CN110643718B - 一种检测山羊opn4基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测山羊OPN4基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR，以贵州白山羊、贵州黑山羊的基因组DNA为模板，扩增山羊OPN4基因的CNV标记位点，再以扩增的山羊MC1R基因部分片段作为内参，然后通过2*2^‑ΔΔCt的方法计算并判定个体的拷贝数变异类型。本发明可在DNA水平上检测与山羊地方品种生长性状密切相关的CNV标记，加快山羊良种繁育速度，并且该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种检测山羊OPN4基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于实时定量PCR技术检测地方山羊品种(贵州黑山羊、白山羊)OPN4基因CNV标记的方法。

背景技术

拷贝数变异(CNV)是由基因组重排引起的遗传变异的一种形式。异常片段的范围从50bp到几个Mb，主要表现在长片段的缺失、插入，重组和复杂变异。对CNV机制的深入研究已经在人类和其他动物的正常表型变异中取得了实质性进展。通过改变位于CNV区域的基因的结构和剂量效应，许多CNV基因座在正常表型的变异性中起重要作用。例如，Ma等人通过全基因组检测拷贝数变异，研究了宁夏滩羊颜色变化的原因。Fontanesi等发现ASIP基因的CNV和错义突变导致山羊的不同毛皮颜色。

与单核苷酸多态性(SNP)相比，CNV突变范围广、序列较长，检测和研究较容易，因此在动物遗传育种中具有广阔的应用前景。在用于检测已知CNV的各种方法中，实时荧光定量PCR(qPCR)由于其准确、简单和快速的优点而被广泛用于CNV的检测。qPCR选择基因的单个拷贝作为内部参考基因，然后使用2*2^-ΔΔCt确定相对拷贝数及拷贝数变异类型。

分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

OPN4基因可以影响动物脂肪代谢以及睡眠调节，对动物的生长发育有着一定影响。高通量测序发现山羊OPN4基因内存在2000bp的拷贝数变异(CNV)。目前，尚未见到山羊OPN4基因的CNV对地方山羊品种(贵州黑山羊、白山羊)生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测山羊OPN4基因CNV标记的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊OPN4基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以山羊(例如，贵州白山羊或贵州黑山羊)基因组DNA为模板，以引物对P和R为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增OPN4基因的CNV区域部分片段和作为参考的MCIR基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊个体OPN4基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的OPN4基因的CNV区域为OPN4基因(NC_030835.1)候选区域Chr28：4401501-4403500。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型，2*2^-ΔΔCt<2；正常型，2*2^-ΔΔCt＝2。

优选的，所述的引物对P为：

上游引物F：5’-CGTGATACCAGGCTCCAGA -3’

下游引物R：5’-ACGGCGAGGTTGATAATGA-3’；

所述的引物对R为：

上游引物F：5’-CTCGTTGGCCTCTTCATAGC-3’

下游引物R：5’-GAAGTTCTTGAAGATGCAGCC-3’；

基于引物对P扩增的PCR产物片段大小为233bp，引物对R扩增的PCR产物片段大小为267bp。

优选的，所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括：10ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的引物对P或引物对R所对应的上、下游引物各0.5μL以及

Premix Ex Taq^TM II6.25μL和ddH₂O 4.25μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

上述检测山羊OPN4基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，在贵州黑山羊群体中，具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优；在贵州白山羊群体中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。

优选的，所述生长性状例如为体长、体重。

本发明的有益效果体现在：

本发明公开的检测OPN4基因拷贝数变异的方法，通过实时定量PCR技术检测山羊(例如，贵州黑山羊、白山羊)的拷贝数变异情况，检测结果可以用于鉴定与提高山羊生长性状相关(例如，体长、体重)的候选分子遗传标记(CNV标记)。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明提供的山羊OPN4基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择；

(2)检测山羊OPN4基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；

(3)山羊OPN4基因拷贝数变异的检测，为山羊生长发育的分子标记辅助选择提供依据，加快山羊选育进程。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR绘制的扩增曲线。

图2为本发明实施例中进行qPCR绘制的溶解曲线。

具体实施方式

本发明利用实时荧光定量PCR对山羊OPN4基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，通常包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库找到OPN4基因序列，再用Primer5软件进行引物设计；

(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况，利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与山羊生长性状等进行关联分析，筛选到与山羊生长性状相关的CNV标记；

(3)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的山羊选育。

1.山羊样本采集

黑山羊(n＝186，贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司的肉羊养殖科研示范基地，2018年3月采集)以及白山羊(n＝98，贵州省德江县，2018年8月采集)采取耳组织，置于装有储存液的1.5离心管中，用冰盒带回实验室，于-80℃储存；采样同时对相应个体进行基础数据(体尺数据)采集和录入，以用于后续的关联分析。

2.耳组织基因组DNA的提取

(1)取30mg组织样品放入2.0mL离心管，用手术剪将组织样剪碎。

(2)每只离心管内加入600μL SE缓冲液和20μL的蛋白酶K(20mg/mL)，经37℃水浴过夜消化(12～16h)。

(3)加入200μL的6mol/L NaCl充分混匀后，加入1mL的Tris饱和酚，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的2.0mL离心管。

