CN117660667B - 一种与翘嘴鳜生长性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记，包括SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP 12:17111862中的一个或多个，其中SNP 20:31934096的突变类型为A/G，AA基因型为优选基因型；SNP 14:13719188的突变类型为A/C，AA基因型为优选基因型；SNP 12:17111862的突变类型为A/C，AA基因型为优选基因型；还公开了检测所述SNP分子标记的引物、试剂盒和选育具有优良生长性状的翘嘴鳜的方法，以及检测上述SNP分子标记试剂、引物、试剂盒或方法在选育具有优良生长性状的翘嘴鳜中的应用。
Description
技术领域
本发明属于水产动物分子标记技术领域，具体涉及一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）隶属鲈形目（Perciformes）、真鲈科（Percichthyidae）、鳜属（Siniperca），因其肉味鲜美、营养丰富，而深受广大消费者的喜爱，属名贵淡水养殖鱼类。翘嘴鳜为凶猛的肉食性鱼类，生长速度是决定其在养殖过程中生产成本和经济效益的关键因素之一。生长性状的遗传选育已成为提高动物生长性状的重要手段。生长过程受自身遗传和外部环境等多种因素影响。
针对鳜鱼生长性状的选育目前仍采取传统的选育方法，然而翘嘴鳜从幼鱼到性成熟需要1-2年，采用传统选择育种技术需要10年以上才能取得显著遗传进展，耗时较长。近年来，通过结合分子标记辅助选择育种，将鱼类的表型特征作为选育目标的选育方法逐渐成为主流，在优良性状的遗传选育中得到广泛应用。
分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms , SNP）是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。因其位点分布丰富，具有较高的信息含量，且SNP位点信息获取简单快捷，现已成为重要的分子标记。通过将SNP位点与重要性状进行关联分析，获取与性状紧密关联的分子标记用于选育，是现代水产动物分子育种技术的重要手段，在水产经济动物遗传育种中发挥重要作用。对翘嘴鳜开展分子标记的研究和开发，培育出具有生长快、产量高等优良生长性状的新品种，是翘嘴鳜养殖产业壮大和健康发展的必要条件。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记。
本发明的目的还在于提供一种检测上述SNP分子标记的引物、试剂盒以及利用所述引物或试剂盒选育具有优良生长性状的翘嘴鳜的方法。
本发明的最后一个目的在于提供检测上述SNP分子标记的试剂、引物、试剂盒或方法在选育具有优良生长性状的翘嘴鳜中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP 12:17111862中的一个或多个，其中所述SNP 20:31934096位于翘嘴鳜20号染色体的31934096位碱基处，其突变类型为A/G；所述SNP 14:13719188位于翘嘴鳜14号染色体的13719188位碱基处，其突变类型为A/C；所述SNP 12:17111862位于翘嘴鳜12号染色体的17111862位碱基处，其突变类型为A/C。
可选地，所述SNP 20:31934096中，AA基因型为优选基因型，该基因型个体生长性状优于AG和GG基因型；所述SNP 14:13719188中，AA基因型为优选基因型，该基因型个体生长性状优于AC和CC基因型；所述SNP 12:17111862中，AA基因型为优选基因型，该基因型个体生长性状优于AC和CC基因型。
可选地，所述生长性状包括体重、体长、全长、体高和体厚。
因此，本发明提供了一种与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP 12:17111862中的一个或多个，其中SNP20:31934096位于翘嘴鳜20号染色体的31934096位碱基处，突变类型为A/G，包括AA基因型、AG基因型和GG基因型，且AA基因型为优选基因型，该基因型个体生长形状优于AG和GG基因型；SNP 14:13719188位于翘嘴鳜14号染色体的13719188位碱基处，突变类型为A/C，包括AA基因型、AC基因型和CC基因型，且AA基因型为优选基因型，该基因型个体生长形状优于AC和CC基因型；SNP 12:17111862位于翘嘴鳜12号染色体的17111862位碱基处，突变类型为A/C，包括AA基因型、AC基因型和CC基因型，且AA基因型为优选基因型，该基因型个体生长形状优于AC和CC基因型，其中所述生长性状包括个体的体重、体长、全长、体高和体厚等。