CN114480676B

CN114480676B - SNPs分子标记g.43815G＞A及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用

Info

Publication number: CN114480676B
Application number: CN202210236775.3A
Authority: CN
Inventors: 蒋永清; 姜俊芳; 单慧丽; 吴建良; 郑开之
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114480676A

Abstract

本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种湖羊体高性状相关SNPs分子标记g.43815 G＞A、引物对、试剂盒及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用。一种与湖羊体高性状显著相关的SNPs分子标记，该分子标记定位为g.43815 G＞A；其中AA型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。通过本发明提供的分子标记及其引物对和试剂盒，采用相关检测方法，能够筛选出湖羊的体高性状，起到辅助育种作用。

Description

SNPs分子标记g.43815G＞A及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用

技术领域

本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种湖羊体高性状相关SNPs分子标记g.43815G＞A、引物对、试剂盒及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用。

背景技术

湖羊是我国著名的一个绵羊品种，以繁殖力强、早期生长速度快、适应舍饲及高湿高热环境等特点而出名。但湖羊产在肉性能方面与杜泊羊、德国美利奴羊等国外肉用绵羊品种还存在较大差异。因此，非常有必要对湖羊生长性能进行选育，提高湖羊的产肉性能。

本申请人已有授权中国发明专利(公开号：CN109251986A、CN109182553A、CN109251987A、CN109251985A、CN109182554A和CN109055579A)公开了利用GWAS技术筛选的湖羊体尺性状候选功能基因及SNPs，并通过SNPs的群体验证，获得了可用于分子标记辅助育种的SNPs，可用于湖羊肉用性状分子标记辅助育种和湖羊肉用系核心群个体的早期选育。

ARHGAP24基因是Rho GTP酶激活蛋白家族的成员，可作为Rho GTP酶的负调节剂，并影响肌动蛋白重塑、细胞极性、细胞迁移、分化和发育。ARHGAP24(也称为p73-RHOGAP或FilGAP)位于细胞质和细胞连接处，在血管生成过程中发挥重要的调节作用。

目前发现ARHGAP24基因参与肾脏中癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭，在该癌细胞中作用是由活化的ARF6诱导的乳腺癌细胞造成伪足形成，并且通过增加Rac1活性促进胶质母细胞瘤的肿瘤生长。肺腺癌中出现ARHGAP24表达下调，将会出现癌细胞的紫杉醇耐药表型。

在哺乳动物中Rho GTP家族与多种细胞功能有关，包括肌动蛋白细胞骨架的重组，细胞生长控制，转录调控和膜运输，在动物生长发育过程中还与肺发育，呼吸系统发育，血管形态发生，心脏发育和转录调控有关。在关于杜洛克猪的生产性状的GWAS分析中已经发现ARHGAP24与生产性状显著相关。结合此前的研究，ARHGAP24中的突变可能与细胞生长调控中的某些功能有关，从而从一些未知的通路调控进一步影响了湖羊的生长特性。

发明内容

为了解决分子标记育种中现有技术的欠缺和现实需要求，本发明的目的是提供一种与湖羊体高性状显著相关的SNPs分子标记及其检测引物对和试剂盒，并提供所述分子标记的筛选方法和在湖羊分子标记育种中的应用。

为了实现上述的发明目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种与湖羊体高性状显著相关的SNPs分子标记，该分子标记定位为g.43815G＞A。

进一步，本申请提供了一种用于检测所述SNPs分子标记的引物对。

进一步，本申请提供了所述的引物对扩增获得的扩增产物，该扩增产物的序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，本申请提供了一种用于扩增所述的扩增产物的引物对。

作为优选，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

进一步，本申请提供了一种包含所述引物对的试剂盒。

进一步，本申请提供了所述的SNPs分子标记、引物对和试剂盒在筛选湖羊体高性状和湖羊分子标记育种中的应用；其中AA型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。

进一步，本申请还提供了一种筛选湖羊体重体尺性状的方法，该方法包括以下步骤：提取湖羊外周血基因组DNA，采用所述的引物对进行PCR扩增，对扩增产物中所述的SNPs分子标记进行检测，从而筛选出湖羊体高性状；其中AA型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。

作为优选，所述PCR扩增程序为：94℃预变性，2min；98℃变性，10sec，53℃退火，30sec，68℃延伸，30sec，35个循环；4℃保存，∞；所述PCR扩增体系如下：

进一步，本申请还提供了所述方法在筛选湖羊体高性状和湖羊分子标记育种中的应用；其中AA型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。

本发明以214只湖羊为试验材料，以ARHGAP24基因为候选基因，采用PCR扩增，产物直接测序以及序列分析技术筛选SNPs，并通过关联分析筛选出显著影响湖羊体重、体尺性状的SNP位点。