(4)加入0.5mL的Tris饱和酚和0.5mL的氯仿，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的2.0mL离心管。

(5)加入1mL氯仿，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

(6)加入1mL预冷无水乙醇(–20℃)，充分混匀至絮状沉淀析出，放置–20℃下30min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。

3.目的基因及内参基因的扩增用

以NCBI数据库公布的山羊OPN4基因序列(NC_030835.1)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即OPN4基因(目的基因)组序列的4401501bp-4403500bp区域，利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR引物对(引物对P，PCR产物片段大小为233bp)检测OPN4基因在该区域内的拷贝数变异，同时，以NCBI所公布的山羊MC1R基因序列(NC_030825.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因(MC1R基因)中一段267bp的序列的qPCR引物(引物对R)。引物对序列信息如表1所示。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

注：F表示上游引物，R表示下游引物。

4.实时荧光定量PCR

实时定量PCR的扩增体系以12.5μL计，包括：10ng/μL模板DNA(耳组织基因组DNA)1μL、10μmol/L的引物对P或引物对R所对应的上、下游引物各0.5μL以及

Premix ExTaq TM II 6.25μL和ddH₂O 4.25μL。

实时定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

5.个体拷贝数变异类型判定

每个样品分别用目的基因序列和参考基因序列的引物进行扩增，并且每对引物设定3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(Ct_{实验组目的基因}-Ct_{实验组参考基因})-(Ct_{对照组目的基因}-Ct_{对照组参考基因})。实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-ΔΔCt表示的是实验组目的基因序列的拷贝数相对与对照组的倍数。

根据公式计算得出每个待测个体的2*2^-ΔΔCt，并根据CNV类型的判定标准：多拷贝型，CN>2；缺失型，CN<2；正常型，CN＝2，判定检测的山羊个体的CNV类型。C_t即Cyclethreshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

6.数据处理

统计检测群体中各种拷贝数变异类型的个体数，并统计各种类型的频率。计算公式如下：

PC＝NC/N

其中，PC代表某种拷贝数类型的频率；NC代表群体中具有C(Gain、Median或Loss)。

关联分析模型：在数据处理中，根据影响生长性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生产性状效应。固定模型为：Y_ijk＝μ+A_i+G_j+e_ijk其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，G_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。

数据处理的结果如表2、表3所示。

表2.贵州黑山羊OPN4基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。括号里面的数值表示拷贝数类型的频数。

表3.贵州白山羊OPN4基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。括号里面的数值表示拷贝数类型的频数。

根据基因型的统计结果(表2、表3中的n1、n2、n3)，确定了各山羊种群OPN4基因(NC_030835.1)组序列的4401501bp-4403500bp内的拷贝数变异位点在采样的山羊中的分布，符合多态性。

关联分析结果表明(见表2、表3)：针对上述OPN4基因的CNV位点，在贵州黑山羊中具有多拷贝型的个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与体长性状具有显著的相关性；在贵州白山羊中具有正常型的个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与体重性状具有显著的相关性。

以上结果表明，OPN4基因的该CNV位点可以作为一个提高山羊生长性状的候选分子遗传标记位点，加快山羊优良品种的选育进程。

<110> 贵州工程应用技术学院

<120> 一种检测山羊OPN4基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgtgatacca ggctccaga 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

acggcgaggt tgataatga 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<400> 3

ctcgttggcc tcttcatagc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gaagttcttg aagatgcagc c 21

Claims (3)

1.一种检测山羊OPN4基因CNV标记的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测山羊OPN4基因CNV标记的方法包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，分别通过实时定量PCR扩增OPN4基因的CNV区域部分片段及作为参考的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊OPN4基因的拷贝数变异类型；

所述的CNV区域定位于山羊OPN4基因参考基因组序列NC_030835.1的4401501位到4403500位；

所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-∆∆Ct将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^-∆∆Ct >2；缺失型，2*2^-∆∆Ct <2；正常型，2*2^-∆∆Ct =2；

所述的OPN4基因的CNV区域部分片段的扩增引物对为：

上游引物F：5’ - CGTGATACCAGGCTCCAGA - 3’

下游引物R：5’ - ACGGCGAGGTTGATAATGA - 3’ ；

所述的MC1R基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F：5’ - CTCGTTGGCCTCTTCATAGC - 3’

下游引物R：5’ - GAAGTTCTTGAAGATGCAGCC - 3’ ；

所述山羊为贵州白山羊或贵州黑山羊；

具有缺失型拷贝数变异类型的贵州黑山羊个体的体长较短，具有正常型拷贝数变异类型的贵州白山羊个体体重较大。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的扩增体系包括10 ng/μL模板DNA 1 μL，及10 μmol/L的扩增引物对所对应的上、下游引物各0.5μL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火1min，共40个循环。

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