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种检测上述与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记的引物，所述引物包括用于检测SNP 20:31934096的上游引物SNP 20:31934096-F和下游引物SNP 20:31934096-R、用于检测SNP 14:13719188的上游引物SNP 14:13719188-F和下游引物SNP 14:13719188-R以及用于检测SNP 12:17111862的上游引物SNP 12:17111862-F和下游引物SNP 12:17111862-R中的一对或几对，其中所述上游引物SNP 20:31934096-F和所述下游引物SNP 20:31934096-R的序列分别如SEQ ID NO：1所示和SEQ ID NO：2所示，所述上游引物SNP 14:13719188-F和下游引物SNP 14:13719188-R的序列分别如SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示，所述上游引物SNP 12:17111862-F和下游引物SNP 12:17111862-R的序列分别如SEQ ID NO：5所示和SEQ ID NO：6所示。
具体地：
所述SNP 20:31934096的上游引物SNP 20:31934096-F的序列如下：
5'-TCAAAGCAGCAAGTAGTCA-3'（如SEQ ID NO：1所示）；
所述SNP 20:31934096的下游引物SNP 20:31934096-R的序列如下：
5'-CTTGAGATAAATGTAGGGT-3'（如SEQ ID NO：2所示）；
所述SNP 14:13719188的上游引物SNP 14:13719188-F的序列如下：
5'-ATCAATGGCTTGTCCTTC-3'（如SEQ ID NO：3所示）；
所述SNP 14:13719188的下游引物SNP 14:13719188-R的序列如下：
5'-TCAATGTGACACCCAACA-3'（如SEQ ID NO：4所示）；
所述SNP 12:17111862的上游引物SNP 12:17111862-F的序列如下：
5' -TACAAACACTCAGGGAGGC-3'（SEQ ID NO：5所示）；
所述SNP 12:17111862的下游引物SNP 12:17111862-R的序列如下：
5'-TGCCCATCTTGCACAAAG-3'（如SEQ ID NO：6所示）。
本发明还提供了一种检测与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。
进一步地，本发明还提供了一种选育具有优良生长性状的翘嘴鳜的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测翘嘴鳜个体鳍条DNA；
（2）利用上述的引物对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）对扩增产物进行测序分析，确定待测翘嘴鳜个体SNP分子标记的基因型，然后分析确定待测翘嘴鳜个体是否具有优良生长性状潜力。
可选地，步骤（3）中所述分子标记为SNP 20:31934096时，AA基因型的个体生长性状优于AG和GG基因型；所述分子标记为SNP 14:13719188时，AA基因型的个体生长性状优于AC和CC基因型；所述分子标记为SNP 12:17111862时，AA基因型的个体生长性状优于AC和CC基因型。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：检测上述SNP分子标记的试剂在选育具有优良生长性状的翘嘴鳜中的应用。
本发明还进一步公开了上述引物、试剂盒或方法在选育具有优良生长性状的翘嘴鳜中的应用。
本发明具有以下优点：
（1）本发明通过全基因组关联分析解析翘嘴鳜混合家系群体的生长性状，筛选到三个与个体体重、体长、全长、体高和体厚等生长性状关联的候选SNP位点，分别为SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP 12:17111862，并且在另一个翘嘴鳜群体中进一步验证确定了这些SNP位点与生长性状相关联；
（2）本发明SNP标记通过引物即可判定，操作简单方便，且结果准确可靠；
（3）本发明提供的SNP位点及引物和试剂盒在翘嘴鳜分子标记辅助育种中具有应用前景，该SNP分子标记不受个体年龄、性别等因素的影响，可用于早期翘嘴鳜的筛选，能够显著缩短育种时间。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是实施例1中实验翘嘴鳜生长数据， A.体长直方图及拟合曲线，B .体重直方图和拟合曲线，C.体高直方图和拟合曲线，D.全长直方图和拟合曲线，E .体厚直方图和拟合曲线；
