CN110578005B - 一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物及试剂盒、鉴定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物及试剂盒、鉴定方法及应用，属于动物遗传育种技术领域。本发明中鸡伴性浅芦花羽的分子标记为CDKN2A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第27bp处发生C到T的突变。依据该分子标记设计引物、试剂盒及检测方法，利用本发明提供的检测方法或试剂盒能够检测待测鸡是否携带浅芦花羽性状突变等位基因，从而确定待测鸡是否为浅芦花羽鸡。本发明通过改变引物3’端的碱基来引入限制性内切酶Asu I识别位点，降低了检测成本，提高了检测效率。在实际生产和育种中，可以利用该方法准确剔除或纯合浅芦花羽性状。

Description

一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物及试剂盒、鉴定方法及 应用

技术领域

本发明涉及一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物及试剂盒、鉴定方法及应用，属于动物遗传育种技术领域。

背景技术

鸡的羽色十分丰富，羽色是鸡的重要品种特征之一。羽色能直接反映鸡的生长和健康状态，其发育状态是决定优质肉鸡经济价值的重要因素。在优质鸡市场上，鸡只的羽毛颜色、色泽、形态等外观性状是影响优质鸡价格的重要因素，因此，羽色是优质鸡育种工作中一项重要选择指标。在畜牧生产上，性别与畜禽的生产性能相关性很大。在奶牛场，出生下来的公牛犊绝大多数直接被淘汰，母牛犊被留下来用于牛奶生产；在蛋鸡场，母雏鸡比公雏鸡的经济价值大的多；在肉鸡场，公鸡的生长速度比母鸡的要好，因此畜禽的性别鉴定对于畜牧生产具有非常重要的意义。但家禽的生殖器官多位于体内，出壳时多数通过翻肛鉴别公母，这种方法技术要求高，费时费工且还对雏鸡造成大的应激。所以蛋鸡、肉鸡生产中，多数采用羽色，羽速的伴性遗传来鉴别公母。

鸡的浅芦花羽也叫哥伦比亚羽，是一种颈部和尾部的羽毛末端为黑色，其余全为白羽的羽色，其为性连锁浅芦花羽，其外观相对好看，易受消费青睐，浅芦花羽市场占有率高。浅芦花羽为一种羽色性状，伴性浅芦花羽是伴性遗传的羽色性状。豫粉1号H系具有典型的浅芦花羽特征，该性状是位于Z染色体上且伴性遗传。因此，在国审新品种豫粉1号蛋鸡配套系商品代鸡生产过程中，利用H系浅芦花羽性状实现商品代雏鸡可根据羽毛颜色进行鉴别雌雄。这种鉴别方式快捷，省时省工，准确率也高。

细胞周期依赖性激酶抑制基因(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKN2A)是一种重要的抑癌基因，属于细胞周期依赖性激酶抑制因子基因家族。Doreen等(2017)研究发现CDKN2A基因调控区和编码区的碱基突变导致了鸡横斑芦花不同表型形成。横斑芦花羽的表型是由B1等位基因控制，中国农业大学邓雪梅教授已根据B1等位基因开发出与横斑芦花羽相关的分子标记，申请了发明专利《一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法》并获得授权。但是，目前还没有较为方便的、价格便宜的浅芦花羽基因的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物，上游引物第23位的模板序列C改变为G，形成限制性内切酶的识别序列GGTCC，成为人工酶切位点，以方便鸡伴性浅芦花羽基因的检测。

本发明还提供了包含上述引物的试剂盒。

本发明还提供了使用上述引物或试剂盒鉴定鸡伴性浅芦花羽基因的方法。

本发明还提供了上述引物、试剂盒或鉴定方法在鸡浅芦花羽性状育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物，其核苷酸序列如下所示：

上游引物5‘-TGACCTCTCGGATAAGGTGCAC

GTC-3’；

下游引物5‘-CTCCTTCTCAGAACCCGGC-3’。

如SEQ ID NO.1所示序列的为CDKN2A/B基因序列的编码区的一部分，浅芦花羽性状鸡中如SEQ ID NO.1所示序列的第27位由发生单碱基突变(C→T)导致氨基酸(R)从精氨酸到半胱氨酸(C)的错义突变，该突变与鸡浅芦花羽性状连锁。未发生突变时碱基为C时，鸡的羽色表现为非浅芦花羽，突变为T时，鸡的羽色表现为浅芦花羽，并且这个基因位于Z染色体上，呈现为伴性遗传。当浅芦花羽公鸡与黄麻羽母鸡杂交时，后代母鸡为浅芦花羽，后代公鸡为黄麻羽。雏鸡出壳时可以通过羽毛颜色来鉴别雌雄，这比生产上利用翻肛鉴定雌雄要省时省工的多。因此浅芦花羽性状可以用到家禽生产中，以提高雌雄鉴别的效率，降低人力物力成本。