本发明发现，在ARHGAP24基因内含子1部分区内有15个SNPs,其中与湖羊体重、体尺性状显著相关的SNPs位点有4个：1.g.43756G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。2.g.43815G＞A与湖羊体高显著相关，AA型个体的体高显著高于GG型个体(P＜0.05)，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。3.g.43851G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。4.g.43917A＞G与湖羊体长和日增重显著相关，AA与GG型个体的体长显著高于AG型个体(P＜0.05)，AA与GG相比差异不显著(P＞0.05)，GG型个体断奶到六月龄日增重显著高于AA型个体，AG型个体与AA，GG相比差异不显著。

附图说明

图1：本发明检测引物的PCR扩增序列，其中灰色的即为分子标记的位点。

图2：湖羊ARHGAP24基因SNPs检测引物的PCR扩增(M：DL5000，从上到下依次是5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1～8为目的片段扩增结果)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

1.试验材料

1.1试验动物样本来源

试验动物均来自杭州庞大农业开发有限公司的湖羊肉用新类群核心群，共213只，饲养管理按照肉羊标准的饲养管理方法进行饲养。每个个体采集颈静脉血10mL，置于EDTA抗凝管，-20℃保存。

1.2体尺指标的测定

湖羊体尺测量包括体(斜)长、体高和胸围。每只羊至少测量3次，取平均值作为最终的测量结果。具体测定性状及测定方法见表1。

表1测定性状及测定方法

2.试验方法

2.1外周血基因组DNA提取，按照已知常规方法进行。

2.2DNA浓度和纯度检测，按照已知常规方法进行。

2.3湖羊ARHGAP24基因PCR扩增及SNPs检测。

引物的设计根据Acc:101119904内含子1的部分区域，引物由杭州有康生物技术有限公司合成，引物序列、扩增片段长度及退火温度见表2。

表2湖羊ARHGAP24基因PCR扩增引物

PCR扩増体系为25μL，PCR反应程序见表3。具体成分见表4。

表3湖羊ARHGAP24基因PCR扩增程序

表4湖羊ARHGAP24基因PCR扩增体系

2.4PCR产物的检测

取5μL的PCR产物上样于1.0％的琼脂糖凝胶，使用DL 5000为Marker标记，200V电压电泳15min左右，EB染色5min，于凝胶成像仪中观察扩增条带的有无，并拍照。

2.5PCR产物的测序

每个样品均按照表2列出的引物分别进行扩增，扩增产物交由杭州擎科梓熙生物技术有限公司，进行正、反向的双向测序，直至双向测序结果一致。

2.6序列分析

使用Mutation Surveyor 5.02(Softgenetics，美国)软件分析每个个体的正、反向测序峰图，以Acc:101119904内含子1的部分区域为参照序列，确定每个个体ARHGAP24基因的突变位置和突变方式。测序结果异常或正、反向测序结果不吻合的个体需进行二次测序，直至PCR产物正、反向测序分析结果完全一致。

2.7数据统计与分析

使用little Programe计算PIC值。

使用PopGen 32软件计算各SNPs的位点杂合度、Shannon信息含量、基因频率、基因型频率，并检测各位点是否符合Hardy-Weinberg平衡。

多态信息含量分析：

PIC(Polymorphism information content)，表示一个后代所获得某个等位基因来自于它的亲本的同一个等位基因的可能性，是衡量等位基因片段多态性的理想指标计算公式为：

P_i和P_j分别为第i个和第j个等位基因频率；n为等位基因数。

位点杂合度：

He(heterozygosity)指每个基因座上所存在的杂合个体的平均频率。杂合度能客观地反应群体的遗传变异水平，平均杂合度值越大，表明群体内遗传差异也越大，遗传多样性丰富，遗传潜力大，应用于动物遗传育种研究效果好；其数值越低，表明遗传一致性越高，说明群体内遗传变异小，遗传潜力也小。计算公式为：

p_i表示第i个等位基因频率。

Shannon信息含量：

SIC(shannon information content)，计算公式为：

SIC＝-ClogPi

其中：Pi为第i个等位基因在群体中的频率，C为常数。

基因频率和基因型频率：

①基因型频率＝基因型个体数/该群体个体数×100％；

②基因频率＝纯合基因型频率+1/2×杂合基因型频率。

关联分析：

使用一般线性模型(General Linear Model，GLM；SPSS 20)挖掘与湖羊肉用新类群核心群体重、体尺性状关联的SNPs。

由于分析的所有个体均为来自同一饲养场，相同饲养环境和管理条件的雌性羊只，因此数据建模时不包括场效应和性别效应。

具体模型为：Y＝Xβ+e；

其中，Y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状、体重性状表型值向量；

β：表型均值、SNP等固定效应向量；

e：残差效应向量；

X为β的关联矩阵。

当Y为湖羊肉用新类群核心群初生重表型值向量时，按照模型Y＝Xβ+Sα+e分析。

其中Y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状表型值向量；

α：同胞数的固定效应向量；

β：SNP效应向量；

e：残差效应向量；

X、S分别为β、α的关联矩阵。

3.试验结果

3.1湖羊ARHGAP24基因SNPs检测PCR扩增结果

各引物PCR产物亮度较高，条带单一，无非特异性扩增(图2)，实际PCR产物与预计PCR扩增产物大小一致，可进行后续PCR-产物直接测序试验。

3.2湖羊ARHGAP24基因扩增产物突变分析

湖羊ARHGAP24基因PCR扩增产物突变分析结果如表5所示，对ARHGAP24基因内含子1的部分区域进行扩增(扩增产物为476bp)在湖羊群体中共检测到15个突变，其中颠换3个，转换12个。