图2是实施例1中翘嘴鳜生长性状全基因组关联分析QQ图， A.与全长相关的SNPs的QQ图，B.与体重相关的SNPs的QQ图，C.与体厚相关的SNPs的QQ图，D.与体长相关的SNPs的QQ图，E.与体高相关的SNPs的QQ图，F.与所有性状相关的SNPs的QQ图；
图3是实施例1中翘嘴鳜的曼哈顿图，其中A为身高，B为体长，C为全长，D为体重和E为体厚，注:横实线表示全基因组显著性阈值，横虚线表示提示性阈值；
图4是实施例2中SNP位点SNP 20:31934096不同基因型体重性状统计，其中A：测序验证结果，B：全基因组高通量测序筛选结果（BG:极大群体；SG：极小群体）；
图5是实施例2中SNP位点SNP 14:13719188不同基因型体重性状统计，其中A：测序验证结果，B：全基因组高通量测序筛选结果（BG:极大群体；SG：极小群体）；
图6是实施例2中SNP位点SNP 12:17111862不同基因型体重性状统计，其中A：测序验证结果，B：全基因组高通量测序筛选结果（BG:极大群体；SG：极小群体）。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。
为更为详细地说明本发明，以下通过实施例进行展开。需要强调的是，以下实施例仅为了解释本发明，并不用于限制本发明的实质范围或内容。
实施例1：翘嘴鳜生长性状相关SNP分子标记的筛选
实验翘嘴鳜饲养于广东梁氏水产种业有限公司，为6月龄混合家系。
随机取500尾实验鱼，测量记录每尾鱼的生长性状指标，并同时采集保存每尾鱼的尾鳍样品于95%酒精-20℃保存，用于DNA提取和测序，如图1所示，实验群体生长数据符合正态分布。
使用HiPure Tissue DNA Mini Kit （Magen,中国）试剂盒提取鳍条DNA。所有DNA均经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）判断电泳结果，以保证基因组完整性。合格DNA样品随后用Qubit 3.0 测量浓度，并统一调整至30ng/μL。
样品随后按标准流程进行建库，合格文库使用Il1umina平台测序。获得的原始测序数据经质控和处理后，使用Bowtie version 2.0 (Langmead and Salzberg, 2012)软件将所有的测序Reads比对到参考基因组上（GenBank：GCA_011952085.1），使用samtools软件的标准流程检测SNP，进行基因分型。获得SNP位点共计49940个高质量SNP位点（图2）。
使用Tassel软件的混合线性模型（Mixed linear model，MLM）进行翘嘴鳜个体的体重、体长、全长、体高和体厚进行全基因组关联（Genome-wide association studies，GWAS）分析。随后，基于Bonferroni校正，将全基因组显著性SNP标记阈值设定为-log10(Pvalue = 0.05/49940) =1.00 × 10e-4 （图3）。
经关联分析发现与生长性状极显著关联的SNP标记6个，与生长性状显著关联的SNP标记25个，具体数据见表1。
表1 与生长性状显著相关SNP位点信息
注:Chr:染色体；F:自由度；PVE %:解释的表型变异；SNP ID显示为染色体/位置；“*”表示SNP极显著，表型解释率参考基因组为GenBank：GCA_011952085.1。
从表1中可知：
SNP 20:31934096同时与翘嘴鳜体重、体长、全长、体高和体厚相关，它位于20号染色体第31934096个碱基处，突变类型为A/G，命名为SNP 20:31934096，其中AA基因型为优选基因型，其生长性能更佳，该基因型个体生长性状优于AG和GG基因型。
SNP 14:13719188同时与翘嘴鳜体重、体长、全长、体高和体厚相关，它位于翘嘴鳜14号染色体的13719188位碱基处，其突变类型为A/C，命名为SNP 14:13719188，其中AA基因型为优选基因型，其生长性能更佳，该基因型个体生长性状优于AC和CC基因型。
SNP 12:17111862同时与翘嘴鳜体重、体长、全长、体高和体厚相关，它位于翘嘴鳜12号染色体的17111862位碱基处，其突变类型为A/C，命名为SNP 12:17111862，其中AA基因型为优选基因型，其生长性能更佳，该基因型个体生长性状优于AC和CC基因型。
以下通过实施例2进行验证。
实施例2：翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记验证
验证试验使用不同的翘嘴鳜群体，随机取100尾实验鱼，测量记录每尾鱼体重性状指标，并同时采集保存每尾鱼的尾鳍样品于DNA提取，DNA提取具体流程同实施例1。
上游引物SNP 20:31934096-F：5'-TCAAAGCAGCAAGTAGTCA-3'（如SEQ ID NO：1所示）；
