CN117385049B - 一种与山羊生长性状相关的SNP分子标记rs655589732的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种与山羊生长性状相关的SNP分子标记rs655589732的应用。所述的山羊SNP分子标记位点如SEQ ID NO.1所示，位于该序列片段的第51位碱基位点处存在一个G/T的碱基突变。本发明通过优选该SNP的优势等位基因G，能够逐代增加优势等位基因频率，提高山羊12月龄体重，加快山羊遗传改良进展从而有效提高山羊育种的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山羊21号染色体上与生长性状相关的SNP分子标记rs655589732的应用。
背景技术
山羊作为我国古代最早驯化的家畜之一，为人们的生活提供了肉、奶、毛等多种畜产品。目前，我国每年需要从新西兰和澳大利亚进口大量冻带骨绵羊肉和冻整头绵羊肉等羊肉制品，并且自2012年起成为世界上最大羊肉进口国。东宝黑头羊是地方品种改良的肉用山羊，其肉质鲜美，膻味轻，同时保持了母本麻城黑山羊的高繁殖力水平，但年产肉量有待提高。山羊的生长性状包括体重、体尺、日增重和料肉比等方面，这些性状对于山羊的产肉能力具有重要影响。
单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)指的是由个体间基因组中同一位置单个核苷酸(A、T、C和G)发生变异所引起的DNA序列的多态性，主要包括碱基的转换、颠换、插入或缺失等四种形式。SNP具有数量多、分布广、杂合率低、遗传稳定性好、适用于高通量自动化检测等特点。因此，SNP可作为分子育种、基因定位、群体进化等研究的首选工具。借助现代选择育种技术，通过将具有显著效应的分子标记加入到分子标记辅助选择(marker associated selection,MAS)、基因组选择(Genomic selection,GS)中，能显著提高山羊生长性状的遗传改良进展，进而提高后代山羊产肉量，推动我国山羊产业的高效发展。全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)技术有助于高效筛选出对表型具有显著影响的分子标记。但是，尽管GWAS技术已经取得显著进展，但仍然存在一些挑战，例如数据标准化质量不高，大群体测序时成本高等问题，都需要在GWAS研究中得到解决。在现代畜牧育种中，由于畜禽群体一般较大，如使用高深度测序进行碱基信息获取的话会产生较高的成本，从而降低经济效益，而低深度测序数据质量有待考察。因此，为了满足大群体测序的要求，为GWAS分析提供低成本、高质量的SNP位点信息是提高SNP筛选效率的重要因素。
目前已经报道的与山羊生长性状相关的SNP位点包括山羊NFAT5基因中c.*454C>G位点、山羊RSAD2基因中c.*1103G>A位点、山羊ZBP1基因中g.7919G>A位点。筛选新的与山羊生长性状相关的SNP位点，为山羊的分子标记辅助选择提供了新分子标记资源，加快种羊育种改良的进程。
发明内容
本发明的目的在于筛选出一种与山羊生长性状相关联的分子标记rs655589732，利用该分子标记在山羊生长性状检测或山羊育种中的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明的目的在于，提供一种山羊SNP分子标记在山羊生长性状检测或山羊育种中的应用，所述SNP分子标记为山羊21号染色体上的rs655589732，该SNP位点上下游50bp的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)：
TTTGCTCACATAATTAAAGTATATGCTCATAACGCTACCTTGGATGT AACN(G/T)TTGACTTCATTCTTTTTAAATAGTACGAATTGGAGCAATGTT GGCGTATA。
上述序列的第51位碱基处的N为一个G51-T51的等位基因突变，该突变使SEQ IDNO:1序列产生了核苷酸多态性。该分子标记可以作为检测与山羊生长性状相关的分子标记，且当SEQ ID NO:1所示序列上的第51位核苷酸为G时，有利于山羊拥有较高的12月龄体重。
本发明对山羊的品种不做限定，可选的为东宝黑头羊、麻城黑山羊、波尔山羊、宜昌白山羊和马头山羊等山羊品种。
本发明的另一个目的在于，提供一种试剂或试剂盒，包括检测上述SNP分子标记的引物。本领域技术人员可根据引物设计原则设计可扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物，以检测本发明与山羊生长性状相关的SNP标记基因型，从而预测山羊生长性状，尤其是12月龄体重。
本发明的上述试剂或试剂盒能够用于在山羊生长性状检测或山羊育种中的应用。所述山羊生长性状为山羊12月龄体重。
本发明的另一个目的在于，提供一种检测山羊生长性状的方法，检测山羊的上述SEQ ID NO:1序列中，N标记的单核苷酸是G还是T。所述山羊生长性状为山羊12月龄体重。
作为一种实施方式，利用扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对待测山羊的材料进行基因分型，GG型山羊的12月龄体重优于TT型山羊。优选的，用上述试剂或试剂盒进行检测。