上述引物即是依据如SEQ ID NO.1所示序列所设计，该对引物扩增序列覆盖突变位点(即SEQ ID NO.1的第27位)，将所述上游引物第23位的模板序列C改变为G，形成限制性内切酶的识别序列GGTCC。上述引物的PCR产物为154bp，如果SEQ ID NO.1所示序列的第27位未发生突变(碱基为C)，则PCR产物能够被Asu I酶切开，其中Asu I识别位点为GGNCC，PCR产物能够被切割成23bp和131bp的片段。如果SEQ ID NO.1所示序列的第27位发生了突变(碱基为T)，则PCR产物不能够被Asu I酶切开，产物大小为154bp。

对于单个碱基突变的检测一般利用单链构象多态性(SSCP)技术或直接测序技术，其中SSCP技术不稳定，重复性差，实验要求高，实验成本高。直接测序要求特定的仪器，成本比SSCP还高，绝大多数实验室不具备测序条件。本发明设计了上述引物，上游引物第23位的模板序列C改变为G，与未发生突变的序列形成限制性内切酶的识别序列GGTCC。如果待测模板发生了突变则原来的识别序列就变成GGTCT，从而不能被限制性内切酶Asu I酶切开。这样在PCR扩增产物中引物了酶切位点，酶切后不同基因型的扩增产物表现出不同大小的片段，通过片段的大小可以直观的判断出检测样本的基因型，从而方便、快速的对鸡的浅芦花羽基因型进行判定。本发明的引物虽然引入了人为突变，但该突变位点在上游引物的倒数第4位，经实验验证该人为突变对PCR的扩增效率没有影响，能够较好的扩增出产物。

鸡伴性浅芦花羽基因鉴定试剂盒，包含上述的鉴定引物。具体的，试剂盒还包括Asu I酶。限制性内切酶Asu I的价格仅为0.16元/U，在用于鉴定鸡伴性浅芦花羽基因型时成本较低。

上述的引物和试剂盒可以用于鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定，也可以用于鸡伴性浅芦花羽性状的育种。

一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定方法，以待测鸡基因组DNA为模板，使用上述的鉴定引物进行PCR扩增，使用DNA内切酶酶切PCR扩增产物以检测如SEQ ID NO.1所示序列的第27位是否由C突变为T，根据酶切结果判断待测鸡的浅芦花羽基因型；

所述鉴定引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物5‘-TGACCTCTCGGATAAGGTGCAC

GTC-3’；

下游引物5‘-CTCCTTCTCAGAACCCGGC-3’。

所述的鸡基因组DNA可来源于离体的鸡组织器官或血液。

待检测的鸡为任意鸡，如豫粉1号H系、固始鸡、隐性白鸡、显性白鸡、贵妃鸡、淅川鸡、卢氏鸡等。

所述DNA内切酶为Asu I酶。所述DNA内切酶的酶切温度为37℃，酶切时间为8-12h。

所述PCR扩增的退火条件为60℃，30s。

如果待测鸡的基因组DNA的SEQ ID NO.1所示序列的第27位未发生突变，碱基为C，则与上游引物末端形成Asu I酶的识别序列GGTCC，所得的PCR扩增产物能被Asu I酶切开，形成131bp和23bp两条片段；如果SEQ ID NO.1所示序列的第27位发生突变，碱基为T，则所得PCR扩增产物不能被Asu I酶切开。

如所述酶切产物仅为大小为154bp的片段，则待测鸡为HH基因型；如所述酶切产物为大小为154bp、131bp和23bp的三条片段，则待测鸡为Hh基因型；如所述酶切产物为大小为131bp和23bp的两条片段，则待测鸡为hh基因型。

而在实际的检测时，23bp的条带难以分辨，因此如所述若电泳显示为两条带，则待测鸡的基因型为Hh杂合型；若电泳显示为一条带且大小与两条带中上一条接近(约为154bp)，则待测鸡的基因型为HH纯合型；若电泳显示为一条带且大小与两条带中下一条接近(约为131bp)，则待测鸡的基因型为hh纯合型。

