CN111549143A - 与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记，其位于KRTAP2‑1基因上，具有A、B和C三个优势等位基因，所述等位基因A、B和C的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1‑SEQ ID No.3；含有等位基因C的个体，其羊绒纤维直径最小；缺失等位基因C的个体，其羊绒纤维直径最大。本发明公开的遗传标记能够用于鉴定陇东绒山羊羊绒纤维直径大小，能够用于选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的陇东绒山羊。

Description

与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其 应用。

背景技术

山羊绒纤维由次级毛囊产生，具有细而柔软、轻而保暖、绒面柔滑丰满、弹性和吸湿 性好、风格独特和穿着舒适等优点，其价格也远高于绵羊毛和马海毛，在业界被称为“软黄金”和“纤维钻石”。在羊绒的经济性状中，产绒量和平均纤维直径是最重要的两个性 状，直接决定了山羊绒的经济价值。

角蛋白(Keratins,Ks)和角蛋白关联蛋白(Keratin-associatedproteins,KAPs；其编码 基因标识为KRTAPs)是羊绒纤维的主要结构蛋白，约占其总重量的90％。前者形成角蛋 白中间丝(keratin intermediate filaments,KIFs)，后者交联形成KIFs的基质。Ks和KAPs 直接决定了羊绒纤维的理化特性。

KAPs是一类复杂的蛋白质，最明显的特点是含有大量的半胱氨酸(Cysteine,Cys)或甘氨酸(Glycine,Gly)和酪氨酸(Tyrosine,Tyr)。根据氨基酸成分和含量，KAPs可以 分为3类：高甘氨酸/酪氨酸KAPs(HGT-KAPs，含有35～60mol％的Gly和Tyr)、高硫 KAPs(HS-KAPs，含有≤30mol％的Cys)和超高KAPs(UHS-KAPs，含有>30mol％的 Cys)。根据序列相似性，可将KAPs进一步分为不同的家族。到目前为止，已经在哺乳动 物中发现了来自27个基因家族的100多个KRTAPs基因。然而，在山羊中只发现了来自 11个家族的14个KRTAPs基因。这表明，在山羊基因组中还有大量的KRTAPs基因有待 进一步鉴定。

已有研究表明，KRTAPs基因的核苷酸序列变异与山羊的产绒性状有很强的相关性。 王杰等在高原型藏山羊上发现了3个基因型，其中BB基因型个体的羊绒纤维直径比AB基因型个体小0.9μm，比AA基因型个体小0.37μm(P<0.05)。Wang等发现KRTAP20-2 等位基因A的存在与陇东绒山羊较大的产绒量相关(P<0.001)，等位基因B的存在与较 小的产绒量和纤维自然长度相关(P<0.05)，推测KRTAP20-2基因可以作为陇东绒山羊产 绒量和纤维长度的有效分子标记。Fang等研究表明，新疆绒山羊KRTAP13-1中GT基因 型个体的绒层厚度比GG基因型个体高0.393cm(P<0.05)。上述结果表明，研究山羊 KRTAPs基因的核苷酸序列变异及其与产绒性状的相关性对绒山羊生产实践有重要意义。

KRTAPs基因一般只有1个不到1000bp的外显子，没有内含子。人类基因组中已鉴定出KRTAP2基因家族，它属于HS-KAPs，由KRTAP2-1、KRTAP2-2、KRTAP2-3、KRTAP2-4 和KRTAP2-5P(假基因)5个成员组成，而目前尚未鉴定和研究山羊KRTAP2基因家族。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记 及其应用。本发明以陇东绒山羊为研究对象，利用比较基因组、生物信息学、聚合酶链反 应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single stranded conformationpolymorphism,PCR-SSCP)和测序等方法，在山羊基因组中鉴定了KRTAP2-1基因，研究 了该基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和氨基酸序列特征，最后分析了KRTAP2-1基因的核苷酸序列变异对陇东绒山羊羊绒性状的影响。

