CN107574168A - 一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用，属于动物分子生理学技术领域。其所述miRNA为miR‑138‑5p，具体序列如SEQ ID NO:1所示。相较于“粉白”体色红罗非鱼，所述miR‑138‑5p在“黑斑”和“红斑”的红罗非鱼皮肤中显著高表达。本发明提供了红罗非鱼皮肤组织的miR‑138‑5p，可作为“黑斑”和“红斑”体色的红罗非鱼miRNA分子标记，对红罗非鱼体色分化变异的分子调控机制探讨具有重要意义，通过该分子标记可广泛用于红罗非鱼品种鉴别、保种和分子辅助选择育种。本发明提供的miR‑138‑5p的筛选和验证方法也可借鉴应用到其它鱼类的miR‑138‑5p研究之中。

Description

一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用，属于动物分子生理学技术领域。

背景技术

红罗非鱼 (Oreochromis spp) 一般认为是由突变型红色莫桑比克罗非鱼（O. mossambicus）与其他罗非鱼种类如尼罗罗非鱼(O. niloticus)杂交，经多代选育而成的优良品种，是世界性的重要经济鱼类(Abdullah et al., 2013)。因其体色艳丽、腹腔无黑膜、适应性强、口感清新以及市场价格高等优点，近年来在我国的养殖面积不断增大，市场空间巨大（Pradeep et al., 2014）。而在遗传选育过程中，其繁育后的体色分化以及越冬期间的体色变异，一直是限制其大规模推广养殖的主要问题（李家乐和李晨虹，1999；朱文彬等，2013）。体色分化变异主要表现为出现散点状或大面积的黑斑和红斑，其中体色分化是不可逆的，而体色变异随着环境温度的升高则具有一定的可逆性（Zhu et al., 2016）。目前马来西亚红罗非鱼的体色类型主要有3种：粉白色，粉白色带有大面积的红斑以及粉白色带有大面积的黑斑（Zhu et al., 2016），这也使其成为研究鱼类体色分化变异的良好实验对象。

动物皮肤的颜色是由色素细胞分泌的不同色素合成的结果，并受遗传、环境、营养或生理等多种因素的影响（Jiang et al., 2014）。在人类和哺乳动物中，决定其体色的主要是黑色素，对动物体色形成的分子机制从黑色素合成通路方面也进行了大量研究，并认为黑色素合成通路在脊椎动物中是保守的（Logan et al., 2006; Li et al., 2012）。体内的酪氨酸（Tyrosine）首先在酪氨酸酶（Tyrosinase tyr）的催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸（Dopa），Dopa再进一步氧化为多巴醌（Dopaquinone DQ），DQ经多聚化反应生成多巴色素（Dopachrome）。在多巴色素异构酶（dct）的作用下，羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸（5,6-DHICA），再由酪氨酸蛋白酶1（tyrp1）催化被氧化为5,6-吲哚醌（Indole-5,6-quinoneCarboxylic acid）成为真黑色素形成的前体。而当 tyr 活性降低时，稳定态的DQ浓度明显降低，此时细胞内过量的胱氨酸（Cystine）或谷胱甘肽能与DQ定量结合形成半胱氨酸多巴（Cys-dopa），从而导致褐黑色素的形成（Hoekstra, 2006; Uyen et al., 2008；Ito &Wakamatsu, 2011）。真黑色素与褐黑色素含量、比例的不同决定了动物的肤色和毛色。

目前，本实验室通过不同体色红罗非鱼的转录组分析，筛选出了显著差异表达的功能基因。MicroRNA( miRNA )是长度约为22个核苷酸的内源性小型非编码RNA，能够识别特定的目标mRNA，并在转录组后水平发挥调控基因表达的作用。目前对红罗非鱼体色miRNA的研究还未见报道，本发明所述的miRNA经过验证，可以作为调控红罗非鱼体色分化的miRNA分子标记，为选育体色稳定一致的红罗非鱼新品种提供支持。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用。

按照本发明提供的技术方案，一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA，所述miRNA为miR-138-5p，具体序列如SEQ ID NO:1所示。