本发明的另一个目的在于，还提供了一种筛选上述SNP分子标记的方法，包括以下步骤：
①提取山羊基因组DNA，进行全基因组低深度和高深度重测序，得到原始测序数据；
②对原始测序数据质控，比对到山羊参考基因组，采用Sentieon+Beagle策略对样本的所有常染色体进行遗传变异检测和基因型填充，获得高质量SNP位点数据；
③通过rMVP软件使用FarmCPU模型将SNP位点与山羊12月龄体重进行GWAS分析，得到所述山羊生长性状相关的SNP分子标记。
作为一种实施方式，所述低深度为1-2X，所述高深度为15-20X；优选低深度数量要高于高深度，以较少的高深度测序结果对较多的低深度测序结果进行基因型填充，降低测序成本。
本发明的另一个目的在于，提供一种提高山羊生长性状的遗传育种方法，确定山羊核心群中种羊的上述SNP分子标记，并根据山羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育挑选SNP标记中第51位碱基为GG型和/或GT型的个体，淘汰TT型个体，以逐代提高该位点基因G的频率，从而提高后代山羊的12月龄体重性能。
本发明的有益效果：
本发明通过低深度重测序与基因型填充结合，并利用GWAS分析策略筛选到了影响山羊生长性状的显著SNP分子标记，将其用于分子标记辅助选择和基因组选择中，选择对提高山羊生长性状有利的基因型进行留种，从而逐代提高优势等位基因的基因频率，则能加快种羊育种改良的进程，为山羊养殖带来巨大经济效益。
本发明验证了该SNP分子标记对山羊12月龄体重的影响效应，可将其应用于种羊提高12月龄体重的遗传改良中，从而提高后代12月龄体重，进而增加养殖企业市场竞争力。
附图说明
图1：山羊生长性状(12月龄体重)的曼哈顿图，黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于山羊第21号染色体上。
具体实施方式
本发明的实施例通过对500头东宝黑头羊进行全基因组重测序，其中，466头测序深度为低深度1X，34头测序深度为高深度15X，目的在于以高深度测序结果(较少)对低深度测序结果(较多)进行基因型填充，降低测序成本。然后，将重测序数据比对到山羊参考基因组(基因组版本ARS1.2)上，使用Sentieon+Beagle策略对500个样本的所有常染色体进行遗传变异检测和基因型填充，获得SNP位点数据开展山羊12月龄体重相关的GWAS研究，最终筛选到与山羊12月龄体重相关的SNP(rs655589732)，所述SNP标记的位点为山羊参考基因组Capra hircus ARS1.2版本21号染色体上第24772438个核苷酸位点，该位点的碱基是G或T。参阅Ensembl，得到该SNP位点上下游50bp的核苷酸序列，该片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，其中第51位碱基处的T是等位基因突变后的核苷酸，具体核苷酸序列为：
TTTGCTCACATAATTAAAGTATATGCTCATAACGCTACCTTGGATGT AACN(G/T)TTGACTTCATTCTTTTTAAATAGTACGAATTGGAGCAATGTT GGCGTATA，
上述序列的第51位碱基处的N为一个G51-T51的等位基因突变，该突变使SEQ IDNO:1序列产生了核苷酸多态性。GWAS分析结果显示rs655589732与山羊生长性状(12月龄体重)显著相关，基因型为GG或GT的个体的12月龄体重显著高于TT个体，说明A是有利于生长性状提高的等位基因。该分子标记可以作为检测与山羊生长性状相关的分子标记，且当SEQID NO:1所示序列上的第51位核苷酸为G时，有利于山羊拥有较高的12月龄体重，对山羊育种繁育有重要意义。
本发明筛选的分子标记可应用于对山羊生长性状相关基因的基因型或山羊生长性状相关的关联分析中，为山羊生长性状的分子标记辅助选择提供了新的分子标记资源。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
全基因组重测序
1、血样采集及白细胞分离
使用兽用采血针从山羊颈静脉采集5mL血样于EDTA抗凝管中，将抗凝管置于放有大量冰袋的冰盒中带回实验室，将这些样本储存于4℃的冰箱里，进行白细胞提取，具体步骤如下：
(1)取2～3mL血样于10mL EP管内。
(2)往EP内加入超纯水使液体总容积为9mL。
(3)将EP管缓慢上下颠倒20次，静置10min。
(4)将EP管放入离心机内，5000rpm离心10min。
(5)缓慢倒出EP管上清液。
(6)再次加入超纯水使液体总容积为9mL。
(7)重复(3)、(4)、(5)步操作。
(8)将分离完成的白细胞进行编号后放入-80℃冰箱。
2、基因组DNA提取及全基因组重测序
使用天漠生物的基因组DNA小量提取试剂盒(货号：d3024)进行白细胞的DNA提取，具体方法见说明书。将质检合格的基因组DNA送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行二次质检并建库，在华大基因平台进行PE150的全基因组重测序。获得原始下机数据，原始数据格式为FASTQ。34个样本进行高深度全基因组重测序，平均测序深度约为19.72X，总数据量大小为1.4T；466个样本进行低深度全基因组重测序，平均测序深度约为1.65X，总数据量大小为1.6T。
