CN114231642A - 与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及特异性引物对和应用 - Google Patents

与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及特异性引物对和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物分子标记技术领域，是一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及特异性引物对和应用，包括分子标记SNP5，分子标记SNP5位于绵羊1号染色体98337781处的TXNIP基因3’UTR区上，分子标记SNP5为TXNIP基因3’突变碱基G或A。本发明首次发现TXNIP基因3’UTR的SNP5突变位点与羊毛纤维直径极显著相关，随着C等位基因拷贝数的增加，纤维直径减小，与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记为鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育提供方法和指导。

Description

与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及特异 性引物对和应用
技术领域
本发明涉及动物分子标记技术领域，是一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及特异性引物对和应用。
背景技术
鄂尔多斯细毛羊羊毛综合品质优良，被毛闭合性良好，密度大，细度以66支至70支为主。群体羊毛性状遗传稳定。羊毛纤维直径、纤维长度、产毛量决定了羊毛纤维的品质，是绒毛羊产业重要的经济性状和数量性状，受微效多基因控制，利用传统的育种方法很难再提高羊毛品质及生产性能。目前对绵、山羊绒毛性状相关基因多态性的研究均主要集中在角蛋白家族基因和角蛋白关联蛋白家族基因中，未见TXNIP基因多态性显著影响羊毛性状的报道。
目前对TXNIP的研究，主要集中在人类肥胖、糖尿病、高血压和神经疾病等，在绵羊上的研究较少。
发明内容
本发明提供了一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及特异性引物对和应用，克服了上述现有技术之不足，首次对鄂尔多斯细毛羊TXNIP基因中突变位点遗传多态性分析，通过与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记，实现了鄂尔多斯细毛羊超细型群体的选育。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记，包括分子标记SNP5，分子标记SNP5位于绵羊1号染色体98337781处的TXNIP基因3’UTR区上，分子标记SNP5为TXNIP基因3’UTR区突变碱基G或A,等位基因突变C或T。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述按照下述方法获得：第一步，取待测的鄂尔多斯细毛羊母羊的血液基因组DNA；第二步，以血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCRMixture10μL，浓度为10mol/L的上下游引物各0.5μL，上游引物序列为5’-TTGCCAGACTGGATTGTTGTG-3’，下游引物序列为5’-GAACACAGTGCAACAAGCTCT-3’，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL，将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存，得到PCR产物；第三步，对PCR产物进行双向测序，根据双向测序筛选到突变位点，设计特异性引物对，利用Snapshot检测技术进行突变基因分型，得到对于鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状显著相关的分子标记SNP5。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法，按照下述方法进行：第一步，取待测的鄂尔多斯细毛羊母羊的血液基因组DNA；第二步，以血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCRMixture10μL，浓度为10mol/L的上下游引物各0.5μL，上游引物序列为5’-TTGCCAGACTGGATTGTTGTG-3’，下游引物序列为5’-GAACACAGTGCAACAAGCTCT-3’，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL，将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存，得到PCR产物；第三步，对PCR产物进行双向测序，根据双向测序筛选到突变位点，设计特异性引物对，利用Snapshot检测技术进行突变基因分型，得到对于鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状显著相关的分子标记SNP5。
上述特异性引物对，包括分子标记SNP5的上游引物、分子标记SNP5的下游引物和分子标记SNP5的延伸引物，分子标记SNP5的上游引物为5’-CGAGATGATGTGATACAGAG-3’、分子标记SNP5的下游引物为5’-CCATTCCAGGATGCCATT-3’、分子标记SNP5的延伸引物为5’-ACTCAAAACTACTGAAAATGCCTC-3’。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法中的特异性引物对，包括分子标记SNP5的上游引物、分子标记SNP5的下游引物和分子标记SNP5的延伸引物，分子标记SNP5的上游引物为5’-CGAGATGATGTGATACAGAG-3’、分子标记SNP5的下游引物为5’-CCATTCCAGGATGCCATT-3’、分子标记SNP5的延伸引物为5’-ACTCAAAACTACTGAAAATGCCTC-3’。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种特异性引物对在制备体外检测与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记在鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育中的应用。