相较于“粉白”体色红罗非鱼，所述miR-138-5p在“黑斑”和“红斑”的红罗非鱼皮肤中显著高表达。

所述miRNA的靶标基因包括mc1r和dct等，其为红罗非鱼黑色素合成途径的关键为参与和调控基因。

采用实时荧光定量PCR方法验证所述miRNA miR-138-5p在3种不同体色（粉白、黑斑和红斑）红罗非鱼皮肤中的表达特性。具体步骤为：提取3种不同体色红罗非鱼皮肤组织总RNA、反转录成cDNA、设计引物、miR-138-5p的扩增。

PCR检测时，所采用的引物对如下：反转录引物的序列如SEQ ID NO:2所示；荧光定量正向引物Forward primer序列如SEQ ID NO:3所示；荧光定量反向通用引物Reverseprimer序列如SEQ ID NO:4所示。

所述 miR-138-5p在选育体色稳定一致的红罗非鱼新品种中的应用。

本发明首先选取“粉白”、“黑斑”和“红斑”3种体色的红罗非鱼（图1）各3尾，分别提取其皮肤组织的RNA，进行高通量miRNA测序，对测序结果进行数据比对与分析，获得相关的已知miRNA和新的未知miRNA，并对所有的miRNA进行差异表达分析，对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测。结合研究目的，选择与体色相关的miRNA进行qPCR验证，经过筛选，miR-138-5p作为其中的一个已知miRNA进行验证，并进一步以miR-138-5p为研究对象，通过RNAhybrid, miRanda 和 Targetscan 7.0，预测出miR-138-5p调控的靶基因—mc1r和dct等。

挑选15个显著差异表达的体色相关的miRNA（包括miR-138-5p）进行实时荧光定量PCR验证，根据miRNA序列进行引物设计。结果显示，miR-138-5p在“黑斑”和“红斑”的红罗非鱼皮肤中均显著正向高表达（图2）。

所述的miR-138-5p可作为分子标记应用于体色稳定一致的红罗非鱼新品种的选育中。

本发明的有益效果：本发明提供了红罗非鱼皮肤组织的miR-138-5p，可作为“黑斑”和“红斑”体色的红罗非鱼miRNA分子标记，对红罗非鱼体色分化变异的分子调控机制探讨具有重要意义，通过该分子标记可广泛用于红罗非鱼品种鉴别、保种和分子辅助选择育种。本发明提供的miR-138-5p的筛选和验证方法也可借鉴应用到其它鱼类的miR-138-5p研究之中。

附图说明

图1“粉白”、“黑斑”和“红斑”3种体色的红罗非鱼；a、粉白；b、红斑；c、黑斑。

图2是15个显著差异表达的体色相关的miRNA（包括miR-138-5p）的实时荧光定量PCR验证图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，但不构成对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：不同体色红罗非鱼皮肤组织中差异表达的microRNA筛选

选取“粉白”、“黑斑”和“红斑”3种体色的红罗非鱼（图1）各3尾，分别提取其皮肤组织的RNA，采用原平皓（天津）生物技术有限公司EASYspin组织/细胞超纯RNA快速提取试剂盒说明书进行操作。RT-PCR反转录成单链cDNA，根据Takara 公司Primer Script RT MasterMix Perfect RealTime试剂盒说明书操作步骤完成。然后进行PCR扩增，构建Illumina测序文库，文库检测合格后，采用高通量测序进行红罗非鱼皮肤组织高通量miRNA测序。对获得的miRNA的原始文库数据运用Fast-QC软件进行整体质量评估，并过滤低质量序列。然后对miRNA序列做长度分布统计，一般来说，小RNA的长度区间为18-45nt。

质控合格的数据与miRBase21.0中尼罗罗非鱼已知的miRNA前体/miRNA成熟序列进行比对，鉴定出该物种中已知的miRNAs并对已知miRNA的碱基编辑进行分析。通过对截取一定长度sRNA比对上的基因组序列，探寻其二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征，使用miRNA预测软件Mireap对新的miRNA进行预测。

对已知miRNA和新miRNA在不同样本间进行差异分析，采用edgeR对三样本进行两两差异比较，基于|fold change| >= 2 and q-value <=0.001，寻找出显著差异的miRNAs。对样本间显著差异的miRNAs进行靶基因预测并对靶基因进行GO和KEGG富集分析以及miRNA与靶基因互作网络图等。通过比较分析发现，相较于“粉白”体色，miR-138-5p在“黑斑”和“红斑”体色红罗非鱼皮肤中均显著高表达，靶基因预测发现其靶向于黑色素合成通路的关键基因mc1r和dct等。说明miR-138-5p在调控红罗非鱼体色分化的过程中可能发挥重要作用。

