CN103305506A - 一种鳜鱼驯食性状相关snp分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于鱼的育种技术领域，涉及分子标记技术领域。本发明具体涉及一种用于检测易驯食人工饲料鳜鱼相关基因即胃蛋白酶基因多态性的SNP分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明为鳜鱼驯食人工饲料鳜鱼相关基因多态性的检测提供了新的标记，可用于鳜鱼的标记辅助选择中。

Description

一种鳜鱼驯食性状相关SNP分子标记

本发明属于分案申请，原案申请号为2011100511925。 

技术领域

本发明属于鱼类分子标记制备技术领域，具体涉及一种鳜鱼驯食性状相关SNP分子标记，所述的分子标记可应用于鳜鱼育种基因型的辅助选择。 

背景技术

鳜又称鳜鱼(Siniperca chuatsi)是淡水名贵鱼类，隶属于鲈形目鲈亚目，俗称桂花鱼、胖鳜、季花鱼等。翘嘴鳜由于其具有生长速度快等特性，已成为中国鳜养殖中的主养品种，但这种鱼食性奇特，终生以活鱼虾为食，通常情况下绝对拒食死饵或配合饲料，这种现象在鱼类中十分罕见^[1]。鳜商品化养殖历来以投喂活饵进行，鳜鱼苗出膜即以其它种鱼苗为食，因此自然条件下苗种成活率低，生产过程中，苗种培育及其活饵料供应成了其养殖生产迅速大规模发展的两大制约因素。能否使鳜通过人工驯化，转为摄食非活饵，已成为鳜鱼养殖业发展的关键。近年来，我国的鳜鱼人工饲料研究取得了突破性进展，吴遵霖等^[2]在lm³网箱中用配合饲料驯饲鳜鱼幼鱼获得成功，共驯化幼鳜4642尾，存活率达89.6％，饲料系数1.68-1.78。梁旭方等^[3-4]在幼鳜食性驯化取得成功的基础上，又在水库网箱中开展了鲜鱼、鱼块和配合饲料驯饲鳜鱼2龄鱼种(体长17-21cm)的试验，试验亦获得成功，驯化率分别达到100％、100％和88.4％，饲料系数分别为1.6、1.4和2.7，共驯化出鳜鱼2龄鱼种4047尾。配合饲料驯饲成功，只是提供整个养殖过程一个良好的基础和开端。在长期的养殖过程中，我们发现：通过驯养，能逐步诱导部分鳜开始以非活饵为食，即为易驯化鳜；而另一部分鳜则至死都只以新鲜活饵为食，即不易驯化鳜。 

在鱼类中，NPY有促进食欲作用与机体的能量平衡状况有关^[5]。鱼类通过外周和下丘脑的摄食调控因子来调控NPY的分泌；当能量处于正平衡时，瘦素和胰岛素分泌增加，使NPY的分泌受到抑制；当能量处于负平衡时，糖皮质激素、刺鼠相关肽(AGRP)、Ghrelin和orexin的分泌增加，它们能启动NPY神经元使NPY分泌增加，从而起促摄食作用。 

此外，食欲促进作用与相关特异性受体有关。禁食24-48h的金鱼下丘脑有大量的NPY mRNA表达；而禁食72h后的金鱼大脑的端脑的前视区(telencephalonpre-optic)及丘脑顶盖区域(optic tectum-thalamus regions)亦可找到NPY mRNA表达^[6-7]。金鱼脑室注射(i.c.v)NPY可增加金鱼的摄食量^[8]。同时，将哺乳动物Y1或Y5受体拮抗剂注射入金鱼脑室，可抑制NPY诱导的摄食活动^[9-10]。Narnaware^[11]等在金鱼脑室注射NPY Y1([31Leu，34Pro]NPY)、Y2(NPY2-36)、及Y5([D-32Trp]NPY)等受体激动剂2h后，Y1及Y5可促进金鱼的摄食活动，而Y2受体对金鱼的摄食活动没有影响。说明金鱼与哺乳动物相似，推测在NPY所有受体中，Y1及Y5被认为是其中枢神经系统介导食欲调控过程中重要的受体^[12-13]。但Aldegunde对虹鳟脑室注射Y1受体激动剂(Leu31，Pro34)-NPY(4μg)、Y2受体激动剂NPY(3-36)(4μg)及Y5受体激 动剂(cPP1-7，NPY19-23，Ala31，Aib32，Gln34)-hPP(4μg)后发现，注射Y1受体激动剂的虹鳟增加短期(2h)摄食行为；注射Y2受体激动剂的虹鳟的摄食行为明显增加；但注射Y5受体激动剂的虹鳟完全不受影响。推测在虹鳟中摄食是由Y1及Y2样受体、而非Y5样受体介导。这可能是虹鳟的Y1样及Y2样受体在食欲调节上有协作关系，而在金鱼中这两者是独立作用的。 

