CN116814813B - 山羊3bhsd基因中与产羔数关联的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于山羊分子标记辅助选择技术领域，特别是涉及山羊3BHSD基因中与产羔数关联的分子标记及其应用。所述的山羊SNP位点为2处，包括g.96847162T>C和g.96848096C>T，所述分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明的2处SNP位点突变可显著影响山羊产羔数性状，为山羊产羔数性状检测或分子标记辅助育种提供一种新的分子标记。
Description
技术领域
本发明涉及山羊分子标记辅助选择技术领域，尤其涉及山羊3BHSD基因中与产羔数关联的分子标记及其应用。
背景技术
随着社会的发展和生活水平的提高，人们的饮食观念发生转变，对健康饮食的要求提高，从最初的吃饱到如今的吃好。羊肉作为高蛋白、低脂肪、低胆固醇的优质食品，且富含氨基酸、维生素以及多种微量元素，在居民膳食消费结构中的占比增加。相较于其他羊肉品种，山羊肉因其品质高、膻味小、风味佳，深受消费者欢迎。然而，由于山羊繁殖能力相对较低，且在养殖过程中需要更多的草料和空间，相对于绵羊，山羊养殖规模较小，导致山羊肉供不应求的情况在市场上普遍存在，提高山羊产羔数是解决这一问题的有效举措。
山羊产羔数是低遗传力性状，常规育种方法很难在短期内获得较大的遗传进展，随着应用基因组学、分子生物学和分子遗传学理论技术的不断发展，分子标记可以较好地解决这一难题。分子标记是能够直接反映生物个体或种群间基因组间差异的DNA片段，具有共显性、高多态性的优势且来源丰富、表现稳定，可从基因层面上解释可遗传变异带来的育种潜力。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)属于分子标记的一种，指个体间基因组中同一位置单个核苷酸发生变异而导致的DNA序列改变，后续可影响基因表达量、转录活性及剪接修饰等。借助SNP对山羊产羔数的选择进展进行辅助选择，将有助于提高我国山羊的繁殖效率，提升羊肉产量。全基因组测序(Whole Genome Sequencing，WGS)是一种新型基因检测技术，是利用高通量测序技术对个体或群体中完整的基因组序列进行测序，发现序列或结构变异等信息。然后，通过全基因组关联分析(Genome-wideassociation study，GWAS)分析单核苷酸多态性位点与特定复杂性状之间的关联性，以确定与该性状有关的基因变异。
3β羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3BHSD)为羟基类固醇脱氢酶家族成员，参与类固醇激素合成的多个步骤，对类固醇激素的合成具有重要意义。有关3BHSD研究主要集中在影响肾上腺和性腺组织发育方面，尚无有关山羊3BHSD基因作为产羔数性状的分子标记的有关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于发掘了山羊3BHSD基因中与山羊产羔数关联的分子标记，为山羊产羔数性状检测或分子标记辅助育种提供一种新的分子标记。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种山羊SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测山羊SNP位点单核苷酸多态性的物质在检测或辅助检测山羊产羔数性状中的应用，所述SNP位点为山羊基因组中g.96847162T>C位点的分子标记和/或g.96848096C>T位点的分子标记。
其中，所述g.96847162T>C位点的分子标记：即在SEQ ID NO.1所示序列中的第109bp处存在一个T>C碱基突变；所述g.96848096C>T位点的分子标记：即在SEQ ID NO.2所示序列中的第62bp处存在一个C>T碱基突变。
本发明上述SNP位点的单核苷酸多态性与山羊头胎产羔数和平均产羔数的性状相关。
优选的，所述山羊品种为黑头羊。
本发明还提供了一种检测山羊产羔数性状的方法，检测山羊的SEQ ID NO:1所示序列中第109bp处的碱基类型，CC基因型山羊的头胎产羔数和平均产羔数均高于TT基因型和TC基因型；和/或，
检测山羊的SEQ ID NO:2所示序列中第62bp处的碱基类型，TT基因型山羊的平均产羔数高于CC基因型与CT基因型。
本发明还提供了用于检测山羊SNP位点单核苷酸多态性的物质，包括扩增所述SNP位点在内的基因组DNA片段的PCR引物或含有所述引物的试剂盒。
