CN114231608B - 一种鉴别杂色鲍遗传性别的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别杂色鲍遗传性别的分子标记及其应用。所述分子标记表现为分子标记表现为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。杂色鲍个体的一对同源染色体的其中一条缺失SEQ ID NO:1核苷酸序列，遗传性别为雄性；杂色鲍个体的一对同源染色体均没有缺失SEQ ID NO:1核苷酸序列，遗传性别为雌性。检测时，采用SEQ ID NO:2和3为引物进行PCR扩增，当所述扩增产物为2个片段，长度分别266bp和243bp，所述待测杂色鲍的遗传性别为雄性；当所述扩增产物只有1个片段，长度为266bp，所述待测杂色鲍的遗传性别为雌性。杂色鲍性腺分化前后均适用于该方法。

Description

一种鉴别杂色鲍遗传性别的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及水产生物技术领域中的贝类遗传性别鉴定和性别控制技术，尤其涉及一种鉴定杂色鲍遗传性别的分子标记及其应用。
背景技术
水产生物的性别可以由遗传决定也可以由环境因素决定。即使遗传决定性别的物种，也易发生性逆转。因此，遗传决定性别水产生物的性别包括遗传性别和生理性别两个层面。遗传性别即决定性别方向的遗传组成，生理性别即性腺等实际表现的性别。在水产养殖和性别控制育种中，常常存在研究对象遗传性别与生理性别不一致的情况，需要鉴定研究对象的遗传性别。
水产生物的经济性状常常具有性别二态性。因此，通过性别控制技术生产单性或不育苗种在水产养殖中具有良好的应用前景。水产生物性别控制育种过程中，需要通过人工诱导培育性反转个体(生理性别与遗传性别相反)、超雄个体(雄性异配，YY)或超雌个体(雌性异配，WW)。鉴定这些个体的遗传性别是性别控制育种的一个必要的环节。在没有性别分子标记的情况下，一般用后裔测定法进行鉴定。但后裔测定法存在周期长、成本高的缺点。性别分子标记是指与性别紧密连锁的DNA标记。性别分子标记可以通过PCR进行检测，进而根据PCR检测结果确定生物体的遗传性别。与后裔测定法相比较，基于性别分子标记的PCR检测鉴定水产动物的遗传性别具有简便、快速和经济等优势。目前，性别分子标记已在多种水产动物中开发成功，并应用于性别控制育种，极大地提高了性别控制育种效率，缩短了育种周期。但由于性别标记在物种间通常不能通用，特定物种的性别分子标记需要专门开发。
杂色鲍(Haliotis diversicolor)属原始腹足目、鲍科、鲍属，是一种重要海水养殖对象。由于雄性的成活率和品质较高，因此杂色鲍性别控制相关技术具有潜在的商业应用价值。性别分子标记是性别控制育种的重要工具。然而，迄今，杂色鲍的性别分子标记在国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别杂色鲍遗传性别的分子标记。
为实现上述目的，本发明提供一种杂色鲍遗传性别相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记表现为核苷酸序列SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性；杂色鲍个体的一对同源染色体的其中之一缺失了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的，遗传性别为雄性；杂色鲍个体的一对同源染色体均没有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，遗传性别为雌性。
本发明还提供一种用于检测所述遗传性别分子标记的引物对，其特征在于：所述引物具有SEQ ID NO:2-3所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种用于检测所述分子标记的试剂盒，其特征在于，含有所述引物对。
本发明还保护所述分子标记或所述引物对或所述试剂盒在杂色鲍育种和育苗中的用途。
本发明还提供一种鉴别杂色鲍遗传性别的方法，其特征在于，对待测杂色鲍进行权利要求1所述分子标记的检测，以确定所述待测杂色鲍的遗传性别。
进一步，所述的方法包括：
利用权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒，对待测杂色鲍DNA进行PCR扩增；检测扩增片段的数目及长度，以及
基于所述扩增片段的数目和长度，确定杂色鲍的遗传性别，
其中，当扩增产物具有两条带，长度分别为266bp和243bp，则所述待测杂色鲍一对同源染色体的其中之一缺失了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，所测杂色鲍的遗传性别为雄性；当扩增结果只有一条带，长度为266bp，所述待测杂色鲍一对同源染色体均没有缺失SEQID NO:1所示核苷酸序，所测杂色鲍的遗传性别为雌性。
进一步，利用凝胶电泳，优选琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测所述扩增片段的数目和长度。
本发明还提供一种杂色鲍辅助育种方法，其特征在于，所述方法包括：
通过权利要求5-7任一项所述方法，检测权利要求1所述分子标记，以便确定待测杂色鲍的遗传性别。