鱼类的摄食行为受到了食欲促进因子包括了NPY、食欲肽苯基二氢咪唑啉(orexin/hypocretin，包括orexinA及orexinB)、甘丙肽(galanin，GAL)及β-END的影响，它们都具食欲促进作用。此外，在下丘脑还有食欲抑制因子包括胰酶分泌素、韩蛙皮素(bombesin，BBS)、促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-releasing factor family of peptides，CRF)、可卡因安非他明调节转录肽(Cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)、速激肽(tachykinins)、瘦素及血清素(serotonin)有调节鱼类食欲减退的作用^{[5，7，14，15]}。NPY作为一个最强的诱导因子，与这些促进及抑制因子相互作用而对鱼类的摄食进行调节。 

胃蛋白酶(pepsinogen PEP)是一种酸性胃消化蛋白水解酶，其前体胃蛋白酶原在成年脊椎动物胃黏膜中合成，由胃主细胞分泌，在胃液的酸性条件下转换成胃蛋白酶。PEP在酸性条件下水解蛋白质^[16]。这类酸性蛋白酶用作动物饲料添加剂^[17-18]，可促进鱼类对营养物质的消化吸收，能够提高饲料利用率，进而促进鱼类生长，鱼类胃蛋白酶与食性关系一直是研究的热点，胃蛋白酶活性与食物适应性关系已有不少报道^[19-22]。 

脂类的贮存和代谢对动物体维持正常的生命活动具有重大意义。与陆生动物相比，鱼类对碳水化合物特别是多糖的利用效率较低，脂类作为其能源物质就显得更加重要。脂类是鱼类必须的营养元素之一，尤其是肉食性鱼类所需能量的主要来源^[23]。直接来自饲料或体内代谢产生的游离脂肪酸(Free fatty acids，FFA)、甘油三酯是鱼类维持生长和生产的重要能源。脂酶是一种水溶性的酶，对食物中脂肪的吸收、平衡能量和血浆脂蛋白的代谢起着重要的作用^[24-25]，其中，脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase LPL)是脂蛋白代谢的关键酶之一，与机体的脂质代谢及肥胖与否密切相关^[26]，LPL生理功能是催化乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)核心的甘油三酯(TG)分解为甘油和脂肪酸，以供组织氧化供能和贮存；LPL还参与VLDL和高密度脂蛋白(HDL)之间的载脂蛋白和磷脂的转换^[27]。而在牛、羊、猪、鼠等哺乳动物中，LPL基因均已被克隆和定位，对猪LPL基因的研究已有关于其多态性及与经济性状相关性研究的报道，如Harbitz等^[28]对猪LPL基因多态性进行了研究，但未确定不同基因型与生产性状的关系。张依裕等^[29]利用PCR-SSCP技术对鉴定鸭LPL基因内含子5多态性进行分析，结果在5发现4个SNP多态性，认为AB基因型是体尺性状的有利基因型。 