本发明首次发现TXNIP基因3’UTR的SNP5突变位点与羊毛纤维直径极显著相关，随着C等位基因拷贝数的增加，纤维直径减小，与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记为鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育提供方法和指导。
附图说明
附图1为本发明中基因组DNA检测结果。
附图2为本发明中TXNIP基因PCR产物检测结果。
附图3为本发明中TXNIP基因突变位点Snapshot分型结果。
附图4为本发明中TXNIP基因突变位点分型验证。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记，其包括分子标记SNP5，分子标记SNP5位于绵羊1号染色体98337781处的TXNIP基因3’UTR区上，分子标记SNP5为TXNIP基因3’UTR区突变碱基G或A,等位基因突变C或T。
实施例2：作为上述实施例的优化，与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记，按照下述方法获得：第一步，取待测的鄂尔多斯细毛羊母羊的血液基因组DNA；第二步，以血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCRMixture10μL，浓度为10mol/L的上下游引物各0.5μL，上游引物序列为5’-TTGCCAGACTGGATTGTTGTG-3’(如序列表SEQ IDNo:4所示)，下游引物序列为5’-GAACACAGTGCAACAAGCTCT-3’(如序列表SEQ ID No:5所示)，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL，将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存，得到PCR产物；第三步，对PCR产物进行双向测序，根据双向测序筛选到突变位点，设计特异性引物对，利用Snapshot检测技术进行突变基因分型，得到对于鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状显著相关的分子标记SNP5。
实施例3：该与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法，按照下述方法进行：第一步，取待测的鄂尔多斯细毛羊母羊的血液基因组DNA；第二步，以血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCRMixture10μL，浓度为10mol/L的上下游引物各0.5μL，上游引物序列为5’-TTGCCAGACTGGATTGTTGTG-3’(如序列表SEQ ID No:4所示)，下游引物序列为5’-GAACACAGTGCAACAAGCTCT-3’(如序列表SEQ ID No:5所示)，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL，将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存，得到PCR产物；第三步，对PCR产物进行双向测序，根据双向测序筛选到突变位点，设计特异性引物对，利用Snapshot检测技术进行突变基因分型，得到对于鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状显著相关的分子标记SNP5。
实施例4：该与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法中的特异性引物对，包括分子标记SNP5的上游引物、分子标记SNP5的下游引物和分子标记SNP5的延伸引物，分子标记SNP5的上游引物为5’-CGAGATGATGTGATACAGAG-3’(如序列表SEQID No:1所示)、分子标记SNP5的下游引物为5’-CCATTCCAGGATGCCATT-3’(如序列表SEQ IDNo:2所示)、分子标记SNP5的延伸引物为5’-ACTCAAAACTACTGAAAATGCCTC-3’(如序列表SEQID No:3所示)。
实施例5：该特异性引物对在制备体外检测与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的试剂或试剂盒中的应用。
实施例6：该与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记在鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育中的应用。
本发明使用的Snapshot检测SNP分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已知SNP位点进行遗传分型的方法，首次发现鄂尔多斯细毛羊TXNIP基因3’UTR的SNP5突变位点与羊毛纤维直径极显著相关，且随着C等位基因拷贝数的增加，纤维直径减小。该发明将TXNIP基因SNP5突变位点作为影响鄂尔多斯细毛羊绒毛纤维直径的分子标记，为鄂尔多斯细毛羊超细型群体的选育提供了依据，加快了鄂尔多斯细毛羊超细型群体选育进程。
下述为本发明所述与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的实验研究：
1材料与方法
1.1样品采集
从内蒙古自治区鄂尔多斯市的乌兰陶勒盖镇(n＝41)、嘎鲁图镇(n＝97)、苏力德苏木(n＝134)、图克镇(n＝91)、乌审召镇(n＝99)五个镇，总共采集462只周岁鄂尔多斯细毛羊母羊作为实验动物。对实验母羊静脉采血至5ml抗凝管中，放入-20冰箱保存，用于后续提取血液基因组DNA。同时在实验羊左侧体中线上方肩胛骨后缘10cm处，采集羊毛样品。将羊毛样品送往农业农村部种羊及羊毛羊绒质量监督检验测试中心，通过纤维直径光学分析仪(OFDA 2000)检测羊毛样品的平均纤维直径、纤维直径变异系数。最后收集实验羊群的2020年鉴定记录，主要包括产毛量、羊毛纤维长度等。
