CN116987794B - 一种rgmb基因突变及其在产羔数高的绵羊的筛选上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种RGMB基因突变及其在产羔数高的绵羊筛选上的应用，属于SNP检测领域。本发明提供了产羔数高的绵羊筛选试剂盒，它包括检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂。本发明还提供了产羔数高的绵羊筛选方法。本发明试剂盒和方法有效筛选产羔数高的绵羊，快速确定多胎性状优良的绵羊种群，对于提高藏羊生产性能有非常重要的意义，具有非常优良的应用前景。

Description

一种RGMB基因突变及其在产羔数高的绵羊的筛选上的应用

技术领域

本发明属于SNP技术领域，具体涉及一种RGMB基因突变及其在产羔数高的绵羊筛选上的应用。

背景技术

藏羊是我国三大原始绵羊品种之一，主要分布在青藏高原及其毗邻地区。藏羊具有遗传保守性强、耐粗饲、适应高海拔、体质强壮、采食能力强的特点。但是藏羊存在生产性能低的劣势，其发育成熟晚，一年一胎，且大部分每胎产单羔。产羔数性状是绵羊三大重要经济性状(产羔、肉和毛皮)中所占权重最大的生产性状，产羔率的高低直接影响绵羊养殖的生产成本和生产效率，绵羊产羔数是一个遗传力很低(0.1左右)受多基因控制的复杂性状，因此难以用常规的育种技术来快速改良。分子标记辅助选择则可以克服这类低遗传力性状的选择难度。因此研究影响绵羊产羔数的分子标记对于青藏高原多胎资源的开发利用及生产实践有重要意义。

RGMB(Repulsive Guidance Molecule B)基因是排斥导向家族(RGM)成员之一，最初发现作为调节的粘附分子斥力的轴突，其UniProt登记号为W5Q9V2。未见RGMB基因突变与绵羊产羔数相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的RGMB基因的SNP，及其用于产羔数高绵羊的筛选的应用。

本发明提供了一种基因，它是绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点突变为T的绵羊RGMB基因。

本发明还提供了一种产羔数高的绵羊筛选试剂盒，它包括检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂。

其中，所述试剂包括检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点C>T的相关试剂。

其中，所述的试剂为测序试剂、PCR检测试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

优选地，所述试剂为竞争性等位基因特异性PCR检测试剂，进一步优选包括SEQ IDNO.1～3所示引物。

本发明还提供了检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂在制备产羔数高的绵羊筛选试剂中的用途。

其中，所述的试剂包括检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点C>T的相关试剂；或，所述筛选试剂是产羔数高的藏羊的筛选试剂。

其中，所述的试剂为测序试剂、PCR检测试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

优选地，所述试剂为竞争性等位基因特异性PCR检测试剂，进一步优选包括SEQ IDNO.1～3所示引物。

本发明还提供了一种产羔数高的绵羊筛选方法，包括如下步骤：

(1)提取待检绵羊样本的基因组总DNA；

(2)检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点，即可；

优选地，所述绵羊为藏羊。

本发明首次发现RGMB基因中位于绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的多态性与绵羊(特别是藏羊)产羔数具有非常强的相关性，位点可以作为绵羊多产性的分子遗传标记，可以通过检测该SNP位点筛选产羔数高的绵羊，可以用于快速筛选多胎性状优良的绵羊种群，从而为绵羊多胎品种改良提供珍贵的多胎遗传资源，有利于提高品种产羔数，加快稀有多胎品种培育进程，同时也有利于提高稀有多胎选种的准确性。

本发明的关键在于发现RGMB基因中位于绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点多态性与绵羊(特别是藏羊)产羔数具有极强的相关性，可以通过检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点来筛选产羔数高的绵羊。任何能够检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的方法和试剂均可以用于产羔数高的绵羊的筛选，转化前景十分广阔。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为绵羊RGMB基因单核苷酸多态性的检测总体技术流程图。

图2为藏羊样本基因组DNA质检电泳图(图中：S1-S8为样本编号，M为Marker条带示意图，右边分别为阳性和阴性对照)。

图3为藏羊样本第5号染色体的第95132658位KASP分型结果(CC、CT、TT基因型)(图中：NTC为阴性对照，X为Undetermined)。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照以下实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商建议的条件；实施例中所用到的各种化学试剂均可以商购获得，所用引物委托合成。

实施例1、本发明产羔数高的绵羊筛选试剂盒和方法

1、本发明KASP试剂盒的组分包括：

(1)KASP反应引物：

RGMB-Primer1-FAM(上游引物F1，SEQ IN NO.1):

5’-gaaggtgaccaagttcatgctAGTAATGATAGACCTCTGATAAGAAGTTTC-3’(小写字母为FAM接头)

RGMB-Primer2-HEX(上游引物F2，SEQ IN NO.2):

5’-gaaggtcggagtcaacgattAGTAATGATAGACCTCTGATAAGAAGTTTT-3’(小写字母为HEX接头)

RGMB-Common-Primer(下游引物，SEQ IN NO.3):

5’-CATGACTGAGCGACTTTCACTTTT-3’

