CN114410804B - 一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物 - Google Patents

Abstract

本发明属于鱼类养殖技术领域，涉及一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物。本发明提供了一对与罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物，所述检测引物核苷酸序列如SEQ ID NO 1和2所示。利用分子标记SSR613719设计的引物，筛选微卫星标记SSR613719基因型为lm的作为亲本的基因型，进而选择耐寒性能更强的个体。利用本发明的微卫星标记可以快速鉴定并筛选耐寒性能好的罗非鱼亲鱼，从而有助于解决耐寒罗非鱼传统育种中育种周期长、成本高等问题，进而促进耐寒罗非鱼的发展。

Description

一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物

技术领域

本发明属于鱼类养殖技术领域，具体地，涉及一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物。

背景技术

罗非鱼(Oreochromisspp)是世界上最重要的经济鱼类之一，预计2017年产量约为640万吨。中国的罗非鱼产量居世界首位。中国常见养殖罗非鱼有尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)来源的不同品系、蓝罗非鱼(Oreochromisaureus)、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)和红罗非鱼，此外还有许多杂交品系。

罗非鱼原产于热带和亚热带地区，不耐低温。在中国，低温对罗非鱼养殖的影响很大；不耐低温的特点限制了罗非鱼的养殖面积。冬季低温和寒潮常常导致罗非鱼大量死亡造成显著的经济损失。通过提高罗非鱼抗寒性能，不仅可以延长其生长周期、降低越冬死亡率，而且可以减少养殖成本、扩大养殖面积，从而促进行业的可持续性发展(Li SF,Li CH,Dey M,Gagalac F,Dunham R(2002)Cold tolerance of three strains of Niletilapia,Oreochromisniloticus,in China.Aquaculture,213,123-129)。

现有技术中，针对罗非鱼耐寒性能的研究也有不少。通过不同方法和对不同群体的研究发现：罗非鱼的致死温度是有差异的，常见的不同罗非鱼养殖品种存在耐寒性能的差异。对尼罗罗非鱼三个品系的研究发现，吉富罗非鱼死亡温度范围为11℃～8.4℃，“78”品系为9.8℃～7.4℃，“88”品系为11℃～7.4℃；通过五个品系罗非鱼耐寒能力的试验发现：美国奥利亚罗非鱼的耐寒能力最强，极显著高于埃及品系、泰国品系和吉富品系，其中，吉富罗非鱼的耐寒性最低；在尼罗罗非鱼5个品系的耐寒性能比较中发现，耐寒能力高低为：埃及品系＞广东品系＞美国品系＞泰国品系＞吉富品系，半致死温度分别为8.86、9.30、9.39、9.57和10.13℃(林勇,卢其西,杨慧赞,陈忠,黄姻,甘西,曾兰,唐章生(2011)八种品系罗非鱼及其尼奥罗非鱼耐寒性能的比较试验.华北农学报,26,278-282.)；对吉富罗非鱼采用不同速率降温处理，发现半致死低温随降温速率加快而降低(马旦梅,程光平,喻海燕,邓荣志(2010)吉富罗非鱼对不同降温速率胁迫的死亡反应研究.广西畜牧兽医,26,200-203.)；低温胁迫试验发现美国品系、夏奥1号和广东品系的奥利亚罗非鱼耐寒性能有显著差异，半致死温度分别为7.82、8.22、8.44℃；连续三年观测发现，“新吉富”罗非鱼开始死亡和100％死亡的水温为11℃、5.8℃，“吉丽”罗非鱼为12℃、9.2℃，萨罗罗非鱼为13.8℃、12.4℃(王兵,李思发,蔡完其(2011)“新吉富”罗非鱼、“吉丽”罗非鱼及萨罗罗非鱼耐寒力的测定.上海海洋大学学报,20,499-503.)；使用尼罗罗非鱼三个品系为母本，奥里亚罗非鱼为父本，杂交获得的子一代中，埃奥鱼(奥利亚罗非鱼x埃尼尼罗罗非鱼)、湘奥鱼(奥利亚罗非鱼x湘湖尼罗罗非鱼)和吉奥鱼(奥利亚罗非鱼x吉富尼罗罗非鱼)半致死低温分别为：8.63℃、8.23℃、7.60℃(王茂元,钟全福,田田,吴妹英,胡振禧(2016)不同杂交罗非鱼F_1代耐寒性能的研究.福建农业学报,31,849-852.)；Harrison等人对尼罗罗非鱼研究发现，其在13.68℃时开始死亡，而8.68℃时全部死亡。鱼的体重和行为与耐寒性之间存在显著相关性(Charo-Karisa H,Rezk MA,Bovenhuis H,Komen H(2005)Heritability of coldtolerance in Nile tilapia,Oreochromisniloticus,juveniles.Aquaculture,249,115-123.)。