随着分子生物学的发展，来自分子水平的信息，尤其是海量的DNA序列数据为人们进一步认识和解释生命的多样性提供了前所未有的机会。因此，研究与遗传表型相关的DNA序列变异就成了遗传学研究的主要内容之一。一般来说，在同一物种的不同个体中，等位基因基 本上具有相同的碱基序列。但实际上碱基序列在等位基因间常表现出或多或少的差异，这种差异称为基因多态性。根据碱基序列改变的多少及碱基改变对相关检测方法的影响，基因多态性分为多种类型。其中，最常见的是在基因组水平上有单个碱基变异所造成的DNA序列多态性，称为单核苷酸多态性(single mucleotide polymorphism，SNP)。SNPs标记在群体水平上的应用研究最具有吸引力的方面是利用群体遗传学中的连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)原理来进行关联分析(associate study)。由于SNPs在基因组十分丰富，它的稳定性和容易记录使得人们可以利用连锁不平衡分析来深入研究群体遗传学的一些基本理论问题，并在此基础上进行关联研究。进行关联分析时，采用候选基因法来分析功能基因的等位基因与表型的关联性，是一个有效的方法。候选基因SNPs标记是一种重要的QTL定位方法，它通过揭示直接在生理上或在生长发育过程中能得以表现的标记基因与控制数量性状的主效基因的关系，而用于QTL定位。 

国内外学者通过候选基因法在寻找与水产动物生长性状相关的SNPs位点上也取得了初步成效。Tao W J等采用PCR-RFLP和双向特异等位基因扩增(bidirectional amplification of specific alleles，Bi-PASA)技术对北极嘉鱼(Salvelinus alpinus L.)两个全同胞家系中生长相关的10个候选基因进行了SNPs位点的筛选，并进行了SNPs位点与生长性状的关联分析。结果表明，10个候选基因中有5个(GH1、GH2、IGF1、Pitl及GHRH/PACAP2)含有SNPs位点(8个)，其中位于基因GHRH/PACAP2上的SNPs位点与北极嘉鱼早期生长速率存在极显著性相关(P＝0.00001)^[31]；同时表明，对于非模式生物，通过近缘种序列比对来设计引物扩增候选基因进行QTL定位是一种切实可行的方法。Gross等用TaqI酶切大西洋鲑(Salmo salar L.)GH1基因从第1外显子到第4外显子的1825bp片段，结果在内含子3上发现了一个新的TaqI酶切位点，在1龄大西洋鲑大中小3个群体中共检测到了3个等位基因8种基因型，在这3个群体中不同等位基因和基因型的分布存在显著性差异(P＜0.05)^[32]。Prudence等对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)amylase基因(AMYA和AMYB)进行了PCR-RFLP分析，结果表明，AMYA和AMYB两个基因的平均遗传距离为1.7cM；三个家系中有两个家系的牡蛎肉重与amylase基因型显著相关，这对于遗传育种中提高牡蛎生长速度具有重要的潜在价值^[33]。Xu等克隆了与尖吻鲈(Lates calcarifer)肌肉生长相关的小清蛋白基因(PVALB1和PVALB2)，在PVALB1基因的3′非编码区发现了一个微卫星位点，该位点与尖吻鲈孵出90天后的体重、体长极显著相关(P＜0.01)；同时通过直接测序法在PVALB2基因的三个内含子上检测到了三个SNPs位点，但没有发现与尖吻鲈的生长性状存在相关性^[34]。Kang等利用Southern杂交技术对牙鲆(Paralichthys olivaceus)GH第1外显子到第5外显子的2114bp进行了分析，Sau3AI限制性内切酶在牙鲆大中小三个群体中有6个等位基因15种基因型，这些等位基因和基因型在三个不同群体中的分布具有显著性差异(P＜0.05)，可以将这些位点作为与牙鲆生长相关的标记^[35]。Case等用Dra I酶切大西洋鳕鱼(Gadus morhua)和其他海域鳕鱼pan I基因中的313bp片段，发现大西洋鳕鱼pan I基因的变异对其生长性状有着重要的影响，其 中属于pan I ab基因型的鳕鱼在出生十周后的体重和体长明显高于基因型pan I bb(P＜0.01) ^[36]。 