本发明还提供了一种3BHSD基因中与山羊产羔数关联的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.1中的第109bp处存在一个T>C碱基突变；所述SEQ ID NO.2中的第62bp处存在一个C>T碱基突变。
本发明的上述检测山羊SNP位点单核苷酸多态性的物质或与山羊产羔数关联的分子标记能够用于山羊遗传育种中，以提高后代山羊的产羔数。
本发明提供了一种提高山羊产羔数的遗传育种方法，确定山羊核心群中种羊上述SNP位点的单核苷酸多态性，并根据山羊所述SNP位点的单核苷酸多态性做出相应的选择：
种羊的继代选育挑选SEQ ID NO.1所示序列中第109bp处碱基为CC型的个体，淘汰TT型和TC型个体，以逐代提高该位点基因C的频率，从而提高后代山羊的头胎产羔数和平均产羔数性能；和/或，
种羊的继代选育挑选SEQ ID NO.2所示序列中第62bp处碱基为TT型的个体，淘汰CC型和CT型个体，以逐代提高该位点基因T的频率，从而提高后代山羊的平均产羔数性能。
本发明的有益效果：
本发明发掘了山羊3BHSD基因中与产羔数关联的分子标记，所述的分子标记含有g.96847162T>C和g.96848096C>T两个SNP位点；由上述2个SNP位点组成的单倍型可以作为山羊产羔数性状的分子标记。
本发明验证了上述SNP分子标记对山羊头胎产羔数和平均产羔数的影响效应，可将其应用于种羊提高产羔数的遗传改良中，从而提高后代的产羔数，进而增加养殖企业市场竞争力。
本发明为山羊产羔数性状的分子标记辅助育种提供了一种新的分子标记，实现了对山羊产羔数性状的早期选择，缩短育种进程；检测方法快速、准确，且不受养殖环境条件因素影响。
具体实施方式
本发明首先通过对山羊基因组DNA进行全基因组重测序，获得3BHSD基因上的全部SNP位点，通过分析各位点与产羔性状的相关性，获得了与产羔数相关的分子标记g.96847162T>C和g.96848096C>T。
本发明的实施例通过对500头黑头羊(麻城黑山羊与波尔山羊杂交后代)进行全基因组重测序，其中，466头测序深度为低深度1X，34头测序深度为高深度15X，目的在于以高深度测序结果(较少)对低深度测序结果(较多)进行基因型填充，降低测序成本。然后，将重测序数据与山羊参考基因组(基因组版本ARS1.2)进行比对，使用Sentieon+Beagle策略对500个样本的所有常染色体进行遗传变异检测和基因型填充，获得3BHSD基因上的全部SNP位点。最后，将SNP位点与头胎产羔数和平均产羔数进行关联分析，筛选到与山羊产羔数相关的2个分子标记：g.96847162T>C和g.96848096C>T。
g.96847162T>C位点的分子标记：该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在所示序列中的第109bp处存在一个T>C碱基突变；
ACTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGATGTGAGTCCTTCAACTGTCCTCCTATGGACCAGAGTTGTCCCTACTCTTAGAGTATGGCATCCTAATTTTTTAAGNTTACAACAGCTGTCTTCAGGACTTCCCAGGTGGCTCAGATGTAAAGAATCTGCCTGCAATGCAGGAAACCCAGGTTC(SEQ ID NO.1)。
g.96848096C>T位点的分子标记：该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，在所示序列中的第62bp处存在一个C>T碱基突变；
CGTTCCTTTCTGCCTACATGCATGGAGCCTTGAAGAACAACGGCAT CCTGACCAATTACTGNAAGTTCTCCAGAGTCAACCCAGTCTATGTTGGC AATGTGGCCTGGGCCCACATTCTGGCCTT(SEQ ID NO.2)。
GWAS分析结果显示：g.96847162T>C位点的分子标记与山羊头胎产羔数和平均产羔数显著相关，基因型为CC的个体的头胎产羔数和平均产羔数显著高于TT和TC个体，说明C是有利于产羔数性状提高的等位基因；g.96848096C>T位点的分子标记与山羊平均产羔数显著相关，基因型为TT的个体平均产羔数显著高于TT和CT个体，说明T是有利于产羔数性状提高的等位基因。该分子标记可以作为检测与山羊产羔数性状相关的分子标记，且当SEQID NO:1所示序列上的第109位核苷酸为C时，SEQ ID NO:2所示序列上的第62位核苷酸为T时，有利于山羊拥有较多的产羔数，对山羊育种繁育有重要意义。