由于CDKN2A/B基因位于鸡的性染色体(Z染色体)上，而母鸡仅有一条Z染色体，因此母鸡的表型仅有HH基因型和hh基因型，不存在杂合的现象。所述HH基因型为Z^HZ^H基因型或Z^HW基因型(表型浅芦花羽)；所述Hh基因型为Z^HZ^h基因型(表型浅芦花羽)；所述hh基因型为Z^hZ^h基因型或Z^hW基因型(表型非浅芦花羽)。

上述的鉴定方法在鸡浅芦花羽性状育种中的应用，具体的选择HH基因型的鸡只，弃去Hh基因型和hh基因型的鸡只，以快速的培育出遗传性状稳定的浅芦花羽鸡群体。

本发明针对CDKN2A基因序列上筛选到的浅芦花鸡特有的SNP突变位点，建立了检测该突变的基因分型方法，可对浅芦花鸡伴性羽基因进行分型，该种鉴定方法中，所要检测的CDKN2A基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第27bp处的C到T的突变。利用本发明提供的检测方法或试剂盒，检测待测鸡是否携带浅芦花羽性状突变等位基因，从而确定待测鸡是否为浅芦花羽鸡。本发明通过改变引物3’端的碱基来引入限制性内切酶Asu I识别位点，降低了检测成本，提高了检测效率。在实际生产和育种中，可以利用本发明的方法准确剔除或纯合浅芦花羽性状。

附图说明

图1为实施例3到5中伴性浅芦花羽和黄麻羽鸡PCR-RFLP分型的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例3到5中构建的遗传群体示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例中的鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物，依据如SEQ ID NO.1所示序列所设计，其核苷酸序列如下所示：

上游引物5‘-TGACCTCTCGGATAAGGTGCAC

GTC-3’；

下游引物5‘-CTCCTTCTCAGAACCCGGC-3’。

其中上游引物原基因序列第23位碱基由C改变为G，与未发生突变形成限制性内切酶的识别序列GGTCC。上述引物的PCR产物为154bp。

本实施例中的试剂盒包含上述引物，还包括：

1)PCR扩增用试剂：2×Taq PCR masterMix(康维世纪生物科技有限公司，产品编号Lot 01036/30146)、ddH₂O、DNA聚合酶；

2)酶切所需试剂：Asu I(TaKaRa公司产品，产品编号Lot#AH20225A)；10×HBuffer(与所述限制性内切酶配套使用的缓冲液，TaKaRa公司，产品编号Lot#AG80009A)。

实施例2

本实施例中鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定方法，包括如下步骤：

1、PCR扩增突变位点所在片段

反应体系准备：在反应管中加入2×Taq PCR masterMix 5μL，上下游引物各0.5μL(终浓度为0.25μM)和40～50/μL DNA模板1.0μL，加超纯水至10μL，充分混匀后短暂离心。其中，DNA模板为待测鸡的基因组DNA(可来源于离体的鸡组织器官或血液)。

将PCR反应管放入PCR仪进行扩增反应：95℃变性5min；再经过个30个循环，每个循环包括95℃30s、60℃30s、72℃30s；然后72℃延伸7min，最终反应产物放于4℃保存。

扩增片段的判定：取3μL反应产物在1.5％琼脂糖凝胶，1×TBE中电泳，检测扩增片段大小，以扩增产物片段是否约为154bp(具体为154bp)，初步判定扩增片段是否正确，若约为154bp，则PCR扩增片段正确，反之，则不正确。

2、酶切

取10μL步骤1所得产物，加入1.5μL 10×H Buffer(与内切酶配套)、0.2ul内切酶(BmgT120 I/Cfr13 I/Asu I)(在反应体系中的浓度为0.12U/uL)、然后加超纯水至15μL，充分混匀后短暂离心，放于37℃恒温培养箱8-12h。将酶切产物在2.5％琼脂糖凝胶，1×TBE，120V电泳50min，用凝胶电泳成像系统显像。然后根据电泳图谱，鉴定基因型。

3、鉴定依据

(1)HH基因型(包括Z^HZ^H基因型或Z^HW基因型，伴性浅芦花羽纯合，表型为浅芦花羽)：待测鸡只基因组DNA上SEQ ID NO.1序列第27位为T，且为纯合的个体，分型结果为一条带(上条带)。

(2)Hh基因型(Z^HZ^h基因型，显性浅芦花羽杂合，表型为浅芦花羽)：待测鸡只基因组DNA上SEQ ID NO.1序列第27位为T或C，电泳分型结果为两条带(上和下两条带)。