目前，已在一个尼罗罗非鱼与莫桑比克罗非鱼的杂交子代F2当中鉴定了与耐寒相关的位于23号连锁群上的微卫星标记UNH879(Cnaani A,Hallerman EM,Ron M,Weller JI,Indelman M,Kashi Y,Gall GAE,Hulata G(2003)Detection of achromosomal regionwith two quantitative trait loci,affecting cold tolerance and fish size,in anF-2tilapia hybrid.Aquaculture,223,117-128.)。在杂交罗非鱼(O.mossambicusxO.aureus)x(O.niloticusx Sarotherodongalilaeus)的家系当中，使用微卫星和AFLP标记鉴定了位于23号连锁群上的耐寒性状相关的QTL(Moen T,Agresti JJ,Cnaani A,Moses H,Famula TR,Hulata G,Gall GAE,May B(2004)Agenome scan of afour-way tilapia cross supports the existence of a quantitative trait locusfor cold tolerance on linkage group 23.Aquaculture Research,35,893-904.)。在一个尼罗罗非鱼家系当中鉴定到两个微卫星标记(UNH916和UNH999)与耐寒性状共分离(ZhuHP,Liu ZG,Lu MX,Gao FY,Ke XL,Huang ZH(2015)Screening and identification ofmicrosatellite markers associated with cold tolerance in Nile tilapia(Oreochromisniloticus).Genetics and Molecular Research,14,10308-10314.)。但是，目前鉴定的耐寒性状相关QTL未在其他群体中进行验证，且区间较大，难以有效应用于不同品系罗非鱼的育种。罗非鱼品系之间存在差异，不同群体的耐低温QTL和性状关联分子标记也存在差异，因此，十分有必要针对不同品系的罗非鱼进行耐低温QTL和性状关联分子标记的鉴定，为耐低温罗非鱼的分子辅助育种提供支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有罗非鱼耐低温性状相关分子标记辅助育种的不足，提供一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物。本研究旨在通过基因组手段，鉴定罗非鱼耐低温性状的遗传网络，开发紧密连锁的分子标记，为选育罗非鱼抗寒品系奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物。

本发明的第二个目的是提供所述的检测引物在鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述引物在耐低温罗非鱼分子辅助育种中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

本发明通过ddRAD-seq技术、高通量测序、基因分型技术以及全基因组关联分析(GWAS)获得罗非鱼耐低温性状相关的数量性状座位(QTL)区间，在QTL区间内开发微卫星标记，通过微卫星标记从遗传上鉴定罗非鱼耐寒的遗传方式。进一步通过已开发的微卫星标记方法，快速鉴定耐寒罗非鱼亲本，用于耐寒罗非鱼的进一步育种。

本发明要求保护一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，

SEQ ID NO.1：GGCCTTCGTGTGGGTATTGTA；

SEQ ID NO.2：AAACGTGTGATACTCGGACAC。

本发明还要求保护所述的检测引物在鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记中的应用。

本发明还要求保护所述的检测引物在耐低温罗非鱼分子辅助育种中的应用。

所述的检测引物在制备鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种检测罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示的检测引物。

优选地，所述试剂盒还含有PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应体系为2×PCR DS Mix 9～11μL，所述检测引物的引物对的上下游引物各0.8～1.0μL，模板DNA 3～5μL，补充水至总体积20μL。

更进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应体系为2×PCR DS Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，模板DNA 4μL，补充水至总体积20μL。

进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应条件为94～95℃预变性3min，变性94～95℃30s，退火58～61℃40s，延伸71～72℃30s，循环数为35，71～72℃延伸10min。

更进一步优选地，所示试剂盒的PCR试剂的反应条件为94℃预变性3min，变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s，循环数为35，72℃延伸10min。

本发明还要求保护所述的试剂盒在鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记中的应用。

本发明还要求保护所述的试剂盒在耐寒罗非鱼分子辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首先针对罗非鱼耐寒性状进行了QTL分析，在此基础上开发了性状关联的微卫星标记。利用分子标记SSR613719设计的引物，筛选微卫星标记SSR613719基因型为lm的作为亲本的基因型，进而选择耐寒性能更强的个体。利用本发明的微卫星标记可以快速鉴定并筛选耐寒性能好的罗非鱼亲鱼，从而有助于解决耐寒罗非鱼传统育种中育种周期长、成本高等问题，进而促进耐寒罗非鱼的发展。