相对其他动植物而言，SNPs标记应用于水产动物关联分析方面起步较晚，研究还很少，但随着SNPs技术的迅速发展和各国学者对水产养殖业的重视，必将在水产动物分子标记辅助育种中得到广泛的应用。 

目前尚未见到有关驯食人工饲料鳜鱼相关基因的SNP分子标记的报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种鳜鱼驯食性状相关SNP分子标记，利用分子标记作为鳜鱼育种基因型的辅助选择。 

实现本发明的技术方案如下所示： 

本发明通过鳜两周食性驯化及基因组DNA提取，引物设计，PCR扩增，产物纯化测序、SNP筛查分析以及创造限制酶切位点PCR法确定基因型，根据CRS-PCR方法检测到的基因型利用SPSS软件进行数据处理，卡方检验用于基因型与食性驯化表型的显著性差异分析，获得易驯食人工饲料鳜鱼的三种基因的SNP分子标记：即神经肽Y(neuropeptide Y)基因启动子区-1312位AA基因型(EF554595)，胃蛋白酶(pepsinogen)基因第7外显子1、52位基因型组合CTCC和TTTT(EU908271)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase)基因第7外显子25、26、29位基因型组合ATTTCC(FJ811962)。 

申请人通过基因克隆技术，得到三个与驯食人工饲料鳜鱼相关的基因多态性SNP分子标记，所述的分子标记是下列基因片段所对应的核苷酸序列： 

(1)神经肽Y基因的SNP分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中在该序列表的193bp处有一个等位基因突变。 

(2)胃蛋白酶基因的SNP分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，其中在该序列表的1bp处有一个等位基因突变，在52bp处有一个等位基因突变。 

(3)脂蛋白酯酶基因的SNP分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，其中在该序列表的25，26和29bp处分别有一个等位基因突变。 

本发明制备的SNP分子标记可应用在检测与驯食人工饲料鳜鱼相关基因多态性中，可有效辅助选择驯食人工饲料鳜鱼基因型。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是扩增的神经肽Y基因的SNP分子标记的核苷酸序列，序列长度为450bp。 

序列表SEQ ID NO：2是扩增的胃蛋白酶基因的SNP分子标记的核苷酸序列，序列长度为141bp。 

序列表SEQ ID NO：3是扩增的脂蛋白酯酶基因的SNP分子标记的核苷酸序列，序列长度为121bp。 

图1：是本发明的实施例中鳜PEP基因第7外显子的A位点不同基因型的测序峰图分析。 

图2：是本发明的实施例中鳜PEP基因第7外显子的B位点不同基因型的测序峰图分析。 

图3：本发明的实施例中鳜PEP基因外显子7A位点CRS-PCR产物HhaI酶切电泳结果分析。 

图4：本发明的实施例中鳜PEP基因外显子7B位点CRS-PCR产物EcoRV酶切电泳结果分析。 

图5：本发明的实施例中鳜LPL基因第7外显子的A、B位点不同基因型的测序峰图分析。 

图6：本发明的实施例中鳜LPL基因第7外显子的C位点不同基因型的测序峰图分析。 

图7：本发明的实施例中鳜NPY基因5’调控区的SNP位点不同基因型的测序峰图分析。 

图8和图9：神经肽Y基因突变前后的片段(下划线显示突变位点)，其中图8是神经肽Y基因突变后的片段。图9是神经肽Y基因突变前的片段(下划线显示突变位点)。 

图10和图11：是胃蛋白酶基因突变前后的片段；其中图10是胃蛋白酶基因突变后的片段； 

图11是胃蛋白酶基因突变前的片段(下划线显示突变位点)。 

图12和图13脂蛋白酯酶基因突变前后的片段；其中图12是脂蛋白酯酶基因突变后的片段； 

图13是脂蛋白酯酶基因突变前的片段(下划线显示突变位点)。 

具体实施方式

实施例1 

1.1.1 试验动物 

所用的鳜幼苗来自广东省佛山市新荣鱼苗繁殖场繁育并饲养到5-6cm规格，之后于广东省淡水种苗繁育中心对其进行喂食驯化。驯化的方法是：先用鲜活的小鱼喂食3天，饥饿2天；再用半死小鱼喂食3天；用全死小鱼喂食3天；之后将试验的鳜鱼分成易驯化组和不易驯化两组，取样前对易驯化组和不易驯化组的鳜鱼用鲜活的小鱼喂食3天，饥饿2天后取样。经过两周喂食驯化后，从1200尾喂养鱼苗中挑选出易驯化和不易驯化两组鳜幼苗，每组均为120尾。 