本发明筛选的分子标记可应用于对山羊产羔数性状相关基因的基因型或山羊产羔数性状相关的关联分析中，为山羊产羔数性状的分子标记辅助选择提供了新的分子标记资源。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
山羊全基因组重测序
1.血液采集及白细胞分离
采集山羊静脉血5mL于EDTA抗凝管中，将抗凝管置于放有冰袋的冰盒中带回实验室储存于4℃冰箱，提取白细胞，具体步骤如下：
(1)取2mL血液于10mL离心管；
(2)加入超纯水至9-10mL刻度，上下颠倒20次，静置10分钟；
(3)将离心管放入离心机，5000rpm离心10min，弃去上清液(尽量将上清液倒干净，勿将底层白细胞倒出)；
(4)重复(2)、(3)操作；
(5)将分离完成的白细胞存放于-80℃冰箱保存备用。
2.基因组DNA提取及全基因组重测序
采用血液/细胞基因组DNA试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)进行白细胞的DNA提取，具体方法见说明书。将质检合格的基因组DNA送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行二次质检并建库，在华大基因平台进行PE150的全基因组重测序。获得原始下机数据，原始数据格式为FASTQ。34个样本进行高深度全基因组重测序，平均测序深度约为19.72X，总数据量大小为1.4T；466个样本进行低深度全基因组重测序，平均测序深度约为1.65X，总数据量大小为1.6T。
实施例2
基因组比对、遗传变异检测及基因型填充
1.原始测序数据分析及基因组比对
高深度测序数据与低深度测序数据使用同样的流程进行质量控制。
(1)使用Fastp软件对原始数据进行过滤，过滤标准如下：剔除碱基质量值低于20比例超过30％的reads；n碱基大于5％的reads。经上述步骤质控后获得cleanreads。
(2)使用BWA软件将cleanreads比对到山羊参考基因组Capra_hircus.ARS1.2)。
(3)使用Samtools软件对比对后的BAM文件进行排序。
(4)使用Picard标记重复reads。
(5)Samtools软件构建引索。
2.变异位点检测及基因型填充
(1)GATKHaploytypeCaller按常染色体编号对每个样本分别生成gvcf文件。
(2)GATKCombineGVCFs合并单条染色体各样本gvcf文件。
(3)GATKGenotypeGVCFs按染色体进行群体SNPcalling。
(4)GATKMergeVcfs合并常染色体群体vcf文件。
(5)GATKSelectVariants筛选群体vcf文件SNP。
(6)GATKVariantFiltration标记假阳性SNP位点。
(7)grep命令过滤被标记SNP位点。
(8)Plink软件对SNP位点进行过滤(geno0.1--maf0.05--hwe1e-06)。
(9)Beagle软件对缺失位点进行填充。
(10)使用Sentieon Haplotyper和GVCFtyper模块进行群体基因组遗传变异检测和分型。
(11)使用Beagle进行基因型填充，最终获得26131221个高质量SNP。
实施例3
本发明的分子标记在山羊群体中的多态性分布检测
对3BHSD基因的2个SNP位点在黑头羊中分型后的基因型频率和等位基因频率进行计算，具体公式和方法如下：
基因型频率＝基因型的个体数/测定群体总样本数；
等位基因频率＝等位基因纯合子基因型频率+该基因杂合子基因型频率/2。
采用SPSS软件对2个位点的不同基因型分布进行差异分析，哈代-温伯格平衡是一个群体在理想情况(不受特定的干扰因素影响，如非随机交配、选择、迁移、突变或群体大小有限)，经过多个世代，基因频率与基因型频率会保持恒定并处于稳定的平衡状态。
p2代表一个等位基因(如Y)纯合子的频率，q2代表另一个等位基因(如y)纯合子的频率，2pq代表杂合子(如Yy)的频率。如果一种群达到了遗传平衡，其基因型频率应当符合2(p+q)＝p2+2pq+q2＝1，根据理论值，可以计算实际值来进行卡方检验，判定各基因在群体中是否处于哈代-温伯格平衡状态：
χ2＝∑(Oi-Ei)2/Ei
其中，O代表基因频率的观测值，E代表基因频率的预期值，χ2是所得到的卡方检验值。将计算得到的卡方值与对应的卡方表进行比较，如果p值范围大于0.05，说明此位点符合哈代-温伯格平衡，若小于0.05则此位点偏离了哈代-温伯格平衡。