(3)hh基因型(包括Z^hZ^h基因型或Z^hW基因型，表型为黄麻羽)：待测鸡只基因组DNA上SEQ ID NO.1序列第27位为C，且为纯合的个体，电泳分型结果为一条带(下条带)。

4、序列测定

根据步骤3的鉴定结果，还可进一步对步骤1所得产物进行序列测定，验证结果的准确性。当待测鸡的基因组DNA的SEQ ID NO.1序列第27位为T时，扩增目的片段为序列表中SEQ ID NO.1所示的154bp DNA片段，对应等位基因H(Z^H)；当待测鸡的基因组DNA的SEQ IDNO.1序列第27位为C时，扩增目的片段为序列表中SEQ ID NO.1所示的154bp DNA片段，对应等位基因H(Z^h)；当待测鸡的基因组DNA的SEQ ID NO.1序列第27位为C和T时，扩增目的片段为序列表中SEQ ID NO.1所示的154bp DNA片段，对应等位基因H(Z^H或Zh)。

实施例3

利用实施例1的试剂盒和实施例2中的鉴定方法鉴定鸡伴性浅芦花羽基因的基因型。

已知基因型的鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定，以F0代的如下鸡作为待测鸡(如图2所示)：

15只固始鸡公鸡(黄麻羽，hh基因型)，136只豫粉1号蛋鸡H系母鸡(伴性浅芦花羽纯合，HH基因型(Z^HW基因型)，表型为浅芦花羽)。

采用实施例1中的试剂盒，按照实施例2的方法对以上各待测鸡进行伴性浅芦花羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。

PCR扩增片段的电泳结果显示，各待测鸡在略大于150bp的位置均检测到目的条带，初步判定扩增正确。

进一步的酶切检测结果如图1所示。M表示DNA Maker，从图中可以看出，泳道1(hh泳道)为黄麻羽固始鸡公鸡酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为下条带，酶切产物序列长度经过测序为131bp(23bp的条带非常短，电泳图上看不到)，从而判定其基因型为Z^hZ^h型(黄麻羽纯合)；泳道2(HH泳道)为浅芦花羽H系母鸡酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为上条带，酶切产物序列长度经过测序为154bp，从而判定其基因型为Z^HW，为浅芦花羽纯合基因型。

实施例4

利用实施例1的试剂盒和实施例2中的鉴定方法鉴定F1代鸡的基因型。

F1代鸡为实施例3中黄麻羽固始鸡公鸡与浅芦花羽H系母鸡杂交，得到76只浅芦花羽公鸡，54只黄麻羽母鸡(如图2所示)。采集F1代鸡的血液，并提取DNA。

PCR扩增片段的电泳结果显示，各待测鸡在略大于150bp的位置均检测到目的条带，初步判定扩增正确。

进一步的酶切检测结果如图1所示。M表示DNA Maker，从图中可以看出，泳道3(Hh泳道)为F1代鸡中的浅芦花羽公鸡DNA的酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为上和下条带，酶切产物序列长度经过测序分别为154bp和131bp(23bp的条带非常短，电泳图上看不到)，从而判定其基因型为Z^HZ^h型(浅芦花羽杂合)；泳道1-9，1-10，2-10，2-11，3-9，3-10，4-10，4-11，5-9和5-10为F1代鸡中的黄麻羽母鸡DNA的酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为下条带，酶切产物序列长度经过测序为131bp，从而判定其基因型为Z^hW，为黄麻羽纯合基因型。F1代中的浅芦花羽公鸡与F1代中的黄麻羽母鸡的遗传规律符合孟德尔遗传规律。证明本方法准确可靠。

实施例5

利用实施例1的试剂盒和实施例2中的鉴定方法鉴定F2代鸡的基因型。

F2代鸡为实施例4中的2只F1代浅芦花羽公鸡与20只F1代黄麻羽母鸡进行杂交，得到49只浅芦花羽公鸡、45只浅芦花羽母鸡、48只黄麻羽公鸡和43只黄麻羽母鸡(如图2所示)。采集F2代鸡的血液，并提取DNA。