1.2 方法 

1.2.1 鳜基因组DNA提取 

分离各组鳜的鳍条组织，鳜的鳍条组织基因组DNA提取与纯化步骤按TIANGEN DNA提取试剂盒(广州合达生物科技有限公司产品)说明书推荐方法操作。所得DNA样本于-20℃保存。 

1.2.2 引物设计 

根据本发明克隆得到的鳜鱼NPY、PEP、LPL三个基因的核苷酸序列，在转录组测序的基础上挑选出三种基因SNP位点，用Primer Premier5软件对鳜基因设计引物(引物序列见表1所示)。 

表1 本发明涉及的引物序列及PCR条件 

1.2.3 PCR扩增 

各引物和扩增条件见表2。两个组别每组各随机挑30个样本。总计60个样本直接测序。在0.2mlPCR反应管中依次加入表2的成份，将表2所述的混合液加ddH₂O至20.0μL。 

表2 PCR扩增体系的组成 

反应程序为：94℃预变性3min后进入循环体系94℃变性30s，X℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后72℃延伸7min。将扩增产物于含有EB(0.5μg/ml)的1.4％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液采用0.5×TBE溶液，电泳凝胶用Alpha Image凝胶成像系统成像，并存盘。 

1.2.4 产物纯化测序及SNP筛查分析 

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海英骏尘物技术有限公司进行纯化测序。测得序列结果采用Chromaslite200、DNAstar软件进行序列结构分析，包括以下内容：序列峰图校正，序列比对及突变位点筛查。 

1.2.5 CRS-PCR法确定基因型 

对以上直接测序法^[35]检测到的SNP变异位点采用创造限制酶切位点PCR法来设计错配引物确定基因型，此法是根据错配碱基与SNP位点其中1个等位基因能构成1个限制性内切酶酶切位点，被切成两片段；而另外1个等位基因不能与错配碱基构成酶切位点，从而不能被切开，最后通过PCR-RFLP方法检测出不同的基因型。 

根据预扩增的翘嘴鳜基因目标碱基序列，利用网络酶切软件(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行查询突变点的酶切位点。 

Tag I的酶切体系与反应条件 

1)在0.5mL Ep管中加入下列试剂组合物，如下： 

2)轻轻翻转Fp管混匀(不要旋涡)。 

3)将Ep管置于65℃下，反应2h。 

4)取2μL反应液于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中检测，用2μL PCR产物及2μL DNA Marker作对照。 

酶切产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(VAcr∶VBis＝29∶1)，140V衡压电泳3h后，银染显色。 

1.2.6 数据统计 

1.2.6.1 基因型和基因频率 

统计不同SNP位点基因型样本的数量，计算它们的基因型频率和等位基因频率，卡方分析进行独立性检验。 

1.2.6.2 遗传多态性分析 

多态信息含量、有效等位基因数、位点杂合度、香农指数计算，公式分别如下： 

1 多态信息含量(PIC) 

多态信息含量按照Botstein公式计算对标记基因多态性进行估计。PIC＞0.5为高度多态；0.25＜PIC＜0.5为中度多态；PIC＜0.25为低度多态。 

其中i，j分别为第i，j个等位基因；p_i和p_j别为第i和第j个等位基因的频率；n为等位基因数。 

2 有效等位基因数(Ne) 

有效等位基因数是基因纯合度的倒数，反映了等位基因问的相互影响，用来测定群体的遗传变异。有效等位基因数计算公式： 

$\mathrm{Ne}=1/\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i^2$

式中：p_i-等位基因的频率；n-等位基因数。 

3 位点杂合度(heterozygosity，H) 