检测结果如表1所示：2个SNP位点在山羊群体中都表现为三种基因型，g.96847162T>C以纯合型TT占优势，等位基因T为优势等位基因；g.96848096C>T以纯合型CC占优势，等位基因C为优势等位基因。并且经过卡方检验发现，此2个多态性位点均符合哈代-温伯格定律(P>0.05)。
表13BHSD基因多态性位点在山羊群体中的基因型频率和等位基因频率
实施例4
本发明的分子标记与产羔数性状的关联分析及应用
为了确定3BHSD基因g.96847162T>C和g.96848096C>T位点与山羊产羔数性状差异是否相关，采用SAS统计分析软件中的GLM程序进行分子标记不同基因型个体性状间的关联分析，采用模型为：
模型1：Y＝总体均值+基因型+羊场环境效应+残差
模型2：Y＝总体均值+加性效应+显性效应+羊场环境效应+残差。
其中，Y为性状表型值。加性效应＝(纯合子1-纯合子2)/2，用1、0、-1分别代表纯合子1、杂合子、纯合子2；显性效应＝杂合子-(纯合子1+纯合子2)/2，用1、-1、1分别代表纯合子1、杂合子、纯合子2。
统计分析结果如表2所示：g.96847162T>C位点中CC基因型的头胎产羔数和平均产羔数均显著高于TT基因型和TC基因型(P<0.05)；g.96848096C>T位点中三种基因型在头胎产羔数方面差异不显著，但TT基因型的平均产羔数显著高于CC基因型与CT基因型(P<0.05)。结果表明，筛选g.96847162T>C位点的CC基因型母羊或g.96848096C>T位点的TT基因型母羊，有望提高产羔数。
表23BHSD基因多态性位点与山羊产羔数的关联分析
注：表中数值以平均值±标准误表示；同一行数据上标，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
上述3BHSD基因g.96847162T>C和g.96848096C>T位点可作为山羊产羔数性状遗传改良的新的分子标记。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于检测山羊SNP位点单核苷酸多态性的物质在检测或辅助检测山羊产羔数性状中的应用，其特征在于，所述SNP位点为山羊基因组ARS1.2中g.96847162T>C位点的分子标记，该位点为C有利于山羊产羔；和/或山羊基因组ARS1.2中g.96848096C>T位点的分子标记，该位点为T有利于山羊产羔。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述g.96847162T>C位点的分子标记：即在SEQ ID NO.1所示序列中的第109 bp处存在一个T>C碱基突变；所述g.96848096C>T位点的分子标记：即在SEQ ID NO.2所示序列中的第62 bp处存在一个C>T碱基突变。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述山羊产羔数包括头胎产羔数和平均产羔数。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测山羊SNP位点单核苷酸多态性的物质，包括扩增所述SNP位点在内的基因组DNA片段的PCR引物或含有所述引物的试剂盒。
5.一种检测山羊产羔数性状的方法，其特征在于，检测山羊的SEQ ID NO:1所示序列中第109 bp处的碱基类型，CC基因型山羊的头胎产羔数和平均产羔数均高于TT基因型和TC基因型；和/或，
检测山羊的SEQ ID NO:2所示序列中第62bp处的碱基类型，TT基因型山羊的平均产羔数高于CC基因型与CT基因型。
6.一种用于检测山羊SNP位点单核苷酸多态性的物质在山羊产羔数性状遗传育种中的应用，其特征在于，所述SNP位点为山羊基因组ARS1.2中g.96847162T>C位点的分子标记，该位点为C有利于山羊产羔；和/或山羊基因组ARS1.2中g.96848096C>T位点的分子标记，该位点为T有利于山羊产羔。
7.一种提高山羊产羔数的遗传育种方法，其特征在于，确定山羊核心群中SEQ ID NO.1所示序列中第109 bp处的碱基类型，和/或SEQ ID NO.2所示序列中第62 bp处的碱基类型，并根据山羊所述碱基类型做出相应的选择：
种羊的继代选育挑选SEQ ID NO.1所示序列中第109 bp处碱基为CC型的个体，淘汰TT和TC型个体，以逐代提高该位点基因C的频率，从而提高后代山羊的头胎产羔数和平均产羔数性能；和/或，
种羊的继代选育挑选SEQ ID NO.2所示序列中第62 bp处碱基为TT型的个体，淘汰CC和CT型个体，以逐代提高该位点基因T的频率，从而提高后代山羊的平均产羔数性能。
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