本发明提供与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记，其位于KRTAP2-1基因上，具有A、 B和C三个优势等位基因，所述等位基因A、B和C的核苷酸序列分别为序列表中SEQ IDNo.1-SEQ ID No.3；含有等位基因C的个体，其羊绒纤维直径最小；缺失等位基因C的个 体，其羊绒纤维直径最大；

作为优选，所述山羊为绒山羊；

所述等位基因A为：在KRTAP2-1基因c.-80处为A，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为C，c.71处为A，c.99处为A，c.117处为C；

所述等位基因B为：在KRTAP2-1基因c.-80处为A，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为C，c.71处为G，c.99处为C，c.117处为C，c.93处缺失 了C，c.94处缺失了C，c.95处缺失了G；

所述等位基因C为：在KRTAP2-1基因c.-80处为C，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为G，c.71处为A，c.99处为C，c.117处为C。

本发明提供用于检测上述的与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记的引物对，所述引物 对为：

上游引物：5′-TCTGGGGATCATCATCTCCT-3′；

下游引物：5′-GGGAGGTCCTGAAGGTGCGG-3′。

本发明提供用于检测山羊羊绒纤维直径大小的试剂盒，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP2-1基因中位置c.-80处，c.-74处，c.-38处，c.-31处，c.48 处，c.67处，c.71处，c.99处，c.117处的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述山羊羊绒纤维直径大小。

作为优选，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP2-1基因中位置c.-80处为C，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为G，c.71处为A，c.99处为C，c.117处为C；

b、由步骤a的结果预测所述山羊羊绒纤维直径大小。

作为优选，所述试剂盒还包括用于扩增KRTAP2-1基因的引物对，所述引物对为：

上游引物：5′-TCTGGGGATCATCATCTCCT-3′；

下游引物：5′-GGGAGGTCCTGAAGGTGCGG-3′。

本发明提供上述与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记在鉴定山羊羊绒纤维直径大小 中的应用。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

(1)提取山羊血液中的基因组DNA；

(2)以山羊基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当山羊个体含有等位基因C时，其羊绒纤维直径最小；当山羊个体不含有等位基因C时，其羊绒纤维直径最大；

所述等位基因C的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3。

作为优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照， 凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测 样本的山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

本发明提供上述遗传标记在选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的山羊中的应 用。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

(1)提取山羊血液中的基因组DNA；

(2)以山羊基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，选留含有等位基因C的山羊，淘汰不含有等位基因 C的山羊；

所述等位基因A、B和C的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.3；

作为优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照， 凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测 样本的山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

本发明公开的遗传标记能够用于鉴定陇东绒山羊羊绒纤维直径大小，能够用于选留羊 绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的陇东绒山羊。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例 一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为5个山羊KRTAPs基因在19号染色体上的位置。

图2为陇东绒山羊KRTAP2-1基因的PCR-SSCP检测结果。

图3为基于山羊、绵羊和人类的HS-KAPs的氨基酸序列构建的系统进化树。

图4为山羊和人类KAP2-1的氨基酸序列对比结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

在甘肃省庆阳市环县钰生绒山羊繁育有限责任公司，以8只无血缘关系的陇东绒山羊 公羊作为父本，采用人工授精技术对陇东绒山羊母羊进行配种。在后代中随机选择249只 发育正常的陇东绒山羊，待其周岁时，现场测定产绒量和绒层高度。在背中线处采集羊绒 样品，带回实验室测定羊绒平均纤维直径(MeanFibre Diameter,MFD)。对于上述249只个体，每只羊颈静脉采血8mL，加入酸性柠檬酸葡萄糖(citric acid dextrose,ACD)抗凝，-20℃冻存，采用苯酚－氯仿抽提法提取基因组DNA。

1.2山羊基因组序列分析

根据人类KRTAP2-1基因的编码区序列(GenBank登录号：NM001123387.1)，利用GenBank的BLAST软件在山羊基因组GCF_001704415.1 (www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1)进行同源性搜索。在比对结果中，与 人类KRTAP2-1基因同源性最高的DNA序列被假定为山羊KRTAP2-1基因的序列。