杂合度是用来度量某一群体中特定位点上等位基因杂合程度的指标。 

位点杂合度计算公式： 

$\mathrm{Ne}=1/\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i^2$

式中：p_i-基因频率；n-等位基因数。 

4 Shannon’s香农指数(Shannon’s information index，S) 

Shannon’s香农指数是用来测量基因变异的一个指标。 

香农指数计算公式： 

$S=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i\ln p_i$

式中：p_i-基因频率；n-等位基因数。 

1.2.6.3 基因频率和基因型频率的差异显著性检验 

根据CRS-PCR方法检测到的基因型利用SPSS软件进行数据处理，卡方检验用于基因型与食性驯化的显著性分析。并计算其OR值和95％置信区间。 

结果分析 

将纯化的PCR产物进行直接测序，将得到的序列逐条校正后截取得到的可靠区域，利用DNAstar软件进行多重比对分析寻找突变位点，分析发现在PEP基因外显子7中存在2个单核苷酸多态位点，其中在外显子7的1位(位点A)发生了由C→T的点突变，共有两种基因型。首先对PEP基因SNP位点A进行基因型和等位基因频率的统计，结果见表2。 

表2鳜PEP基因外显子7上A位点在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的等位基因和基因型频率 

说明：A位点TT基因型和T等位基因占绝对优势。 

其次对SNP位点B进行基因型和等位基因频率的统计，结果见表3。 

表3鳜PEP基因外显子7上SNP B位点在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的等位基因和基因型频率 

发现外显子7的52位(位点B)碱基处发生T→C的点突变，共有3种基因型，B位点CC基因型和C等位基因占绝对优势，卡方分析表明，鳜2个群体PEP基因不同SNPs位点P值均大于0.05，说明基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。通常可以用多态性信息含量和各位点的平均杂合度来衡量一个群体遗传多样性。其数值的大小反映群体中基因变异水平的高低，数值越大，表明群体的遗传多样性丰富，具有较高的选择潜力，根据各位点不同等位基因的基因频率计算得到各位点PIC值，结果表明，2个位点驯化组都属于低度多态性，而未被驯化组的两个位点属于中度多态性。相比较多态信息含量，信息熵具有区分度高，适用范围广。用信息熵衡量群体多态信息含量时，结果表明，在两个位点，未驯化组的信息熵高于驯 化组。说明两个群体中，未驯化组所面临的选择压力最小，遗传多样性高于驯化组。可进一步加以选育。综合多态信息含量和信息熵的比较结果，可以看出：在试验中检测到的2个PEP基因多态位点中，多数还未经过强的人工选择，可选育的空间很大。 

接下来对两个SNP位点在两种表型的鱼群中分布做卡方检验，结果见表4。 

一个候选基因内通常存在多个SNPs位点，采用不同多态位点与表型关联分析可能会得到不同结论，而实际上对不同SNPs位点进行整体研究，即单倍型研究更利于发现基因与某种表型的相关性。因为不同SNP位点之间有相互作用，所以分析由单倍型构成的双倍型得到的信息比分析单个SNP位点更加全面和准确。将PEP基因2个SNPs位点不同基因型组合成5种双倍型结果如表5所示。 

表4 鳜A、B位点PEP基因型在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的分布 

表5 鳜PEP基因不同双倍型在两群体中的频率分布 

对PEP基因不同双倍型与鳜食性驯化性状进行关联分析，卡方检验表明，双倍型Dip1(OR＝10.21，CI＝5.509-18.925，P＜0.05)与Dip5(OR＝7.40，CI＝3.408-16.054，P＜0.05)在两组中存在显著性差异，见表6。 

表6 PEP双倍型和鳜食性驯化关联分析 

将纯化产物进行直接测序，并将测序结果进行序列分析，在LPL基因第7外显子发现了3个SNP位点， 命名为A、B、C位点。A位点检测到3种基因型分别命名为A1A1、B1B1和A1B1。B位点只检测到2种基因型，分别命名为A2A2和A2B2。C位点只检测到2种基因型，分别命名为A3A3和A3B3。对LPL基因SNP位点A进行基因型和等位基因频率的统计，结果见表7。 