实施例2
基因组比对、遗传变异检测及基因型填充
1、原始测序数据分析及基因组比对
高深度测序数据与低深度测序数据使用同样的流程进行质量控制。
(1)使用Fastp软件对原始数据进行过滤，过滤标准如下：剔除碱基质量值低于20比例超过30％的reads；n碱基大于5％的reads。经上述步骤质控后获得cleanreads。
(2)使用BWA软件将cleanreads比对到山羊参考基因组(Capra_hircus.ARS1.2)。
(3)使用Samtools软件对比对后的BAM文件进行排序。
(4)使用Picard标记重复reads。
(5)Samtools软件构建引索。
2、变异位点检测及基因型填充
(1)GATKHaploytypeCaller按常染色体编号对每个样本分别生成gvcf文件。
(2)GATKCombineGVCFs合并单条染色体各样本gvcf文件。
(3)GATKGenotypeGVCFs按染色体进行群体SNPcalling。
(4)GATKMergeVcfs合并常染色体群体vcf文件。
(5)GATKSelectVariants筛选群体vcf文件SNP。
(6)GATKVariantFiltration标记假阳性SNP位点。
(7)grep命令过滤被标记SNP位点
(8)Plink软件对SNP位点进行过滤(geno0.1--maf0.05--hwe1e-06)。
(9)Beagle软件对缺失位点进行填充。
(10)使用Sentieon Haplotyper和GVCFtyper模块进行群体基因组遗传变异检测和分型。
(11)使用Beagle进行基因型填充，最终获得26131221个高质量SNP。
实施例3
rs655589732分子标记分型方法在山羊生长性状关联分析中的应用
rs655589732分子标记与山羊生长性状(12月龄体重)关联分析：
(1)用于基因型与生长性状关联分析的表型由专业技术人员严格按照测量规范进行测量，测定日龄为360±15天，羊只禁食12-16h、禁饮2h称得的活重，以千克(kg)表示，共计304个样本。
(2)通过rMVP软件使用FarmCPU模型将SNP位点与12月龄体重进行GWAS分析。
FarmCPU模型使用固定效应模型和随机效应模型进行迭代。固定效应分析模型如下：
y＝Xb+Ztut+Sidi+e
式中，y是性状的观测者向量；b是个体固定效应向量，包括SNP前三列主成分、出生季节、出生胎次和初生重；ut是t个伪数量性状核苷酸基因型矩阵作为固定效应；X和Zt分别是b和ut的关联矩阵；Si是第i个SNP标记，di是相应的效应值；e是随即残差效应向量，符合正态分布e～N(0,Iσe 2)。
GWAS分析结果显示rs655589732与山羊生长性状(12月龄体重)显著相关，该标记不同基因型对山羊生长性状的影响见表1，群体内三种基因型个体的12月龄体重差异分析见表2。
表1rs655589732不同基因型对山羊生长性状的影响
注：当标记的P值<0.05/26131221≈1.91E-09(Bonferroni校正)时为显著标记。
表2rs655589732不同基因型山羊的12月龄体重差异分析
注：**P<0.01，***P<0.001。
由表1和2可知，对于山羊12月龄体重性状，基因型为GG或GT的个体的12月龄体重显著高于TT个体，说明G是有利于生长性状提高的等位基因。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测山羊SNP分子标记的试剂或试剂盒在山羊生长性状检测或山羊生长性状育种中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列中第51位碱基为G或T，所述碱基为G有利于提高东宝黑头羊12月龄体重，所述山羊为东宝黑头羊。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括扩增SEQ ID NO:1所示序列的PCR引物。
3.一种检测东宝黑头羊12月龄体重的方法，其特征在于，检测东宝黑头羊的SEQ IDNO:1所示序列中，第51位碱基是G还是T，G是有利于东宝黑头羊12月龄体重提高的等位基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用扩增序列SEQ ID NO:1的PCR引物对待测东宝黑头羊的材料进行基因分型，GG型东宝黑头羊的12月龄体重优于TT型。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用含有扩增SEQ ID NO:1所示序列的PCR引物的试剂或试剂盒进行检测。
6.一种提高东宝黑头羊生长性状的遗传育种方法，其特征在于，确定东宝黑头羊核心群中种羊的权利要求1中所述的SNP分子标记，并根据东宝黑头羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育挑选SNP标记中第51位碱基为GG型和/或GT型的个体，淘汰TT型个体，以逐代提高该位点基因G的频率，从而提高后代东宝黑头羊的12月龄体重性能。
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