CN110592238B - 与乌鸡生长性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与乌鸡生长性状相关的SNP标记及其应用。本发明首先提供了检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定鸡体重中的应用，所述SNP标记rs317682933为位于galGal6版鸡基因组的第4号染色体的第73209189位核苷酸，其等位基因为C和T。本发明进一步提供了一种鉴定或辅助鉴定鸡体重的方法。本发明发现鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型为CC时体重比基因型为CT时大，且该标记与体重的关联性随鸡日龄的增加而逐渐增强。因此，将SNP标记rs317682933用于略阳乌鸡生长性能选育能提高选择的准确性，增大选择反应，缩短育种进程。

Description

与乌鸡生长性状相关的SNP标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种领域，具体涉及与乌鸡生长性状相关的SNP标记及其应用。
背景技术
略阳乌鸡是陕西省特有的家禽品种，也是中国现有乌鸡品种中体型较大的一种乌鸡。该品种肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富兼具食疗保健功能。禽肉产品深受消费者喜爱，发展乌鸡产业具有良好的市场前景。但是，由于略阳乌鸡未受系统选育，该品种也存在生长速度缓慢，料肉比高，均匀度差的不足。略阳乌鸡在12周龄时公鸡的平均体重为1.38±0.19公斤，母鸡平均体重为1.04±0.13公斤；公鸡在12周龄时的料肉比为7.06±2.57，母鸡料肉比为7.05±2.11；公鸡达到2kg上市体重至少需要120天，母鸡需要180天。其生产性能远远低于当前选育程度较高的商业肉鸡品种。略阳乌鸡在生长性能上的不足增大了乌鸡养殖的成本，使禽肉产品难以以更低廉的价格走向市场，对乌鸡资源的开发利用产生了极为不利的影响。
从育种角度对略阳乌鸡生长性能进行选育是解决上述问题的途径之一。鸡的生长性状属多基因调控且受环境影响的数量性状。传统表型选择由于受环境因素干扰存在选择不准确的问题。而且，传统选育方法均需要测定个体的表型值，育种进程较长，育种成本较高。
因此，需要开发出一种与略阳乌鸡生长性能相关的分子标记，据此对略阳乌鸡生长速度选育，可以在乌鸡出壳时即根据基因型对后期生长速度做出判断，以缩短育种进程，降低育种成本。
发明内容
本发明的目的为筛选与略阳乌鸡生长显著关联的分子标记，建立标记基因型检测方法，将其应用于略阳乌鸡生长性状选育，在乌鸡出壳时即可根据基因型对后期生长速度做出判断，以缩短育种进程，降低育种成本。
为达到上述目的，本发明提供了检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定鸡体重中的应用；
所述SNP标记rs317682933为位于galGal6版鸡基因组的第4号染色体的第73209189位核苷酸，其等位基因为C和T，在NCBI dbSNP数据库中的登录号为rs317682933(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？do_not_redirect&rs＝rs317682933)。
上述检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质在鸡育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述应用中，所述鸡育种为培育体重大的鸡品种。
上述应用中，所述SNP标记rs317682933对应序列表中序列1的第51位核苷酸。
上述应用中，所述检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型具体可为检测鸡基因组中SNP标记rs317682933的核苷酸种类。所述SNP标记rs317682933的基因型是CC(简称为CC基因型)、TT(简称为TT基因型)或CT(简称为CT基因型)。其中，所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型，TT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为T的纯合型，CT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C和T的杂合型。
上述应用中，所述检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质如下A1)或A2)或A3)：
A1)用于扩增含有SNP标记rs317682933的DNA片段的成套引物；
A2)含有A1)的PCR试剂；
A3)含有A1)或A2)的试剂盒。
上述应用中，所述成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明还提供了一种产品。
上述产品为上述检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质；
其具有如下1)或2)或3)至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定鸡未来的体重；
2)体重大的鸡的育种；
3)选育体重大的鸡。
本发明还进一步提供了一种鉴定或辅助鉴定鸡体重的方法。