1.3KRTAP2-1基因的引物设计和PCR扩增

根据上述序列，设计引物，特异性扩增山羊KRTAP2-1基因的假定序列，目的片段长度为510bp。上游引物是5′-TCTGGGGATCATCATCTCCT-3′，下游引物是5′-GGGAGGTCCTGAAGGTGCGG-3′。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

PCR反应总体系为20μL，其中Taq预混酶10μL(上海华大基因科技有限公司)，ddH₂O 7.6μL，0.25μmol·L^-1的上下游引物各0.8μL，50ng·μL^-1的基因组DNA模板0.8μL。

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s， 共进行35个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存PCR产物。

1.4山羊KRTAP2-1基因的SSCP分析

取1μLPCR扩增产物加入8μL变性上样缓冲液(98％去离子甲酰胺、10mmol·L^-1EDTA、0.025％溴酚蓝和0.025％二甲苯氰)，105℃变性10min后，立刻放入冰水混合物 中，快速上样于14％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr：Bis＝37.5：1)中，在0.5×TBE缓 冲液中，先于350V、35℃条件下电泳40min，最后在170V、35℃条件下电泳23h。电 泳完成后，根据Byun等的方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色，判定每一个样本的基因型。

1.5KRTAP2-1等位基因的测序

通过SSCP分析来判断个体基因型是纯合子还是杂合子。如个体基因型为纯合子，直 接用PCR扩增产物进行测序；如果个体基因型全部为杂合子(无纯合子)，则采用Gong 等报道的方法进行切胶测序。测序在西安奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.6数据统计分析

使用MEGA(V 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)进行DNA序列比对和系统发育树构建，用GenBank数据库中在线BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列同源性比对，用Popgen(V32.0)计算等位基因频率、遗传杂合度(He)和有效等 位基因数(Ne)，用PIC计算群体多态信息含量(polymorphism information content,PIC)， 用在线软件NetPhos 3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)预测氨基酸序 列的磷酸化位点。

采用SPSS(V 20.0)软件的一般线性混合效应模型(General LinerMixed-effectModels, GLMMs)分析等位基因状态(存在或缺失)对陇东绒山羊羊绒性状的影响。为了确定模 型分析中所用的因素，我们分析了出生等级(单羔和双羔)、父本(配种公羊)和性别对249只陇东绒山羊产绒性状的影响。结果表明，出生等级(单羔和双羔)对羊绒性状没有 显著影响(P>0.05)，父本(配种公羊)和性别对羊绒性状有极显著的影响(P<0.01)。 因此，在模型中，把基因型和父本作为固定效应，把性别作为随机效应。由于所有羊只年 龄均相同，且在统一管理条件下饲养，因此在模型中没有考虑年龄和环境因素。

2结果与分析

2.1山羊KRTAP2-1基因鉴定

利用人类KRTAP2-1基因的编码区序列(GenBank登录号：NM001123387.1)，用GenBank中Blast程序在山羊基因组中搜索，结果在山羊19号染色体上发现一个399bp(40927134-40927532)的开放阅读框，这条序列与人类的KRTAP2-1基因序列有97％的相 似性。在该区域附近有4个以前被鉴定的山羊KRTAPs基因，它们分别是KRTAP1-3、 KRTAP1-4、KRTAP1-1和KRTAP9-2(图1)。

图1为5个山羊KRTAPs基因在19号染色体上的位置。

注：水平箭头表示KRTAPs的编码区域，箭头方向表示基因的转录方向。参考山羊基因组 GCF_001704415.1(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1)序列，描述了KRTAPs在19号 染色体中的位置。

通过PCR-SSCP分析发现，在249只陇东绒山羊中检测到7个等位基因(分别是A、 B、C、D、E、F和G)和11种基因型(AA、BB、CC、DE、AB、AC、AF、AG、BC、 BF和CF)(图2)。7个等位基因中，等位基因F的序列与山羊基因组完全相同，其它等 位基因的核苷酸序列与山羊基因组的序列相似性均超过98％。