实施例2：实时荧光定量PCR验证红罗非鱼皮肤组织中miR-138-5p的表达

随机选取3种不同体色“粉白”、“黑斑”和“红斑”的红罗非鱼各5尾，迅速获得其皮肤组织，液氮速冻后放零下80度冰箱保存。首先将皮肤组织于组织破碎仪中破碎，然后采用原平皓（天津）生物技术有限公司EASYspin组织/细胞超纯RNA快速提取试剂盒进行RNA提取,具体步骤详见说明书。并反转录成cDNA，第一链cDNA 合成根据Takara 公司Primer ScriptRT Master Mix Perfect RealTime试剂盒说明书操作步骤完成，反转录的引物序列为GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACAACTGT。

采用实时荧光定量PCR技术对miR-138-5p进行验证，用红罗非鱼5s rRNA作为定量内参。PCR反应体系如下表：

Takara Premix Ex Taq TM hot Start version	25 μL
		cDNA 模板	2 μL
正向特定引物（20μM）	1 μL
		反向通用引物（20μM）	1 μL
灭菌蒸馏水	Up to 50μL

PCR 反应条件如下：95℃5min；98℃ 15s，60℃ 45s，40个循环。

最后，利用相对定量算法，按照目的基因的相对表达量计算公式2^-ΔΔCt，获得miRNA相对于5s rRNA的表达量。

红罗非皮肤miR-138-5p基因荧光定量PCR引物分别为：miR-138-5p-F：GCGAGCTGGTGTTGTGAATC；反向通用引物：GTGCAGGGTC CGAGGTATTC；内参基因5s rRNA的正向引物（SEQID NO.5）为：GGTATTCCCA GGCGGTCTC；反向引物（SEQ ID NO.6）：ATACCAGCCT GAACACGCC。

15个显著差异表达的体色相关的miRNA（包括miR-138-5p）的实时荧光定量PCR验证图具体如图2所示。其中，WP：“粉白”体色红罗非鱼；PB：“黑斑”体色红罗非鱼；PR：“红斑”体色红罗非鱼。

qPCR：实时荧光定量验证结果；RNAseq：高通量测序结果。

由图2可以看出，miR-138-5p 在PB-WP和PR-WP的比较中均显著正向表达。即miR-138-5p在“黑斑”和“红斑”的红罗非鱼皮肤中显著高表达。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> miR-138-5p(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

agctggtgtt gtgaatcagg cc 22

<210> 2

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> 反转录引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccggcct 50

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 荧光定量正向引物Forward primer(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

gcgagctggt gttgtgaatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 荧光定量反向通用引物Reverse primer(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 4

gtgcagggtc cgaggtattc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 内参基因5s rRNA的正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 5

ggtattccca ggcggtctc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 内参基因5s rRNA的反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 6

ataccagcct gaacacgcc 19

Claims (6)

1. 一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA，其特征是：所述miRNA为miR-138-5p，具体序列如SEQ ID NO:1所示，其为红罗非鱼黑色素合成途径的关键参与和调控miRNA。

2.如权利要求1所述调控红罗非鱼体色分化的miRNA，其特征是验证方法如下：采用实时荧光定量PCR方法验证所述miRNA miR-138-5p在3种不同体色红罗非鱼皮肤中的表达特性。

3.如权利要求2所述调控红罗非鱼体色分化的miRNA，其特征是具体步骤如下：提取3种不同体色红罗非鱼皮肤组织总RNA，将其反转录成cDNA，针对cDNA设计引物，最后对miR-138-5p进行扩增。

4.如权利要求2所述调控红罗非鱼体色分化的miRNA，其特征是：所述3种不同体色红罗非鱼分别为“粉白”体色红罗非鱼、“黑斑”体色红罗非鱼和“红斑”的红罗非鱼。

5.如权利要求3所述调控红罗非鱼体色分化的miRNA，其特征是：反转录引物的序列如SEQ ID NO:2所示；荧光定量正向引物Forward primer序列如SEQ ID NO:3所示；荧光定量反向通用引物Reverse primer序列如SEQ ID NO:4所示。

6.权利要求1所述调控红罗非鱼体色分化的miRNA的应用，其特征是：将所述所述miRNAmiR-138-5p作为分子标记应用于选育体色稳定一致的红罗非鱼新品种中。