本发明的申请人比较了杂色鲍雌雄性基因组上一处序列差异(见图1和图2)，经过分析发现：SEQ ID NO:1为与杂色鲍性别相关的分子标记。
5’-TTTTTGTATGGTGTTTTAAAACG-3',SEQ ID NO:1
本发明提供一种用于鉴定杂色鲍性别的引物对，所述引物对序列为：
引物F:5'-TACAAGTGTTCCAGTCGTGA-3',SEQ ID NO:2
引物R:5'-CACCTGTAGTTCAACACTCAG-3',SEQ ID NO:3
本发明还提供一种鉴定杂色鲍分子标记的方法，该方法以待测杂色鲍基因组DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，根据扩增产物的数目和大小来判断。
上述方法所述的PCR扩增，其反应体系为ddH2O 14.2μl；10×Buffer 2μL；2.5mM的dNTP 1.8μL；10mM的上游引物0.4μL；10mM的下游引物0.4μL；Taq酶0.2μL；30ng/μL DNA模板1μL；总体积20μL。上述方法所述的PCR扩增，其扩增程序为：进一步，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃延伸10min。所述的方法，进一步地，将PCR产物通过3％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检查扩增产物的电泳条带，并通过与分子量标准品电泳结果比较确定扩增产物的大小，当扩增产物具有两条片段，长度分别为266bp和243bp时，则所述待测杂色鲍的一对同源染色体的其中之一缺失了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，所测杂色鲍的遗传性别为雄性；当扩增结果只有一条266bp带，所述待测杂色鲍一对同源染色体上均没有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的插入，所测杂色鲍的遗传性别为雌性。
本发明提供的基于性别分子标记的PCR鉴定杂色鲍的遗传性别，具有检测周期短、适用整个生活史，适用材料范围广等优点。具体表现为：
1)检测周期短：本发明方法取样、提取DNA和PCR检测遗传性别，检测周期仅为1～2天，远远短于后裔测定法。
2)适用整个生活史：不仅可以适用于性腺分化清晰的生活阶段，也适用于性腺尚未发育或分化的早期阶段；
2)适用材料范围更广：本发明方法不仅可以鉴别普通养殖杂色鲍的性别，还可以用于一些特殊的材料性染色体组成的鉴定，如超雄鲍、伪雄鲍(生理性雄鲍)、伪雌鲍(生理性雌鲍)、精子和BAC克隆等。
本发明的分子标记可以简便、快速、稳定地鉴别出杂色鲍不同个体的遗传性别，可以应用于皱纹盘鲍的性别控制育种，培育皱纹盘鲍单性或不育苗种，提高养殖效益，最终增加皱纹盘鲍养殖的经济收益；同时，也将有益于皱纹盘鲍性别决定机制相关科学研究的开展。
附图说明
图1是本发明公开的杂色鲍雌性和雄性间跨过候选雄性特异缺失的核酸序列比对图。F-9表示的是雌性第9号样本，M-9表示的雄性9号样本，F-mix表示的是雌性混池样本(混合了15个不同雌性杂色鲍样本)，M-mix表示的是雄性混池样本(混合了15个不同雄性杂色鲍样本)。其余编号依此类推。
图2是本发明公开的引物对预期扩增片段的核苷酸序列。下划线所示为长度23bp雄性杂色鲍特异缺失的序列SEQ ID NO:1；阴影所示为引物对SC9的序列(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)。
图3是本发明公开的采用引物SC9验证杂色鲍雌雄基因组一处序列差异的电泳图，其中M表示DNA分子量标准品DL2000。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
实施例1：
本发明的申请人以在中国福建晋江的晋江福大鲍鱼水产有限公司收集的杂色鲍为样本，构建杂色鲍基因组重测序数据，雌雄性各11组，分析这些重测序数据，筛选出杂色鲍的性别二态插入缺失位点(Indel)(即雌性全部纯合而雄性全部杂合的位点)。结果显示，3号染色体和9号染色体上性别二态位点最多(见表1)。
表1杂色鲍性别二态InDel的染色体分布结果表
染色体编号 数目(百分比)
2 1(4.8％)
3 8(38.1％)
4 2(9.5％)
9 6(28.6％)
12 3(14.3％)
13 1(4.8％)
Total 21
进一步检测3号和9号染色体上的性别二态InDel，最终发现9号染色体一处长度为23bp的雄性杂色鲍特异的缺失(见图1)，即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。发明人根据其两端序列设计了引物对SC9(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)(见图2)。
实施例2：
利用本发明所述的引物对SC9(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对已通过检测性腺确定性别的杂色鲍(来源于中国福建晋江的晋江福大鲍鱼水产有限公司)基因组DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖电泳图谱比较，验证本发明方法的准确性和特异性。具体方法步骤如下：
