年来SNP研究相对较多，而对CNV的研究相对较少。

CNV具有片段长度大、普遍存在、且覆盖的基因组范围广等优点，因此对畜禽性状可能造成显著影响。随着黄牛基因组测序图谱的逐渐完善，建立CNVs图谱对促进黄牛经济性状和功能性状的研究以及遗传改良具有重要意义。

邱奕雁等研究表明，PTH可能通过LOC107131166(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号通路促进共转录因子CITED1出入细胞核，特异性地调节OC及ALP基因的表达，参与骨代谢的调节。目前，尚未见有关LOC107131166基因CNV对地方黄牛及其他选育牛品种生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于黄牛LOC107131166基因CNV标记的生长性状分子标记辅助选择方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测牛LOC107131166基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以待测牛个体基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增LOC107131166基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定个体LOC107131166基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的拷贝数变异区域位于牛LOC107131166基因参考基因组序列AC_000179.1的52332801位到52340800位。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型，2*2^-ΔΔCt<2；正常型，2*2^-ΔΔC＝2。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-GGTGGAATCCCCACACTCAG-3’

下游引物R1：5’-GAGAGTCACGAGCCCTCAAC-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’；

基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为120bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增体系包括10ng/μL模板1μL以及10μmol/L的引物对P1或P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述的实时定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火20s，共39个循环。

上述检测牛LOC107131166基因拷贝数变异的方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，在云岭牛、夏南牛及皮南牛中具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优；在秦川牛中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。

优选的，所述的生长性状选自体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、管围、胸宽、胸深、臀围、腰角宽、坐骨端宽、头长、额宽、尻长、体重中的一种或多种。

优选的，所述的拷贝数变异区域作为拷贝数变异位点，与云岭牛的体高和管围具有显著的相关性、与夏南牛的体高具有显著的相关性、与皮南牛的尻长具有显著的相关性、与秦川牛的坐骨端宽具有显著的相关性。

一种检测牛LOC107131166基因拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1及引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过实时定量PCR技术检测在牛群体中LOC107131166基因的拷贝数变异类型，LOC107131166基因拷贝数变异与牛重要生长性状的关联分析结果表明，LOC107131166基因的拷贝数变异(CNV)位点具有显著影响云岭牛、夏南牛、皮南牛以及秦川牛生长性状优势的分子标记。本发明与高通量测序、基因芯片等方法相比，快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数类型，从而可以通过对个体进行早期选择，加快牛优良生长性状的选育进程。

附图说明

图1为本发明实施例中进行QPCR(LOC107131166基因)绘制的扩增曲线。

图2为本发明实施例中进行QPCR(LOC107131166基因)绘制的溶解曲线。

图3为本发明实施例中LOC107131166基因拷贝数变异在牛群体中的分布。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

基于前期的牛基因组重测序研究发现的牛LOC107131166基因CNV区域(位于LOC107131166基因参考基因组序列AC_000179.1的52332801位到52340800位)，结合LOC107131166基因的功能以及CNV的调节机制，进一步揭示了LOC107131166基因的拷贝数变异与牛生长性状的关联性，从而为地方黄牛以及相关选育品种的分子育种提供重要的依据。具体说明如下。

1.样品的采集及基因组DNA提取

(1)血样采集和数据收集

表1.试验动物样品信息

本发明中共采集605个个体的血样(表1)，样本均为2岁以上(24～36月龄)成年母牛，血液的采集方法为颈静脉采血，用冰盒带回实验室，于-80℃储存；同时进行基础数据收集和测定：采样时对相应个体进行基础数据(体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、管围、胸宽、胸深、臀围、腰角宽、坐骨端宽、头长、额宽、尻长以及体重等生长性状)采集和录入，以用于后期的关联分析。

(2)血样DNA的提取

利用酚-氯仿法对样品进行基因组DNA提取：

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取2mL于2.0mL离心管中，4℃、12000rpm离心10min；弃掉液体，保留沉淀，加入1.5mL的PBS缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮，冰上温和摇动15min；4℃、12000rpm离心10min，弃掉液体，保留沉淀；

②将沉淀捣碎，呈絮状，在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL和蛋白酶K 6μL，在恒温水浴箱中37℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；

③加入1mL Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌2.0mL离心管。

④加入0.5mL的饱和酚和0.5mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min；将上层水相转入另一灭菌的2.0mL离心管。

⑤加入1mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃、12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到1.5mL离心管中；

⑥加入1mL预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min；4℃、12000rpm离心10min，弃去乙醇；

⑦加入70％乙醇1mL，温和摇动10min；4℃、12000rpm离心10min，弃乙醇；重复漂洗一次；室温放置30min，60℃烘箱30s，使乙醇挥发干净；

⑧加入超纯水50μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

2.目的基因及内参基因的扩增

在NCBI上查找到重测序中筛选出的LOC107131166基因(目的基因)CNV区域的序列，以其为模板，利用Prime 5.0软件设计被包含在此区域的引物，并在NCBI_BLAST中进行比对。引物序列如下(引物对P1)，扩增目的片段大小为120bp：

上游引物F1：5’-GGTGGAATCCCCACACTCAG-3’

下游引物R1：5’-GAGAGTCACGAGCCCTCAAC-3’