下游引物SNP 20:31934096-R：5'- CTTGAGATAAATGTAGGGT-3'（如SEQ ID NO：2所示）。
PCR扩增总体积20μL，具体反应体系如表2。
表2 PCR扩增反应体系
具体扩增程序如下：95℃预变性5 min；40个循环的95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸5 min。
随后，以上述提取的DNA为模板，以SEQ ID NO：1所述上游引物SNP 20:31934096-F和SEQ ID NO：2所示下游引物SNP 20:31934096-R进行PCR扩增，获得包含SNP 20:31934096的基因片段，如SEQ ID NO：7所示，突变位点位于第151位，其突变类型为A/G。
TTAATCTGACTCTAAGTCTTAACTACTTTATAAGTCCAATACTAAATTAATTTAAGAAACAATACAAAGTCCCTTCTTGTAAGAATTCACAGCACCAAGGATTCAGTTCAAAGCAGCAAGTAGTCAGCTACAAACAACAAAGTGACATATGTAATGTTTCTACATATTAAAGCACAAAAACCCTACATTTATCTCAAGGTGTAAACCTCCGTACGCATTGAATCCTTTTAGAAAATCAGATGGATTGTTTTCTGACAGCTTTTACATCATGAAGAATTTAAATCATGCCGGCCCTCGCAG（SEQ ID NO：7）。
取2μL反应产物于1 %琼脂糖凝胶电泳检测，合格样品用于后续测序，以确定每个个体样本在SNP 20:31934096的基因型。
随后统计了不同基因型个体的体重数据，分析结果如图4所示。
图4显示了对SNP位点SNP 20:31934096进行验证的结果。A：全基因组高通量测序筛选结果，B：测序验证结果（BG:极大群体；SG：极小群体；）。
图4中的结果表明：在翘嘴鳜中，SNP 20:31934096 不同基因型个体间体重存在显著差异；其中，AA基因型个体在极大群体中占比较多，在极小群体中占比较少；而GG基因型个体在极大群体中占比较少，在极小群体中占比较多。
SNP位点SNP 14:13719188的验证方法同上，采用的引物为：
SNP 14:13719188的上游引物SNP 14:13719188-F：
5'-ATCAATGGCTTGTCCTTC-3'（如SEQ ID NO：3所示）；
SNP 14:13719188的下游引物SNP 14:13719188-R：
5'-TCAATGTGACACCCAACA-3'（如SEQ ID NO：4所示）；
获得包含SNP 14:13719188的基因片段如SEQ ID NO：8所示，突变位点位于第50位，其突变类型为C/A。
TGTCAAAGTAGCGTGTTCACATCAATGGCTTGTCCTTCATGTTGTCTTTCATTTTAAGTACTGTTGTTTAATCAGGCTGTTGGGTGTCACATTGATCAGC（SEQ ID NO：8）。
SNP 14:13719188的结果如图5所示，A：测序验证结果，B：全基因组高通量测序筛选结果（BG:极大群体；SG：极小群体；）。
图5中的结果表明：在翘嘴鳜中，SNP 14:13719188不同基因型个体间体重存在显著差异；其中，AA基因型个体在极大群体中占比较多，在极小群体中占比较少；而CC基因型个体在极大群体中占比较少，在极小群体中占比较多。
SNP位点SNP 12:17111862的验证方法同上，采用的引物为：
SNP 12:17111862的上游引物SNP 12:17111862-F：
5' -TACAAACACTCAGGGAGGC-3'（SEQ ID NO：5所示）；
SNP 12:17111862的下游引物SNP 12:17111862-R：
5'-TGCCCATCTTGCACAAAG-3'（如SEQ ID NO：6所示）。
获得包含SNP 12:17111862的基因片段如SEQ ID NO：9所示，突变位点位于第100位，其突变类型为A/C。
TACAAACACTCAGGGAGGCCATTGCCATGGGAACAGCCGGTCTCTCTCATTGGGATAGCAGGTCATCAGCAGAGTGCGTGCATGTTTCCATGTGTGTCTAGGAACGTTTGTGTGTCTTTGTGCAAGATGGGCAGAAAAAAATGGGGGAAATATGCATGAGAAGGGGGGGGGTCTGAAAATAGAAAGAGAGGATGTGAGAT（SEQ ID NO：9）。
SNP 12:17111862的结果如图6所示，A：测序验证结果，B：全基因组高通量测序筛选结果（BG:极大群体；SG：极小群体；）。