1.2构建DNA混池
利用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取血液基因组DNA。取4ul的DNA，利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，取1ul的DNA，利用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。在测得的羊毛纤维直径数据中，分别选取20个极端个体(极细n＝10，极粗n＝10)DNA样品。其中极细组平均纤维直径为16.36μm，极粗组为21.50μm。将极端个体DNA浓度通过核酸蛋白检测仪检测并加入ddH2O调整到一致。从20个极端个体中取分别取10ul，根据极细、极粗分组，构建2个DNA混合池(极细DNA混合池，极粗DNA混合池)
1.3PCR扩增及测序
根据Ensembl核酸数据库中TXNIP基因(登录号：ENSOART00000022506.1)序列，利用Premer Premer5.0设计引物，引物序列如表1所示。引物由上海生物工程技术有限责任公司合成。以2个混池DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCR Mixture 10μL，上下游引物(10mol/L)各0.5μL，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL。将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。对条带明亮的PCR产物直接送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。测序结果利用DNASTAR软件的SeqMan程序进行序列拼接和校正，用BioEdit软件比对峰图。
1.4Snapshot检测
根据双向测序筛选到突变位点设计上、下游引物和延伸引物，引物信息如表2所示。由北京奥科鼎盛生物科技有限公司使用Snapshot基因分型技术对462只个体进行检测，利用ABI 3730XL测序仪进行分型。最后对每个位点随机挑选3个样品进行一代测序，验证Snapshot分型检测结果。
1.5统计分析
利用Popgene软件计算SNPs的基因频率、基因型频率、有效等位基因数、基因杂合度、多态信息含量，以及Hardy－Weinberg平衡。利用SAS 9.2软件分析SNPs不同基因型与鄂尔多斯细毛羊毛用性状关联性。结果以最小二乘均值±标准误形式表示，线性模型为：
Yick＝μ+Gi+Fe+eick
公式中，Yick：细毛羊个体表型值；μ：群体均值；Gi：基因型SNP效应；Fe：场效应；eick：随机误差。
2结果与分析
2.1DNA和PCR检测结果
提取的基因组DNA经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带明亮，结果如图1所示。利用核酸蛋白检测仪检测DNA，在260nm与280nm下的OD比值为1.8至2.1，说明提取的DNA质量与纯度满足后续实验要求。TXNIP基因PCR产物检测结果如图2所示。PCR产物与预期片段大小一致，无杂带，符合后续实验的要求。
2.2混池结果分析
对鄂尔多斯细毛羊1个基因PCR片段混池测序发现了突变。其中TXNIP基因P5片段上发现了1个突变(SNP5)。TXNIP两个基因的突变信息如表3所示。其中SNP5为TXNIP基因3’UTR区突变。
2.3Snapshot检测分型及验证结果
利用Snapshot分型技术检测462只鄂尔多斯细毛羊TXNIP基因的突变位点分型峰图如图3所示。在Snapshot检测中该突变位点成功分型，并均具有不同基因型。其中SNP5延伸产物为反向延伸。根据Snapshot分型检测结果，随机选择该突变不同基因型个体进行一代测序，SNP5为正向测序，验证结果如图4所示。由图4可知，一代测序与Snapshot分型结果完全匹配，说明Snapshot分型结果可靠。
2.4遗传多态性分析
鄂尔多斯细毛羊TXNIP基因的突变基因型频率、等位基因频率、χ2计算结果如表4所示。由表4可知，SNP5为CC基因型。同时该突变位点的χ2值均未达到显著水平，Hardy－Weinberg平衡。另外，鄂尔多斯细毛羊TXNIP基因SNP5突变位点遗传纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态性信息含量(PIC)分析如表5所示。由表5可知，该突变位点纯合度较高，有效等位基因数分别为1.812。根据突变位点多态性标准：PIC>0.5为高度多态，0.25<PIC<0.5为中度多态，PIC<0.25为低度多态。由表5可知，SNP5等突变位点为中度多态。
2.5该突变位点与羊毛性状相关性分析
利用SAS 9.2软件对鄂尔多斯细毛羊TXNIP基因的突变位点多态性与羊毛性状相关性分析如表6所示。其中TXNIP基因SNP5突变位点CC基因型平均纤维直径为18.27μm、CT基因型平均纤维直径为18.43μm、TT基因型平均纤维直径为18.99μm。TT基因型平均纤维直径显著高于CT基因型(P<0.05)，极显著高于CC基因型(P<0.01)。CC基因型和CT基因型之间平均纤维直径差异不显著(P>0.05)。
综上所述，本发明首次发现TXNIP基因3’UTR的SNP5突变位点与羊毛纤维直径极显著相关，随着C等位基因拷贝数的增加，纤维直径减小，与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记为鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育提供方法和指导。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1引物信息表
Figure BDA0003459537270000061
表2检测扩增引物和延伸引物
Figure BDA0003459537270000062
表3 TXNIP基因突变位点信息表
Figure BDA0003459537270000071