本发明鉴定或辅助鉴定鸡体重的方法包括：检测待测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型，根据基因型确定所述待测鸡的体重；
SNP标记rs317682933的基因型为CC的待测鸡的体重大于SNP标记rs317682933的基因型为CT的待测鸡；
其中，所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型，CT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C和T的杂合型。
本发明还进一步提供了一种鸡的育种方法。
本发明鸡的育种方法包括：检测待测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型，选择待测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型为CC的鸡进行育种。
上述方法中，检测待测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型为CC还是CT的方法为如下A)或B)：
A)通过SNP芯片检测鸡SNP标记rs317682933的基因型；
B)用上述检测SNP标记rs317682933的基因型的物质对所述待测鸡基因组DNA进行PCR获得产物，对产物进行基因分型。
本发明中，所述鸡为乌鸡，具体的为略阳乌鸡。
本发明对胆囊收缩素受体(CCKAR)基因序列变异与略阳乌鸡体重的关联性研究中发现：CCKAR内存在一个与略阳乌鸡体重显著关联的SNP标记rs317682933，与基因型CT个体相比，基因型CC的采食量更多，体重更大，且SNP标记rs317682933与体重的关联性随鸡日龄的增加而逐渐增强。将SNP标记rs317682933用于略阳乌鸡生长性能选育能提高选择的准确性，增大选择反应，缩短育种进程。
附图说明
图1为部分乌鸡SNP标记rs317682933酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；图中左侧箭头标出了酶切产物条带的位置，右侧箭头标出DM2000 DNA marker各条带的位置。
图2为Sanger测序验证结果，方框标出了突变碱基所在的位置。
图3为不同基因型群体间体重的比较。
图4为不同基因型群体间采食量比较。
图5为不同基因型群体间料肉比的比较。
其中，图3、4、5的柱线上的数字标出了基因型CC和基因型CT群体平均数差异显著检验的P值。
图6为传统表型选择法与标记辅助选择的选育效果比较，其中，*P＜0.05。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
发明人从略阳乌鸡中发现了与略阳乌鸡体重和采食量相关的SNP标记rs317682933，SNP标记rs317682933是鸡基因组的一个SNP位点，SNP标记rs317682933位于galGal6版鸡基因组的第4号染色体的第73209189位核苷酸，其等位基因为C和T，对应于序列表中序列1的第51位核苷酸，即Y为C或T。
所述SNP标记rs317682933的基因型是CC(简称为CC基因型)、TT(简称为TT基因型)或CT(简称为CT基因型)。其中，所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型，TT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为T的纯合型，CT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C和T的杂合型。SNP标记rs317682933的基因型为CC的鸡的体重和采食量高于SNP标记rs317682933的基因型为CT的鸡。
实施例1、验证SNP标记rs317682933与略阳乌鸡体重和采食量的关联性
一、试验动物
略阳乌鸡是从略阳龙佳农业科技发展有限公司养殖的略阳乌鸡蛋用系育种核心群三世代中随机选取，所有略阳乌鸡均为同一批次孵化，在同一栋鸡舍饲养。40只/m2笼养育雏；第一周育雏温度为33-35℃，之后每周降低2-3℃，第四周脱温；第一周光照时间为22h，之后每周减少1-1.5h，采用华秦911A蛋小鸡配合饲料饲喂。在60天转入产蛋鸡舍，采用个体单笼饲养。
二、体重和耗料量测定
在6、10、12、13、14、15、16周周一测定乌鸡个体体重，记为始重，周日测定体重记为末重，用末重减去始重求得本周内净增重。6周龄和10周龄体重测定的样本量为60只鸡(21只公鸡和39只母鸡)，12-16周龄个体体重和个体耗料量测定样本量扩大至129只(公鸡62只和母鸡67只)。
采用回重法测定个体在12-16周的耗料量，在每周周一测定饲料重量记为初始料重，在周日测定剩余饲料重量记为剩余料重，根据初始料重和剩余料重的差值求得每只鸡在本周内的耗料量，并根据下述公式计算料肉比：
Figure BDA0002235694370000041
测得的每个乌鸡的性别、体重、耗料量和料肉比的结果如表1所示。
表1每个乌鸡的性别、体重、料肉比和基因型情况
Figure BDA0002235694370000042
Figure BDA0002235694370000051
Figure BDA0002235694370000061
Figure BDA0002235694370000071
注：“-”表示未测量
三、DNA的提取