图6中的结果表明：在翘嘴鳜中，SNP 12:17111862不同基因型个体间体重存在显著差异；其中，AA基因型个体在极大群体中占比较多，在极小群体中占比较少；而CC基因型个体在极大群体中占比较少，在极小群体中占比较多。
综上，SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP 12:17111862与翘嘴鳜生长性状显著关联，其基因型可分别通过一对引物判定，操作简单可靠，这三个SNP位点在翘嘴鳜分子标记辅助育种中具有应用前景。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
Claims (4)
1.一种选育具有优良生长性状的翘嘴鳜的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取待测翘嘴鳜个体鳍条DNA；
（2）利用检测与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记的引物对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
所述SNP分子标记选自SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP 12:17111862中的一个或多个，其中所述SNP 20:31934096位于如SEQ ID NO：7所示序列的第151位，其突变类型为A/G；所述SNP 14:13719188位于如SEQ ID NO：8所示序列的第50位，其突变类型为A/C；所述SNP 12:17111862位于如SEQ ID NO：9所示序列的第100位，其突变类型为A/C；
（3）对扩增产物进行测序分析，确定待测翘嘴鳜个体SNP分子标记的基因型，然后分析确定待测翘嘴鳜个体是否具有优良生长性状潜力，所述生长性状为体重；
步骤（3）中所述分子标记为SNP 20:31934096时，AA基因型的个体体重优于AG和GG基因型；所述分子标记为SNP 14:13719188时，AA基因型的个体体重优于AC和CC基因型；所述分子标记为SNP 12:17111862时，AA基因型的个体体重优于AC和CC基因型。
2.根据权利要求1所述选育具有优良生长性状的翘嘴鳜的方法，其特征在于：步骤（2）中所述引物包括用于检测SNP 20:31934096的上游引物SNP 20:31934096-F和下游引物SNP20:31934096-R、用于检测SNP 14:13719188的上游引物SNP 14:13719188-F和下游引物SNP14:13719188-R以及用于检测SNP 12:17111862的上游引物SNP 12:17111862-F和下游引物SNP 12:17111862-R中的一对或几对，其中所述上游引物SNP 20:31934096-F和所述下游引物SNP 20:31934096-R的序列分别如SEQ ID NO：1所示和SEQ ID NO：2所示，所述上游引物SNP 14:13719188-F和下游引物SNP 14:13719188-R的序列分别如SEQ ID NO：3所示和SEQID NO：4所示，所述上游引物SNP 12:17111862-F和下游引物SNP 12:17111862-R的序列分别如SEQ ID NO：5所示和SEQ ID NO：6所示。
3.检测与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记的试剂在选育具有优良生长性状的翘嘴鳜中的应用；
与翘嘴鳜生长性状相关的SNP分子标记选自SNP 20:31934096、SNP 14:13719188和SNP12:17111862中的一个或多个，其中所述SNP 20:31934096位于如SEQ ID NO：7所示序列的第151位，其突变类型为A/G；所述SNP 14:13719188位于如SEQ ID NO：8所示序列的第50位，其突变类型为A/C；所述SNP 12:17111862位于如SEQ ID NO：9所示序列的第100位，其突变类型为A/C；
所述生长性状为体重；
所述分子标记为SNP 20:31934096时，AA基因型的个体体重优于AG和GG基因型；所述分子标记为SNP 14:13719188时，AA基因型的个体体重优于AC和CC基因型；所述分子标记为SNP 12:17111862时，AA基因型的个体体重优于AC和CC基因型。
4.权利要求1或权利要求2所述的方法在翘嘴鳜体重分子标记辅助育种中的应用；
所述分子标记为SNP 20:31934096时，AA基因型的个体体重优于AG和GG基因型；所述分子标记为SNP 14:13719188时，AA基因型的个体体重优于AC和CC基因型；所述分子标记为SNP 12:17111862时，AA基因型的个体体重优于AC和CC基因型。
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