在A位点AT基因型和A等位基因占绝对优势。 

表7 鳜LPL基因外显子7上A位点在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的等位基因和基因型频率 

其次对LPL基因SNP位点B进行基因型和等位基因频率的统计，结果见表8。B位点TT基因型和T等位基因占绝对优势，C位点CC基因型和C等位基因占绝对优势。卡方分析表明，翘嘴鳜两个群体LPL基因不同SNPs位点P值均大于0.05，说明基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。 

表8 鳜LPL基因外显子7上B位点在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的等位基因和基因型频率 

最后对LPL基因SNP位点C进行基因型和等位基因频率的统计，结果见表9。 

表9 鳜LPL基因外显子7上C位点在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的等位基因和基因型频率 

接下来对3个SNP位点在两种表型的鱼群中分布做卡方检验，结果见表10。 

表10 鳜A、B、C位点LPL基因型在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的分布 

将3个SNPs位点不同基因型组合成5种双倍型，见表11。 

表11 鳜LPL基因不同双倍型在两群体中的频率分布 

对LPL基因不同双倍型与翘嘴鳜食性驯化性状进行关联分析，卡方检验表明，双倍型Dip2(OR＝1.84，CI＝1.000-3.381，P＜0.05)在两组中存在显著性差异，详见表12。 

分析NPY基因5’侧翼区，发现1个单核苷酸多态位点，5’侧翼区的1312位(位点SNP)发生了由C→A的点突变，共有3种基因型，对NPY基因SNP位点进行基因型和等位基因频率的统计，结果见表13。卡方分析表明，翘嘴鳜两个群体NPY基因不同SNPs位点P值均大于0.05，说明基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。对于一个群体而言，PIC高，杂合度大，表明该位点的遗传变异程度高，有较大的选择潜力。根据各位点不同等位基因的基因频率计算得到各位点PCI值，表明此位点属于中度多态性。用信息熵衡量群体多态信息含量时，表明在此位点驯化组的信息熵高于未驯化组。 

卡方分析表明，翘嘴鳜两个群体NPY基因不同SNPs位点P值均大于0.05，说明基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。对于一个群体而言，PIC高，杂合度大，表明该位点的遗传变异程度高，有较大的 

卡方分析表明，翘嘴鳜两个群体NPY基因不同SNPs位点P值均大于0.05，说明基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。对于一个群体而言，PIC高，杂合度大，表明该位点的遗传变异程度高，有较大的选择潜力。根据各位点不同等位基因的基因频率计算得到各位点PCI值，表明此位点属于中度多态性。用信息熵衡量群体多态信息含量时，表明在此位点驯化组的信息熵高于未驯化组。 

表12 LPL双倍型和鳜食性驯化关联分析 

表13 鳜NPY基因5’调控区SNP位点在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的等位基因和基因型频率 

表14 鳜SNP位点NPY基因型在最易喂食驯化和最不易喂食驯化群体的分布 

对NPY基因不同双倍型与翘嘴鳜食性驯化性状进行关联分析，卡方检验表明，基因型AA(OR＝1.81，CI＝1.036-3.163，P＜0.05)在两组中存在显著性差异，详见表14。 

本实验发现部分双倍型和基因的频率在易驯化和不易驯化群体间差异显著，初步推断PEP、LPL、NPY基因是影响鳜食性的主效基因，可以作为筛选易驯食翘嘴鳜候选亲鱼的辅助分子标记。具体即神经肽Y(neuropeptide Y)基因启动子区-1312位AA基因型(EF554595)，胃蛋白酶(pepsinogen)基因第7外显子1、52位基因型组合CTCC和TTTT(EU908271)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase)基因第7外显子25、26、29位基因型组合ATTTCC(FJ811962)。 

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Claims (2)

1.一种鳜鱼驯食性状相关SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。 

2.权利要求1所述的分子标记在驯食人工饲料鳜鱼胃蛋白酶基因多态性检测中的应用。 

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