附图说明

图1为本发明实施例1罗非鱼群体低温处理下的平均存活时间。

图2为本发明吉富罗非鱼全同胞家系耐寒性状的QTL分析结果；图中基因组水平上的LOD阈值为4.5，p为0.05。

图3为本发明采实施例2罗非鱼群体低温处理下的平均存活时间。

图4为本发明微卫星标记SRR613719群体基因分型；M:分子量标准；泳道1-16低温敏感性个体，泳道17-32低温耐受型极端个体；标记SRR613719在群体中共检测到lm和ll两种基因型。

图5为本发明微卫星标记SSR613719的基因型与罗非鱼耐寒性能之间的关系；标记SRR613719在群体中有lm和ll两种基因型；纵坐标为具有特定基因型的个体数。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1全同胞家系罗非鱼耐寒性状的全基因组关联分析

一、实验方法

1、实验鱼的家系构建

采用一个由一对吉富品系的罗非鱼亲鱼产生的全同胞家系(子代)作为QTL定位的实验材料。该家系获取自广州花都五龙岗罗非鱼良种场，在中山大学生命科学学院循环水养殖系统中养殖，实验用鱼约600尾。

2、低温应激处理和性状采集

采用该吉富罗非鱼全同胞家系(N＝600)开展急性低温应激处理，室内的低温应激实验在中山大学生命科学学院的循环水养殖系统中进行，养殖水温的起始温度为26℃，使用冷水机以1℃/h的速度进行降温，待温度到达15℃，减缓降温速度，观察鱼的反应。从第一条鱼昏迷起开始计时，记录每条鱼昏迷时间，作为罗非鱼耐寒性的性状值。同时，将昏迷的鱼捞出，剪取鳍条样本保存在无水乙醇中，用于后续的DNA提取。

3、简化基因组测序文库的构建

利用磁珠基因组DNA提取试剂盒提取所有取样个体基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳技术检测所有样本个体DNA质量，并利用Qubit 3.0检测DNA浓度，保证用于构建基因文库的DNA质量与浓度达标。

采取ddRAD-seq技术构建文库：利用EcoRI和MspI两种常见的限制性内切酶进行双酶切，得到限制性酶切片段；利用T4连接酶进行接头连接，其后进行PCR扩增；对PCR扩增后的产物采用磁珠法进行纯化。对纯化的DNA目的片段采用低熔点琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，观察到一条主要集中在280～480bp之间弥散的条带；使用Qubit 3.0对其进行浓度测定后，等量混合成一个DNA文库，然后将DNA文库进行琼脂糖凝胶电泳，分离回收得到目标DNA片段，将最终得到的DNA片段进行高通量测序。

4、混合DNA文库的高通量测序

采用Illumina HiSeqTM2500进行高通量测序，对测序得到的原始测序序列，即rawdata，进行过滤，去掉低质量的reads、接头、过多的N的reads，获得clean data。

5、QTL作图分析

5.1SNP分子标记的获取

首先根据连接接头的序列对测序数据进行拆分，使用bowtie2软件将每个个体的测序数据比对NCBI上公布的尼罗罗非鱼的参考基因组上。使用Samtools软件获取SNP位点，对获得的SNP位点进行过滤，过滤掉子代测序质量小于10、个体测序深度小于10、总深度小于200的位点；删除群体中最小等位基因频率小于0.1，缺失率大于2％的SNP；亲本中，过滤掉测序质量不大于10，测序深度不大于20，且存在插入或缺失的SNP。最后将获得的SNP位点与亲本中鉴定的SNP位点进行合并，提高数据的可靠性。

5.2基于SNP标记和性状值的QTL定位分析

根据测序获得的SNP位点和罗非鱼耐低温性状值，使用软件MapQTL 6.0(www.kyazma.nl/index.php/MapQTL/)进行QTL分析。LOD值的大小用于判定连锁关系，本发明中的LOD值表示SNP标记与罗非鱼耐寒性状的连锁关系，LOD值为相互连锁与互不连锁两种可能性之比，LOD值越大，表明该标记与罗非鱼耐寒性状的相关性越高。进行50000次的置换检验(Permutation test)，获取染色体水平和全基因组水平上的LOD值显著性范围，相对累计值为0.95。首先进行区间作图分析，使用自动辅因子选择分析，确定QTL区域内的辅因子，然后进行复合区间作图，最终确定高于全基因组阈值以上的为显著的QTL区间。