PCR扩增片段的电泳结果显示，各待测鸡在略大于150bp的位置均检测到目的条带，初步判定扩增正确。

进一步的酶切检测结果如图1所示。M表示DNA Maker，从图中可以看出，泳道6-11和6-12为F2代鸡中的浅芦花羽母鸡DNA的酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为上条带，酶切产物序列长度经过测序为154bp，从而判定其基因型为Z^HW型(浅芦花羽纯合)；泳道7-9为F2代鸡中的黄麻羽公鸡DNA的酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为下条带，酶切产物序列长度经过测序为131bp，从而判定其基因型为Z^hZ^h，为黄麻羽纯合基因型；泳道7-10为F2代鸡中的黄麻羽母鸡DNA的酶切检测的电泳图，从电泳图上可以看出电泳条带为下条带，酶切产物序列长度经过测序为131bp，从而判定其基因型为Z^hW，为黄麻羽纯合基因型。F2代中的浅芦花羽公、母鸡与F2代中的黄麻羽公、母鸡的遗传规律符合孟德尔遗传规律。再次证明了本方法的准确可靠。

<110> 河南农业大学

<120> 一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物及试剂盒、鉴定方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 154

<212> DNA

<213> 鸡

<221> CDKN2A/B基因序列的第1内含子片段

<400> 1

tgacctctcg gataaggtgc accgtccgcc ttcggcgcgc ccgcagccgg cctctgtcct 60

tctcgctgct ccggcgcatc ttgcgcgggg tggccgctgt cctgcggcgc tccgggacgc 120

ttcgccgcat tctgcgccgg gttctgagaa ggag 154

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 上游引物

<400> 2

tgacctctcg gataaggtgc acggtc 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 下游引物

<400> 3

ctccttctca gaacccggc 19

Claims (10)

1.一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定引物，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：

上游引物 5‘-TGACCTCTCGGATAAGGTGCACGGTC-3’；

下游引物 5‘-CTCCTTCTCAGAACCCGGC-3’；

将所述上游引物第23位的模板序列C改变为G，与未发生突变形成限制性内切酶Asu I的识别序列GGTCC；上述引物的PCR产物为154bp，如果SEQ ID NO.1所示序列的第27位未发生突变碱基为C，则PCR产物能够被Asu I酶切开，其中Asu I识别位点为GGNCC，PCR产物能够被切割成23bp和131bp的片段；如果SEQ ID NO.1所示序列的第27位发生了突变碱基为T，则PCR产物不能够被Asu I酶切开，产物大小为154bp；未发生突变时碱基为C时，鸡的羽色表现为非浅芦花羽，突变为T时，鸡的羽色表现为浅芦花羽，并且这个基因位于Z染色体上，呈现为伴性遗传。

2.一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的鉴定引物。

3.根据权利要求2所述的鉴定试剂盒，其特征在于：还包括DNA内切酶，所述DNA内切酶为Asu I酶。

4.一种鸡伴性浅芦花羽基因的鉴定方法，其特征在于：以待测鸡基因组DNA为模板，使用如权利要求1所述的鉴定引物进行PCR扩增，使用DNA内切酶酶切PCR扩增产物以检测如SEQ ID NO.1所示序列的第27位是否由C突变T，根据酶切结果判断待测鸡的浅芦花羽基因型。

5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述DNA内切酶为Asu I酶；如果待测鸡的基因组DNA的SEQ ID NO.1所示序列的第27位未发生突变，碱基为C，则与上游引物末端形成Asu I酶的识别序列GGTCC，所得的PCR扩增产物能被Asu I酶切开，形成131bp和23bp两条片段；如果SEQ ID NO.1所示序列的第27位发生突变，碱基为T，则所得PCR扩增产物不能被Asu I酶切开。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于：如酶切产物仅为大小为154bp的片段，则待测鸡为HH基因型；如酶切产物为大小为154bp、131bp和23bp的三条片段，则待测鸡为Hh基因型；如酶切产物为大小为131bp和23bp的两条片段，则待测鸡为hh基因型。

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于：所述HH基因型为Z^HZ^H基因型或Z^HW基因型；所述Hh基因型为Z^HZ^h基因型；所述hh基因型为Z^hZ^h基因型或Z^hW基因型。

8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：若待测鸡的基因型为HH纯合型或Hh杂合型任意一种，则所述待测鸡为浅芦花羽鸡；若待测鸡的基因型为hh纯合型，则所述待测鸡不是浅芦花羽鸡。

9.如权利要求1所述的鉴定引物、权利要求2-3任一项所述的鉴定试剂盒或权利要求4-8任一项所述的鉴定方法在鸡浅芦花羽性状育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：选择HH基因型的鸡只，弃去Hh基因型和hh基因型的鸡只，以快速的培育出遗传性状稳定的浅芦花羽鸡群体。

Images