取检查性腺确定性别的杂色鲍雌性个体和雄性个体各24只，剪取肌肉组织，放入到100％乙醇溶液中固定，-20℃保存，用于基因组的提取；采用酚氯仿法提取基因组DNA，所得的基因组DNA统一稀释到30ng/μL作为PCR模板。
引物F:5'-TACAAGTGTTCCAGTCGTGA-3',SEQ ID NO:2
引物R:5'-CACCTGTAGTTCAACACTCAG-3',SEQ ID NO:3
以所述引物进行PCR扩增。反应体系为：反应体系为ddH2O 14.2μl；10×Buffer 2μL；2.5mM的dNTP 1.8μL；10mM的上游引物0.4μL；10mM的下游引物0.4μL；Taq酶0.2μL；30ng/μL DNA模板1μL；总体积20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃延伸10min。
将PCR产物通过3％琼脂糖电泳检测扩增产物，检查扩增产物的电泳条带，对图片的条带进行分析。
电泳结果(如图3)显示，全部雄性个体扩增产物具有两条片段，长度分别为266bp和243bp；而全部雌性个体扩增产物具有一条长度为266bp的片段。PCR检测结果与性腺观察确认的性别完全一致。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0003457195130000061
Figure BDA0003457195130000071
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种鉴别杂色鲍遗传性别的分子标记及其应用
<130> JMDXL-21066-CNI
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 杂色鲍
<400> 1
tttttgtatg gtgttttaaa acg 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacaagtgtt ccagtcgtga 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacctgtagt tcaacactca g 21

Claims (9)

1.一种杂色鲍遗传性别相关的分子标记片段，其特征在于，所述分子标记表现为核苷酸序列SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性；杂色鲍个体的一对同源染色体的其中之一缺失了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的，遗传性别为雄性；杂色鲍个体的一对同源染色体均没有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，遗传性别为雌性。
2.一种用于检测权利要求1所述遗传性别分子标记片段的引物对，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示。
3.一种用于检测权利要求1所述分子标记片段的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述引物对。
4.权利要求1所述分子标记片段或权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒在杂色鲍育种和育苗中的用途。
5.一种鉴别杂色鲍遗传性别的方法，其特征在于，对待测杂色鲍进行权利要求1所述分子标记片段的检测，以确定所述待测杂色鲍的遗传性别。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
利用权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒，对待测杂色鲍DNA进行PCR扩增；
检测扩增片段的数目及长度，以及
基于所述扩增片段的数目和长度，确定杂色鲍的遗传性别，
其中，当扩增产物具有两条带，长度分别为266bp和243bp，则所述待测杂色鲍一对同源染色体的其中之一缺失了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，所测杂色鲍的遗传性别为雄性；当扩增结果只有一条带，长度为266bp，所述待测杂色鲍一对同源染色体均没有缺失SEQ IDNO:1所示核苷酸序，所测杂色鲍的遗传性别为雌性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，利用凝胶电泳，检测所述扩增片段的数目和长度。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述凝胶电泳为琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
9.一种杂色鲍辅助育种方法，其特征在于，所述方法包括：
通过权利要求5-8任一项所述方法，检测权利要求1所述分子标记片段，以便确定待测杂色鲍的遗传性别。
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