二、实验结果

1、吉富罗非鱼实验家系耐寒性能

对该吉富罗非鱼全同胞家系(N＝600)开展急性低温应激处理，该群体的平均体重为12.44±3.97g，罗非鱼在8.0～8.5℃时开始死亡。定义第一条鱼死亡时间为0min，随后记录每条鱼的死亡时间为耐寒性状值。

急性低温应激处理的结果表明：该群体第一条鱼到最后一条鱼存活时间相差227min。低温处理开始时，罗非鱼相继死亡的时间间隔较长，实验中期罗非鱼大量集中快速死亡，之后死亡时间间隔延长，但前期罗非鱼存活时间的标准差仍比后期大。

2、罗非鱼耐寒性状相关QTL

本实施例中用于测序文库构建的为该全同胞家系群体中最耐寒和最不耐寒的两个群体，按照死亡时间进行排序，选取低温处理下最后死亡的个体作为最耐寒组，选取低温处理下最先死亡的个体作为最不耐寒组，不耐寒组和耐寒组分别有48个个体，两组罗非鱼群体低温处理下的平均存活时间如图1所示，从图1中可知，不耐寒组低温处理下平均存活时间为40.34min(SD＝24.03min)，耐寒组平均存活时间为215.75min(SD＝7.00min)。

通过ddRAD-seq技术鉴定了最耐寒组和最不耐寒组的96个个体的全基因组SNP，同时利用全基因组重测序技术鉴定了该全同胞家系的两个亲本基因组上的SNP。通过Samtools软件获取SNP位点，进一步过滤掉测序质量小于10、个体测序深度小于10、总深度小于200的位点，最终剩下81,279个SNP位点；删除群体中最小等位基因频率小于0.1，缺失率大于2％的SNP，最终得到1,634个高质量的SNP标记；在亲本当中，要求测序质量大于10，测序深度大于20，且不存在插入或缺失，共鉴定出2,151,523个SNP。比较亲本和其子代间的SNP位点，其子代SNP位点中有1,160个出现在亲本的SNP中，SNP标记在染色体中的分布情况如表1所示。

表1 SNP标记在染色体中的分布情况

根据表1的1,160个SNP标记，结合低温下罗非鱼的存活时间进行QTL分析。吉富罗非鱼全同胞家系耐寒性状的QTL分析结果如图2所示，从图2可以发现，18号连锁群上存在基因组水平显著(p＝0.05)的SNP标记chrLG18_19316719，LOD值为5.6，表型解释量为21.5％(图2)。

说明，与罗非鱼耐寒性状关联较显著的QTLs区间为：chrLG18_19316719。

实施例2 QTL区间的验证

一、实验方法

1、个体选择

基于耐寒实验过程中的死亡先后时间对群体中每个个体的耐寒性能进行排序，选取实施例1的全同胞家系的96个极端耐寒个体(最后死亡的96个个体，作为极端耐寒组)和96个极端不耐寒个体(最先死亡的96个个体，作为极端不耐寒组)进行QTL候选区间的验证。

两组罗非鱼群体低温处理下的平均存活时间如图3所示，从图3中可知，192个罗非鱼个体中，极端不耐寒组的存活时间为81.54min(SD＝47.57min)，极端耐寒组的平均存活时间为203.75min(SD＝13.86min)。

2.提取样本DNA

按照实施例1的方法提取两组罗非鱼群体192个个体基因组DNA，作为模板DNA。

3、引物设计

基于实施例2的1.1中得到的与罗非鱼耐寒性状关联较显著的QTLs区间：chrLG18_19316719，采用ddRAD测序技术和GWAS分析技术在染色体LG18上定位了与罗非鱼耐寒性状相关的QTL区域，在SNP峰值附近开发微卫星标记，在LG18染色体11Mb到20Mb间，共开发出在亲本之间存在多态性(也即子代中存在多态性)的2对微卫星标记引物。

在UCSC上下载QTL区间的基因组序列，使用在线微卫星序列分析工具Tandemrepeat finder分析QTL区域内的微卫星信息。根据微卫星重复单元和重复数目，选择重复单元2～4bp，评分在80～100之间的微卫星序列，使用设计工具在QTL峰值附近的微卫星序列的侧翼设计引物，设计的2对微卫星标记引物信息如表2所示。