表4 TXNIP基因的基因型频率和等位基因频率
Figure BDA0003459537270000072
表5 TXNIP基因群体多态性分析
Figure BDA0003459537270000073
表6 TXNIP基因突变位点与羊毛性状关联性分析
Figure BDA0003459537270000074
肩标不同小写字母的平均值间差异显著(P<0.05)；肩标不同大写字母的平均值间差异极显著(P<0.01)；肩标相同字母或无字母的平均值之间差异不显著。
序列表
<110>新疆畜牧科学院畜牧研究所和鄂尔多斯市农牧业科学研究院（内蒙古农牧科学院鄂尔多斯分院）
<120>与鄂尔多斯细毛羊绒毛纤维直径及变异系数性状相关的分子标记及特异性引物对和应用
<130>
<160>5
<170>PatentIn 3.5
<210> 1
<211>21
<212> mRNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgagatgatg tgatacagag t 21
<210> 2
<211>18
<212> mRNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccattccagg atgccatt 18
<210> 3
<211>24
<212> mRNA
<213> 人工序列
<400> 1
actcaaaact actgaaaatg cctc 24
<210> 4
<211>21
<212> mRNA
<213> 人工序列
<400> 1
Ttgccagact ggattgttgt g 21
<210> 5
<211>21
<212> mRNA
<213> 人工序列
<400> 1
Gaacacagtg caacaagctct 21

Claims (7)

1.一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记，其特征在于包括分子标记SNP5，分子标记SNP5位于绵羊1号染色体98337781处的TXNIP基因3’UTR区上，分子标记SNP5为TXNIP基因3’UTR区突变碱基G或A,等位基因突变C或T。
2.根据权利要求1所述的与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记，其特征在于按照下述方法获得：第一步，取待测的鄂尔多斯细毛羊母羊的血液基因组DNA；第二步，以血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCRMixture10μL，浓度为10mol/L的上下游引物各0.5μL，上游引物序列为5’-TTGCCAGACTGGATTGTTGTG-3’，下游引物序列为5’-GAACACAGTGCAACAAGCTCT-3’，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL，将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存，得到PCR产物；第三步，对PCR产物进行双向测序，根据双向测序筛选到突变位点，设计特异性引物对，利用Snapshot检测技术进行突变基因分型，得到对于鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状显著相关的分子标记SNP5。
3.一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法，其特征在于按照下述方法进行：第一步，取待测的鄂尔多斯细毛羊母羊的血液基因组DNA；第二步，以血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCRMixture10μL，浓度为10mol/L的上下游引物各0.5μL，上游引物序列为5’-TTGCCAGACTGGATTGTTGTG-3’，下游引物序列为5’-GAACACAGTGCAACAAGCTCT-3’，DNA模板1.0μL，加蒸馏水至20μL，将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存，得到PCR产物；第三步，对PCR产物进行双向测序，根据双向测序筛选到突变位点，设计特异性引物对，利用Snapshot检测技术进行突变基因分型，得到对于鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状显著相关的分子标记SNP5。
4.据权利要求3所述的与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法，其特征在于特异性引物对包括分子标记SNP5的上游引物、分子标记SNP5的下游引物和分子标记SNP5的延伸引物，分子标记SNP5的上游引物为5’-CGAGATGATGTGATACAGAG-3’、分子标记SNP5的下游引物为5’-CCATTCCAGGATGCCATT-3’、分子标记SNP5的延伸引物为5’-ACTCAAAACTACTGAAAATGCCTC-3’。
5.一种与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的获得方法中的特异性引物对，其特征在于包括分子标记SNP5的上游引物、分子标记SNP5的下游引物和分子标记SNP5的延伸引物，分子标记SNP5的上游引物为5’-CGAGATGATGTGATACAGAG-3’、分子标记SNP5的下游引物为5’-CCATTCCAGGATGCCATT-3’、分子标记SNP5的延伸引物为5’-ACTCAAAACTACTGAAAATGCCTC-3’。
6.一种根据权利要求5所述的特异性引物对在制备体外检测与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记的试剂或试剂盒中的应用。
7.一种权利要求1或2所述的与鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记在鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育中的应用。
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