翅下静脉采血，ACD(1∶4)抗凝，用血液基因组非柱式提取试剂盒(康为世纪，货号：CW0544M)按试剂盒说明提取基因组DNA。所得DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，用NanoDrop 2000(Thermo)分光光度计测定DNA的浓度，并将DNA的浓度调整至50ng/μL备用。
四、基因型检测方法
按照PCR-RFLP法检测所有乌鸡的SNP标记rs317682933的基因型，具体方法如下：
1、以乌鸡的基因组DNA为模板，利用正链引物(5’-ATGCTGATGGTGATAGTGGT-3’，序列2)和反链引物(5’-GGTGAAAGTGGCTAGAAAAC-3’，序列3)进行PCR扩增，获得包含SNP标记rs317682933的DNA片段；
其中，PCR扩增体系为20μL，由10μL 2×Taq Plus MasterMix(Dye)(购自康为世纪，货号为：CW2849L)，0.5μL 10μM的正链引物，0.5μL 10μM的反链引物，1μL模板DNA(50ng)和8μL ddH2O组成。
PCR扩增条件为95℃变性3min，(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸20sec)×33循环，72℃延伸5min。
2、SNP标记rs317682933的基因型用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)法进行检测：
将酶切体系混匀后置37℃培养箱消化2h，得到的酶切产物用3％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为100v电泳35min，EB染色，凝胶成像系统拍照记录结果。
其中，所用内切酶为Mbo II(购自NEB公司，货号：#R0148V)，酶切体系为10μL，由1μL CutSmart Buffer，0.6μL Mbo II(3U)，1.5μL PCR产物和6.9μL ddH2O组成。
部分乌鸡的检测结果如图1所示，SNP标记rs317682933的基因型为CC时，经Mbo II酶切产生180bp和39bp两个条带，CT型产生219bp、180bp和39bp三个条带。部分基因型检测结果用Sanger测序法加以验证，结果如图2所示。所有乌鸡的基因型如表1所示。
五、数据统计分析
用双因素方差分析检验SNP标记rs317682933基因型与体重、采食量和料肉比的关联型。主效应为基因型、性别及基因型与性别的互作，显著水平为0.05。各组结果表示为平均数±标准差。
通过分析基因型、性别及基因型与性别的互作效应对略阳乌鸡6-16周龄体重的影响。在性别效应方面，性别效应对各周龄体重均有极显著影响(表2)。在基因型效应方面，CC基因型的乌鸡在各时间点的体重均大于CT基因型，而且CC基因型在略阳乌鸡生长方面的优势效应随鸡年龄的增长逐渐增大(图3)。性别与基因型互作效应对略阳乌鸡各时间点的体重影响均不显著(表2)，这表明CC基因型在略阳乌鸡公鸡和母鸡中均发挥了有利于生长的优势基因效应。
表2性别和基因型对略有乌鸡体重调控效应显著性检验结果
Figure BDA0002235694370000081
Figure BDA0002235694370000091
通过分析基因型与性别对略阳乌鸡12-15周龄采食量的影响，CC基因型在12-14周的采食量均显著高于CT基因型，在15周这种采食量上的差异依然存在，但未达到统计上的显著水平(图4)。性别效应对各周采食量均有极显著影响(表3)，但性别与基因型的互作效应对采食量的影响不显著(表3)。
表3性别和基因型对略有乌鸡采食量影响的显著性检验结果
Figure BDA0002235694370000092
通过分析基因型、性别及二者互作效应对略阳乌鸡12-15周龄料肉比的影响，发现CC与CT基因型乌鸡料肉比无显著差异(图5)。性别效应对13-15周料肉比有显著影响(表4)，公鸡的料肉比均显著低于母鸡，但在12周二者差异不显著(表4)。性别与基因型的互作效应对各周料肉比均无显著影响(表4)。
表4性别和基因型对略有乌鸡料肉比影响的显著性检验结果
Figure BDA0002235694370000093
实施例2、传统表型选择和标记辅助选择的选育效果的比较
一、试验动物
在略阳龙佳农业科技发展有限公司饲养的蛋用系育种核心群二世代中随选取500只母鸡和200只公鸡组成传统表型选择育种群，另选取500只母鸡和200只公鸡组成SNP标记辅助选择育种群。
二、试验方案
传统表型选择以12周龄体重为选择依据，采用个体表型选择，公鸡按12周龄体重排序前5％留种，母鸡按25％留种。标记辅助选育法除了考虑12周龄体重外，也考虑rs317682933位点的基因型，留种比例与传统选育方案相同。以公鸡为例，如果个体体重排序在前5％，同时SNP标记rs317682933的基因型为CC，则个体入选；如果个体体重在5％，但基因型为CT或TT，则淘汰个体，从SNP标记rs317682933的基因型为CC的体重较大的个体中寻找替补。
三、选育效果比较
传统表型选择和标记辅助选择的选育效果根据三世代12周龄体重进行评价。标记辅助选择法留种个体繁育得到的三世代公鸡平均体重为1.450±0.193kg，母鸡平均体重为1.185±0.129kg，均显著高于传统表型选择繁育得到的三世代公鸡(1.278±0.188kg)和母鸡(1.048±0.093kg)(图6)。结果表明相比较于传统表型选择，标记辅助选择能够取得更大的选育效果，将SNP标记rs317682933的优势基因型CC用于略阳乌鸡生长性状标记辅助选择具有可行性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 西北农林科技大学