同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(BTF3基因)中特定片段(166bp)的引物，引物序列如下(引物对P2)：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’

3.实时定量PCR(QPCR)

QPCR扩增体系如表2所示。

表2.QPCR的扩增体系

QPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：95℃，2min；

(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火20s，39个循环。

扩增曲线平滑，表明QPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适(图1)；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(图2)。通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于QPCR分析。

4.CNV类型的计算

每个样品分别用目的基因和内参基因的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T内参基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T内参基因})_对照组；实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本，C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。之后进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

当目的基因为正常型(Median)序列时，计算出归一化值2*2^-ΔΔCt＝2。当目的基因为缺失型(Loss)序列时，计算出归一化值2*2^-ΔΔCt<2。当目的基因为多拷贝型(Gain)序列时计算出归一化值2*2^-ΔΔCt>2。

5.数据分析

统计检测群体中各种类型(Loss,Median和Gain)的个体数，并统计各种类型的频率。

利用SPSS(25.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响生长性状指标的因素的数据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数变异类型；E_ijk为随机误差。数据处理的结果如表3-表6所示。

表3.LOC107131166基因CNV与云岭牛不同生长性状关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。

关联分析结果表明(见表3)：LOC107131166基因在云岭牛中具有缺失型(Loss)拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与体高和管围这两个生长性状具有显著的相关性(P<0.05)。因此，LOC107131166基因的Loss类型可以作为一个提高云岭牛生长性状的候选分子标记，加快黄牛优良生长性能的选育进程。

表4.LOC107131166基因CNV与夏南牛不同生长性状关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。

关联分析结果表明(见表4)：LOC107131166基因在夏南牛中具有缺失型(Loss)拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与体高这个生长性状具有显著的相关性(P<0.05)。因此，LOC107131166基因的Loss类型可以作为一个提高夏南牛生长性状的候选分子标记，加快黄牛优良生长性能的选育进程。

表5.LOC107131166基因CNV与皮南牛不同生长性状关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。

关联分析结果表明(见表5)：LOC107131166基因在皮南牛中具有缺失型(Loss)拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与尻长这个生长性状具有显著的相关性(P<0.05)。因此，LOC107131166基因的Loss类型可以作为一个提高皮南牛生长性状的候选分子标记，加快黄牛优良生长性能的选育进程。

表6.LOC107131166基因CNV与秦川牛不同生长性状关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。

关联分析结果表明(见表6)：LOC107131166基因在秦川牛中具有正常型(Median)拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与坐骨端宽这个生长性状具有显著的相关性(P<0.05)。可见LOC107131166基因的拷贝数变异对秦川牛来说并不是有利变异，因此，选育Median类型的个体可以作为一个提高秦川牛生长性状的候选分子标记，加快黄牛优良生长性能的选育进程。

总之，本发明根据重测序得到的牛基因组序列中发生拷贝数变异的区域设计特异性引物，然后以牛基因组DNA为模板，进行QPCR扩增，并以BTF3基因为内参基因，利用2*2^-ΔΔCt方法计算、判定个体的拷贝数类型。通过检测牛LOC107131166基因的拷贝数变异情况，并依据不同的拷贝数变异类型与生长性状的关联分析，寻找到了具有优势生长性状的拷贝数类型，从而为牛的分子育种提供基础资料，有利于加快牛的种质资源改良工作。

<110> 河南省畜牧总站

<120>基于黄牛LOC107131166基因CNV标记的生长性状分子标记辅助选择方法

<160> 4

<210>1

<211>20

<212> DNA

<213>F1

<400> 1

ggtggaatcc ccacactcag 20

<210>2

<211>20

<212> DNA

<213>R1

<400> 2

gagagtcacg agccctcaac 20

<210>3

<211>20

<212> DNA

<213>F2

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210>4

<211>20

<212> DNA

<213>R2

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (3)

1.一种检测牛LOC107131166基因拷贝数变异的方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测牛LOC107131166基因拷贝数变异的方法包括以下步骤：

以待测牛基因组DNA为模板，通过实时定量PCR分别扩增LOC107131166基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定牛LOC107131166基因的拷贝数变异类型；

所述的拷贝数变异区域位于LOC107131166基因参考基因组序列AC_000179.1的52332801位到52340800位；

所述的拷贝数变异类型是根据2*2^−ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^−ΔΔCt >2；缺失型，2*2^−ΔΔCt<2；正常型，2*2^−ΔΔCt=2；

所述的拷贝数变异区域的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F1：5’- GGTGGAATCCCCACACTCAG -3’

下游引物R1：5’- GAGAGTCACGAGCCCTCAAC -3’ ；

所述的BTF3基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’ ；

在云岭牛中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状体高和管围上优于具有正常型拷贝数变异类型的个体；

在夏南牛中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状体高上优于具有正常型、多拷贝型拷贝数变异类型的个体；

在皮南牛中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状尻长上优于具有正常型、多拷贝型拷贝数变异类型的个体；

在秦川牛中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状坐骨端宽上优于具有缺失型、多拷贝型拷贝数变异类型的个体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的扩增体系包括10 ng/μL模板1 μL以及10 μmol/L的扩增引物对所对应的上、下游引物各0.5 μL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的反应程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，共39个循环。

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