图2为陇东绒山羊KRTAP2-1基因的PCR-SSCP检测结果。

应用本发明发现的A-G 7条核苷酸所编码的氨基酸序列，以及从人类、绵羊和山羊中 鉴定出的HS-KAPs氨基酸序列，构建了系统发育树(图3)。结果表明，本发明发现的7 条序列与人类和绵羊的KAP2-1序列具有最高的同源性，说明这7条序列是山羊KRTAP2-1 的7个等位基因。

图3为基于山羊、绵羊和人类的HS-KAPs的氨基酸序列构建的系统进化树。

注：前缀h、s、g分别表示人、绵羊和山羊的氨基酸序列，7个新鉴定的山羊KAP2-1序列显示在方框中，其它HS-KAPs的GenBank登录号分别为JN012101.1(gKAP1-4)， NM_001285774(gKAP3-1)，NM_001285767.1(gKAP11-1)，AY510115(gKAP13-1)， JX426138(gKAP13-3)，X01610(sKAP1-1andsKAP1-4)，HQ897973(sKAP1-2)，X02925 (sKAP1-3)，P02443(sKAP2-1)，P02441(sKAP2-3)，P02446(sKAP3-1)，P02444(sKAP3-2)， P02445(sKAP3-3)，HQ595347(sKAP11-1)，JN377429(sKAP13-3)，KX817979(sKAP15-1)， JX112014(sKAP24-1)，KX644903(sKAP26-1)，NM_030967.2(hKAP1-1)，NM_030966.1 (hKAP1-3)，NM_001257305.1(hKAP1-4)，NM_031957.1(hKAP1-5)，NM_001123387.1 (hKAP2-1)，NM_033032.2(hKAP2-2)，NM_001165252.1(hKAP2-3)，NM_033184.3 (hKAP2-4)，NM_031958.1(hKAP3-1)，NM_031959.2(hKAP3-2)，NM_033185.2(hKAP3-3)， NM_175858.2(hKAP11-1)，NM_181599.2(hKAP13-1)，NM_181621.3(hKAP13-2)， NM_181622.1(hKAP13-3)，NM_181600.1(hKAP13-4)，NM_181623.1(hKAP15-1)， NM_001146182.1(hKAP16-1)，NM_181624.1(hKAP23-1)，NM_001085455.2(hKAP24-1)， NM_001128598.1(hKAP25-1)，NM_203405.1(hKAP26-1)andNM_001077711.1(hKAP27-1)。 2.2山羊KRTAP2-1基因的SNPs

7个等位基因的核苷酸序列分别为：

等位基因A的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCAGAGCAAGGGGAAGA CACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCGCCTCAACCCCACTCGGCCCCAC ACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCG GAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTACTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCGCCCAGTGTCCT GCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCT GCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGC TGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGC TGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCC ACCAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

等位基因B的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCAGAGCAAGGGGAAGA CACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCGCCTCAACCCCACTCGGCCCCAC ACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCG GAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTGCTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCCCGTGTCCTGCC AGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCTGCG AGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGCTGC CGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGCTGC TGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCCACC AGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

等位基因C的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAAGGGGAAGA CACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCGCCTCAACCCCACTCGGCCCCAC ACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCG GAGGCTGCCTCCAGCCCGGCTACTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCGCCCCGTGTCCT GCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCT GCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGC TGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGC TGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCC ACCAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

等位基因D的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAAGGGGAAGA CAACACCTGAGAACACTCAACTCCTCTCACCGCCTCAACCCCACTCGGCCCCACAC ACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCGGA GGCTGCCTCCAGCCCCGCTACTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCGCCCCGTGTCCTGC CAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCTGC GAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGCTG CCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGCTG CTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCCAC CAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

等位基因E的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGGAAGA CACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCGCCTCAACCCCACTCGGCCCCAC ACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCG GAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTGCTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCGCCCCGTGTCCT GCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCT GCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGC TGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGC TGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCC ACCAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

等位基因F的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGGAAGA CACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCACCTCAACCCCACTCGGCCCCAC ACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCG GAGGCTGCCTCCAGCCCGGCTGCTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCGCCCCGTGTCCT GCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCT GCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGC TGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGC TGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCC ACCAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