<120> 与乌鸡生长性状相关的SNP标记及其应用
<130> GNCFY192098
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> 鸡（Gallus gallus）
<400> 1
atgctgatgg tgatagtggt tttgtttttc atttgctgga ctcccatctt yagcgtgaac 60
gcctggcgcg catttgacac cgcctccgca gacctgcatc tctcgggagc tcccatctcc 120
tttatccacc tgctgtccta cacttctgcc tgcgtgaacc ctatcatata ctgcttcatg 180
aacaagcgtt tccgcatggg ttttctagcc actttcacc 219
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctgatgg tgatagtggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgaaagtg gctagaaaac 20

Claims (7)

1.检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定鸡体重中的应用；
所述SNP标记rs317682933为位于galGal6版鸡基因组的第4号染色体的第73209189位核苷酸，其等位基因为C和T；
所述SNP标记rs317682933的基因型是CC基因型、TT基因型或CT基因型；其中，所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型，所述TT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为T的纯合型，所述CT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C和T的杂合型；所述CC基因型的鸡的体重大于所述TT基因型和所述CT基因型的鸡；
所述鸡为略阳乌鸡。
2.检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质在鸡育种中的应用；
所述SNP标记rs317682933为位于galGal6版鸡基因组的第4号染色体的第73209189位核苷酸，其等位基因为C和T；
所述SNP标记rs317682933的基因型是CC基因型、TT基因型或CT基因型；其中，所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型，所述TT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为T的纯合型，所述CT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C和T的杂合型；所述CC基因型的鸡的体重大于所述TT基因型和所述CT基因型的鸡；
所述鸡育种为培育体重大的鸡品种；
所述鸡为略阳乌鸡。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述检测SNP标记rs317682933的多态性或基因型的物质如下A1)或A2)或A3)：
A1)用于扩增含有SNP标记rs317682933的DNA片段的成套引物；
A2)含有A1)的PCR试剂；
A3)含有A1)或A2)的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
5.一种鉴定或辅助鉴定鸡体重的方法，其特征在于，
所述方法包括：检测待测鸡基因组中权利要求1-4中任一所述SNP标记rs317682933的基因型，根据基因型确定所述待测鸡的体重；
所述SNP标记rs317682933的基因型是CC基因型、TT基因型或CT基因型；其中，所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型，所述TT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为T的纯合型，所述CT基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C和T的杂合型；所述CC基因型的鸡的体重大于所述TT基因型和所述CT基因型的鸡；
所述鸡为略阳乌鸡。
6.一种鸡的育种方法，其特征在于，
所述方法包括：检测待测鸡基因组中权利要求1-4中任一所述SNP标记rs317682933的基因型，选择待测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型为CC基因型的鸡进行育种；所述CC基因型是鸡基因组中所述SNP标记rs317682933为C的纯合型；
所述育种为培育体重大的鸡品种；
所述鸡为略阳乌鸡。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述检测待测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型的方法为如下A)或B)：
A)通过SNP芯片检测鸡基因组中SNP标记rs317682933的基因型；
B)用权利要求3或4中所述检测SNP标记rs317682933的基因型的物质对所述待测鸡基因组DNA进行PCR获得产物，对产物进行基因分型。
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