(2)KASP反应用其他试剂：KASP Master Mix；Primer Mix；水。

2、检测方法

(1)提取待检绵羊样本的基因组总DNA；

(2)采用KASP试剂盒检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点基因型，即可。

实施例2、SNP位点与藏羊多胎性状相关性的验证

(1)基因组DNA的提取

选择藏羊为试验材料，使用采耳钳采集绿豆粒大小耳缘组织保存于75％酒精，用于后续提取基因组DNA。

(2)基因组DNA的提取

从藏羊耳缘组织中提取DNA，DNA样品采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)进行提取，严格按照操作说明书进行提取。

(3)样品DNA质量检测

使用Thermo Scientific公司的NanoDrop 8000超微量分光光度计测量所提取的基因组DNA浓度，结果显示，样品浓度均在100ng/μL以上，260/280值在1.8-2.0之间；良好的DNA电泳结果应是：①主带明亮清晰，无拖带，主带大小在10kb大小附近；②若主带变宽、变暗，表明DNA有轻微降解。若变成弥散的DNA条带，表明DNA严重降解；③若电泳无带，表明提取的DNA总量和浓度极低，有较大可能导致PCR扩增失败。电泳结果显示基因组DNA条带清晰无杂质(图2)，表明所提取的基因组DNA完整度良好，符合后续试验标准。

(4)KASP引物设计

以绵羊参考基因组ARS-UI_Ramb_v2.0版本第5号染色体的第95132658位的RGMB基因部分片段为模板，使用引物设计工具snpway设计KASP反应引物：

RGMB-Primer1-FAM(上游引物F1，SEQ IN NO.1):

5’-gaaggtgaccaagttcatgctAGTAATGATAGACCTCTGATAAGAAGTTTC-3’(小写字母为FAM接头)

RGMB-Primer2-HEX(上游引物F2，SEQ IN NO.2):

5’-gaaggtcggagtcaacgattAGTAATGATAGACCTCTGATAAGAAGTTTT-3’(小写字母为HEX接头)

RGMB-Common-Primer(下游引物，SEQ IN NO.3):

5’-CATGACTGAGCGACTTTCACTTTT-3’

(5)KASP扩增

以提取所得的基因组DNA为模板，以合成的上游引物RGMB-Primer1-FAM、RGMB-Primer2-HEX与通用引物RGMB-Common-Primer作为实验引物组进行PCR扩增，具体反应体系和反应程序如下：

反应体系为5μL：包括1.0μL体积的基因组DNA(20ng/μL)、2.5μL体积的2×KASPMaster Mix、0.15μL体积的Primer Mix(RGMB-Primer1-FAM浓度为10μM、RGMB-Primer2-HEX浓度为10μM与RGMB-Common-Primer浓度为20μM)以及1.35μL的水。

反应程序为：①94.0℃预变性15min，1个循环；②94.0℃变性20sec，65℃复性延伸60sec，10个循环(每个循环复性温度降低0.7℃)；③94.0℃变性20sec，57℃复性延伸60sec，30个循环；④30℃荧光读取60sec，1个循环。

(6)基因分型

使用QuantStudio^TM5Real-Time PCR System进行基因分型，根据分析结果确定所述的RGMB基因中位于绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的基因型，分型结果如图3所示。

(7)基因型与产羔性状相关性分析

试验共对377只藏羊的5号染色体的第95132658位的基因型进行了检测，并记录了产羔数据。将基因型与产羔性状相关性分析：

KASP分型结果显示在377个体当中CC基因型有150个，CT基因型有180个，TT基因型有47个。

表1 RGMB基因不同基因型与产羔数的相关性

注：同列数据不同的肩标小写字母表示差异显著(p<0.05)

结果表明(表1)，绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点突变与藏羊产羔数呈显著相关，TT基因型个体的产羔数显著高于CT基因型和CC基因型的个体,CT基因型个体的产羔数显著高于CC基因型的个体，绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点包含T的个体，特别是纯合TT基因型的个体，其产羔数比较高，可以通过检测可以绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点筛选产羔数高的藏羊，进而有效建立连续产多羔的绵羊种群。

综上，本发明提供了一种有效筛选产羔数高的绵羊(特别是藏羊)的试剂盒和方法，可以用于快速筛选多胎性状优良的绵羊种群，为生产性能高的绵羊(特别是藏羊)育种提供便利，应用前景良好。

Claims (6)

1.检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂在制备产羔数高的绵羊筛选试剂中的用途；所述绵羊参考基因组的版本为ARS-UI_Ramb_v2.0版本；所述绵羊为藏羊。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂包括检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点C>T的相关试剂。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂为测序试剂、PCR检测试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点的试剂为竞争性等位基因特异性PCR检测试剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述竞争性等位基因特异性PCR检测试剂包括SEQ ID NO.1～3所示引物。

6.一种产羔数高的绵羊筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待检绵羊样本的基因组总DNA；

(2)检测绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点，即可；

步骤(1)中，所述绵羊为藏羊；

步骤(2)中，所述绵羊参考基因组的版本为ARS-UI_Ramb_v2.0版本；

步骤(2)中，绵羊参考基因组第5号染色体的第95132658位点包含T的个体，其产羔数高。