等位基因G的核苷酸序列为：

TCTGGGGATCATCATCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGGAAGA CACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCGCCTCAACCCCACTCGGCCCCAC ACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGTG GAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTGCTACCGCGACCCCTGCTGCTGCCGCCCCGTGTCCT GCCAGACCACTGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCT GCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGC TGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACGTCGTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGC TGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTGTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCC ACCAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCC

测序结果表明，陇东绒山羊KRTAP2-1的7个等位基因中存在9个SNPs位点和2个 插入/删除位点(表1)。9个SNPs位点中，4个SNPs(c.-80A>C、c.-74A>G、c.-38G>T 和c.-31G>A)位于5'UTR区域，5个SNPs(c.48C>T、c.67C>G、c.71A>G、c.99A>C和 c.117C>T)位于KRTAP2-1基因的编码区域。c.67C>G和c.71A>G是非同义突变，分别引 起了p.Arg23Gly和p.Tyr24Cys氨基酸的改变。与A、B、C、E、F和G等位基因序列相 比，等位基因D发生了3-bp的碱基删除(c.-61_-63delCTC)。与A、C、D、E、F和G等 位基因序列相比，等位基因B发生了3-bp的碱基删除(c.93_95delCCG)。

表1陇东绒山羊KRTAP2-1基因的SNPs

注：“-”表示氨基酸未发生改变，SNPs和氨基酸的顺序和书写格式遵循了HGVS的命名规则 (http://varnomen.hgvs.org/)。

2.3陇东绒山羊KAP2-1多肽链的氨基酸组成

山羊KAP2-1多肽链包含132个氨基酸。其中半胱氨酸的比例最高，为23.48-24.24mol％，其次为丝氨酸(9.85mol％)、脯氨酸(13.64mol％)和苏氨酸(11.36mol％)，天冬 氨酸、组氨酸和赖氨酸在7条多肽链中未出现。在等位基因A、C、D、E、F和G翻译的 多肽链中发现了15个潜在的磷酸化位点，包含8个丝氨酸和7个苏氨酸磷酸化位点。在 等位基因B翻译的多肽链中发现了14个潜在的磷酸化位点，包括7个丝氨酸和7个苏氨 酸磷酸化位点。

图4为山羊和人类KAP2-1的氨基酸序列对比结果。

注：“-”表示与gKAP2-1*A的序列相同，“.”表示氨基酸缺失。阴影部分代表KAP2-1序列的磷 酸化位点，山羊和人类的序列分别用前缀“g”和“h”表示，方框中表示的是CC(X)P(X)的五聚体重 复结构，序列长度在右边显示。

2.4陇东绒山羊KRTAP2-1基因的遗传多态性分析

在249只陇东绒山羊中，各个等位基因的频率分别为：A：67.81％，B：12.75％，C：12.55％，D：1.01％，E：1.01％，F：4.66％，G：0.2％。共检测到11种基因型，其中AA、 AB、AC和AF为优势基因型，这4种基因型的总频率为90.77％，其它7种基因型(BB、 CC、DE、AG、BC、BF和CF)的频率均小于5％。有效等位基因数(Ne)、遗传杂合度 (He)和多态信息含量(PIC)3个指标可以用来评价一个群体的遗传多态性。结果表明， 陇东绒山羊的多态信息含量为0.48，属于中度多态，有效等位基因数为2.02，遗传杂合度 为0.55。

2.5 KRTAP2-1基因核苷酸序列变异与羊绒性状的关系

在发现的7个等位基因中，由于等位基因D、E、F和G的频率都低于5％，因此在 相关性分析中，只分析了等位基因A、B和C对陇东绒山羊羊绒性状的影响。结果表明， 等位基因C的存在与较小的羊绒纤维直径相关(存在：13.4±0.05；缺失：13.6±0.03；P＝ 0.01)(表2)。

表2 KRTAP2-1基因核苷酸序列变异与陇东绒山羊羊绒性状的相关性(Mean±SE)