表2 2对微卫星标记引物信息

3、PCR反应

使用东盛PCR MIX试剂盒进行微卫星标记的扩增。PCR反应体系为：2×PCR DS Mix10μL，上下游引物各0.8μL，上述模板DNA 4μL，补充水至总体积20μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s，循环数为35，72℃延伸10min。

4、基因型分析

取扩增产物3μL通过8％PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳及银染显色对PCR产物进行检测和基因分型。聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测具体步骤如下：

(1)取纯水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％)280μL，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入梳子，静置半小时，待其凝固；待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次进行点样，每孔3μL；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10min后，将电压调到600V，继续电泳1.5h。

(2)电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500mL的染色液(1‰AgNO₃)，染色约5min后，将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5～10s，倒掉纯水，加入显色液(显色剂配方为：20g NaOH+0.5gNa₂CO₃+4mL37％甲醛溶液加入1L纯水中，使用前置入冰中预冷)，显色约10～15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察条带并拍照，根据条带位置，通过人工读带的方式，记录每个个体的基因型。

二、实验结果

实验发现：SSR415219离QTL峰值chrLG18_19316719相距较远，近2Mb，关联效果不显著，而SSR613719与QTL峰值chrLG18_19316719很近，所以关联显著。

微卫星标记SRR613719群体基因分型电泳图如图4所示，SRR613719扩增产物在200bp～300bp附近，其在群体中共检测到lm和ll两种基因型(图4中已经注明了部分代表性个体的基因型)，条带存在多态性，与目标性状控制连锁。说明SSR613719位于已定位的QTL区间。

对极端耐寒组和极端不耐寒红罗非鱼组PAGE胶电泳图进行基因型统计分析，统计图如图5。

从图5可以看出，96个耐寒组个体和96个不耐寒组个体中，SSR613719标记能够得到有效扩增，其基因型与罗非鱼耐寒性状存在显著相关。SSR613719在群体(192个个体)中的基因型进行分析：发现96个耐寒组个体中，35个个体具有ll基因型，而60个个体具有lm基因型，1个个体没有获得有效的基因型数据；96个不耐寒组个体中，54个个体具有ll基因型，而42个个体具有lm基因型；标记SSR613719在两个群体中的基因分型数据，通过卡方检验，耶茨校正后的卡方统计值为6.4687，耐寒组当中基因型为lm的个体比例显著高于不耐寒组(p＝0.010979)，因此，微卫星标记所在基因组区域确实与罗非鱼的耐寒性显著相关。采用两种不同标记类型开展的独立实验都证明了该QTL区间内的DNA水平变异与耐寒性状显著相关。因此，获得的结果证实了通过SNP数据进行的QTL作图所鉴定的耐寒QTL的可靠性。

标记SSR613719在群体中共检测到两种基因型(ll和lm)，且两种基因型在耐寒组和不耐寒组间分布频率存在显著性差异(p＝0.010979)。其中，基因型ll在不耐寒组的基因型频率为0.56，而在耐寒组的基因型频率为0.36，基因型lm在不耐寒组的基因型频率为0.44，而在耐寒组的基因型频率为0.63。由此可知，ll为罗非鱼低温敏感相关基因型，而lm为耐寒相关基因型，具有lm基因型的个体耐寒性更强。选择lm基因型的个体耐寒的可能性(60/102＝59％)要比选择ll的可能性(39％)高很多。在标记辅助育种中，我们可以基于个体标记SSR613719的基因型(lm)选择耐寒性能更强的个体。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

湖南银鱼农业科技有限公司

<120> 一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccttcgtg tgggtattgt a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacgtgtga tactcggaca c 21

Claims (6)

1.一对用于吉富罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。

2.一种检测吉富罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还含有PCR试剂、PAGE胶电泳试剂和银染显色试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂的反应体系为2×PCR DS Mix9～11μL，权利要求1所述检测引物的引物对的上下游引物各0.8～1.0μL，模板DNA 3～5μL，补充水至总体积20μL。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂的反应条件为94～95℃预变性3min，变性94～95℃30s，退火58～61℃40s，延伸71～72℃30s，循环数为35，71～72℃延伸10min。

6.权利要求1所述引物或权利要求2所述的试剂盒在耐寒吉富罗非鱼分子辅助育种中的应用。

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