表5湖羊ARHGAP24基因的SNPs位点及突变类型、方式

表6湖羊ARHGAP24基因SNPs位点的遗传参数

表7湖羊SNPs位点群体遗传学分析

多态信息含量(PIC)是用来判定和分析一个遗传标识所表达的信息含量，PIC>0.5是高度多态位点，0.25<PIC<0.5是中度多态位点，PIC<0.25是低度多态位点。

PIC值越大说明有效等位基因数与杂合度越大，该群体在此SNP位点的变异性也越高。湖羊ARHGAP24基因的g.43642T＞C、g.43649A＞G、g.43654A＞T、g.43681G＞A、g.43699C＞G、g.43722C＞A＞T、g.43788G＞A、g.43815G>A、g.43914A＞G、g.43917A＞G、g.43934A＞G、g.43980G＞A为中度多态，g.43756G＞A、g.43851G＞A、g.43955C＞T为低度多态。

湖羊ARHGAP24基因多态性与体重、体尺性状的关联分析：

利用“关联分析”中的GLM模型分别进行ARHGAP24基因的15个SNPs与湖羊的体尺性状、体重性状的关联分析(表8)。

分析结果显示，g.43756G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。

g.43815G＞A与湖羊提高显著相关，AA型个体的体高显著高于GG型个体(P＜0.05)，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。

g.43851G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。

g.43917A＞G与湖羊体长和日增重显著相关，AA与GG型个体的体长显著高于AG型个体(P＜0.05)，AA与GG相比差异不显著(P＞0.05)，GG型个体的断奶到六月龄日增重显著高于AA型个体，AG型个体与AA，GG相比差异不显著。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> SNPs分子标记g.43815 G＞A及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 476

<212> DNA

<213> 湖羊(Ovine)

<400> 1

cagggtagac aagtgaacaa aacaaagctt tgcattctac tagattgaaa ctgacaatat 60

ataaatacat aatattccag acagagttaa acgttttggt gaaaacttga actagcaacg 120

ggagaggaaa agctggaggg tcaggtggga aatgattgtt gttttataag gaatcgccaa 180

agaaagacag ataaggcgtt atttgaaaat atcttaaaga atatgagaga tactgataac 240

aaatgcttta cttccttcag tgggctgtta gacctatgca agcaggcttt gcagtgtaga 300

aggatatctt caatatcatg cagctagagt tctatgaagt ccttttgtaa gagagggcat 360

gagttcactc catccacttc agggcattct ccctttggag ctggaataga tcatataaat 420

aaatggaatg agaaaaatag aatctctctc agggccagaa ttgtcagatg atttcc 476

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagggtagac aagtgaacaa aaca 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaaatcatc tgacaattct ggc 23

Claims

1.SNP分子标记在筛选湖羊体高性状育种中的应用，其特征在于，所述SNP 分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，且其中第235 位的碱基为A 或G；其中AA 型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。

2.一种用于检测SNP分子标记的引物对在筛选湖羊体高性状育种中的应用，其特征在于，所述SNP 分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，且其中第235 位的碱基为A 或G；其中AA 型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

4.试剂盒在筛选湖羊体高性状育种中的应用，其特征在于，试剂盒包括用于检测SNP分子标记的引物对，所述SNP 分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，且其中第235 位的碱基为A 或G；其中AA 型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。

5.一种筛选湖羊体高性状的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：提取湖羊外周血基因组DNA，采用引物对进行PCR扩增，对扩增产物中SNP分子标记进行检测，从而筛选出湖羊的湖羊体高性状；其中AA 型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著；

所述引物对用于检测SNP分子标记，所述SNP 分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，且其中第235 位的碱基为A 或G。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：94 ℃ 预变性，2min；98℃ 变性，10 sec，53℃ 退火，30 sec，68℃ 延伸，30 sec，35个循环；4 ℃保存，∞；所述PCR扩增体系如下：

试剂体积 2x PCR buffer for KOD FX 12.5 µL 2mM dNTPs 5 µL F 0.2 µL R 0.2 µL KOD FX 0.5µL DNA模板 1µL 总体系 25 µL

。

8.权利要求5或6或7所述方法在筛选湖羊体高性状和湖羊分子标记辅助育种中的应用；其中AA 型个体的体高显著高于GG型个体，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著。