3结论

KRTAP2-1等位基因对陇东绒山羊的羊绒纤维直径有显著影响(P＝0.01)，含有等位基 因C的个体的羊绒纤维直径小于缺失等位基因C的个体。因此，在对陇东绒山羊进行分子选种时，应选留含有等位基因C的个体，以降低陇东绒山羊的羊绒纤维直径。

实施例2

本发明的陇东绒山羊的羊绒纤维直径检测PCR-SSCR试剂盒包括：

1、PCR反应体系

20μL PCR反应体系为：Taq预混酶10μL(上海华大基因科技有限公司)，ddH₂O 7.6μL， 0.25μmol·L^-1的上下游引物各0.8μL，50ng·μL^-1的基因组DNA模板0.8μL。

其中，上游引物：5′-TCTGGGGATCATCATCTCCT-3′

下游引物：5′-GGGAGGTCCTGAAGGTGCGG-3′。

2、SSCP上样变性缓冲液

包括98％去离子甲酰胺、10mmol·L^-1EDTA、0.025％溴酚蓝和0.025％二甲苯氰。

3、标准样

标准样A：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；

标准样B：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2。

标准样C(同时作为阳性对照)：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3。

DNA模板的获得方法以及试剂盒的使用方法参照实施例1。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡 在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 510

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 1

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc ccagagcaag gggaagacac 60

tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cgcctcaacc ccactcggcc ccacacacca 120

ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct cagctgtggc ggaggctgcc 180

tccagccccg ctactaccgc gacccctgct gctgccgccc agtgtcctgc cagaccaccg 240

tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc catctgcgag ccctgccgcc 300

gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg ctgccgcccc atcacctgct 360

gccccacgtc gtgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg ctgggccacc acgtgctgcc 420

agcccgtgtc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag ctgccagccg gccccctgcc 480

gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc 510

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 2

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc ccagagcaag gggaagacac 60

tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cgcctcaacc ccactcggcc ccacacacca 120

ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct cagctgtggc ggaggctgcc 180

tccagccccg ctgctaccgc gacccctgct gctgccccgt gtcctgccag accaccgtga 240

gccgccccgt gaccttcgtg tcccgctgca cgcgccccat ctgcgagccc tgccgccgcc 300

cggtctgctg cgacccctgc agcctgcagg agggctgctg ccgccccatc acctgctgcc 360

ccacgtcgtg ccaggccgtg gtctgccgcc cctgctgctg ggccaccacg tgctgccagc 420

ccgtgtctgt gcagtccccg tgctgccgcc ccaccagctg ccagccggcc ccctgccgca 480

ccacctgccg caccttcagg acctccc 507

<210> 3

<211> 510

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 3

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc cccgagcaag gggaagacac 60

tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cgcctcaacc ccactcggcc ccacacacca 120

ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct cagctgtggc ggaggctgcc 180

tccagcccgg ctactaccgc gacccctgct gctgccgccc cgtgtcctgc cagaccaccg 240

tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc catctgcgag ccctgccgcc 300

gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg ctgccgcccc atcacctgct 360

gccccacgtc gtgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg ctgggccacc acgtgctgcc 420

agcccgtgtc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag ctgccagccg gccccctgcc 480

gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc 510

<210> 4

<211> 507

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 4

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc cccgagcaag gggaagacaa 60

cacctgagaa cactcaactc ctctcaccgc ctcaacccca ctcggcccca cacaccacca 120

tgaccggctc ctgctgcggc cccaccttct cctccctcag ctgtggcgga ggctgcctcc 180

agccccgcta ctaccgcgac ccctgctgct gccgccccgt gtcctgccag accaccgtga 240

gccgccccgt gaccttcgtg tcccgctgca cgcgccccat ctgcgagccc tgccgccgcc 300

cggtctgctg cgacccctgc agcctgcagg agggctgctg ccgccccatc acctgctgcc 360

ccacgtcgtg ccaggccgtg gtctgccgcc cctgctgctg ggccaccacg tgctgccagc 420

ccgtgtctgt gcagtccccg tgctgccgcc ccaccagctg ccagccggcc ccctgccgca 480

ccacctgccg caccttcagg acctccc 507

<210> 5

<211> 510

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 5

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc cccgagcagg gggaagacac 60

tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cgcctcaacc ccactcggcc ccacacacca 120

ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct cagctgtggc ggaggctgcc 180

tccagccccg ctgctaccgc gacccctgct gctgccgccc cgtgtcctgc cagaccaccg 240

tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc catctgcgag ccctgccgcc 300

gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg ctgccgcccc atcacctgct 360

gccccacgtc gtgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg ctgggccacc acgtgctgcc 420

agcccgtgtc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag ctgccagccg gccccctgcc 480

gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc 510

<210> 6

<211> 510

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 6

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc cccgagcagg gggaagacac 60

tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cacctcaacc ccactcggcc ccacacacca 120

ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct cagctgtggc ggaggctgcc 180

tccagcccgg ctgctaccgc gacccctgct gctgccgccc cgtgtcctgc cagaccaccg 240

tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc catctgcgag ccctgccgcc 300

gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg ctgccgcccc atcacctgct 360

gccccacgtc gtgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg ctgggccacc acgtgctgcc 420

agcccgtgtc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag ctgccagccg gccccctgcc 480

gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc 510

<210> 7

<211> 510

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 7

tctggggatc atcatctcct ggccagggta tataaagggc cccgagcagg gggaagacac 60

tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cgcctcaacc ccactcggcc ccacacacca 120

ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct cagctgtggt ggaggctgcc 180

tccagccccg ctgctaccgc gacccctgct gctgccgccc cgtgtcctgc cagaccactg 240

tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc catctgcgag ccctgccgcc 300

gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg ctgccgcccc atcacctgct 360

gccccacgtc gtgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg ctgggccacc acgtgctgcc 420

agcccgtgtc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag ctgccagccg gccccctgcc 480

gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc 510

Claims (10)

1.与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记，其特征在于：其位于KRTAP2-1基因上，具有A、B和C三个优势等位基因，所述等位基因A、B和C的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.3；含有等位基因C的个体，其羊绒纤维直径最小；缺失等位基因C的个体，其羊绒纤维直径最大；作为优选，所述山羊为绒山羊；

所述等位基因A为：在KRTAP2-1基因c.-80处为A，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为C，c.71处为A，c.99处为A，c.117处为C；

所述等位基因B为：在KRTAP2-1基因c.-80处为A，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为C，c.71处为G，c.99处为C，c.117处为C，c.93处缺失了C，c.94处缺失了C，c.95处缺失了G；

所述等位基因C为：在KRTAP2-1基因c.-80处为C，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为G，c.71处为A，c.99处为C，c.117处为C。

2.用于检测权利要求1所述的与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：

上游引物：5′-TCTGGGGATCATCATCTCCT-3′；

下游引物：5′-GGGAGGTCCTGAAGGTGCGG-3′。

3.用于检测山羊羊绒纤维直径大小的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP2-1基因中位置c.-80处，c.-74处，c.-38处，c.-31处，c.48处，c.67处，c.71处，c.99处，c.117处的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述山羊羊绒纤维直径大小。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP2-1基因中位置c.-80处为C，c.-74处为A，c.-38处为G，c.-31处为G，c.48处为C，c.67处为G，c.71处为A，c.99处为C，c.117处为C；

b、由步骤a的结果预测所述山羊羊绒纤维直径大小。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增KRTAP2-1基因的引物对，所述引物对为：

上游引物：5′-TCTGGGGATCATCATCTCCT-3′；

下游引物：5′-GGGAGGTCCTGAAGGTGCGG-3′。

6.权利要求1所述的与山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记在鉴定山羊羊绒纤维直径大小中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取山羊血液中的基因组DNA；

(2)以山羊基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当山羊个体含有等位基因C时，其羊绒纤维直径最小；当山羊个体不含有等位基因C时，其羊绒纤维直径最大；

所述等位基因C的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

9.权利要求1所述的遗传标记在选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的山羊中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取山羊血液中的基因组DNA；

(2)以山羊基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，选留含有等位基因C的山羊，淘汰不含有等位基因C的山羊；

所述等位基因A、B和C的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.3；

作为优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

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