CN107619870A - 能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物分子标记技术领域，是一种能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用，该能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，其位于IFNAR2基因1号染色体的第1外显子处。本发明首次公开了将rs407032027 SNP位点作为能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，首次公开将rs407032027 SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛长度性状的选择中；采用与能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛长度优质性状绵羊品种甄选时，具有操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测的优点。

Description

能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和 应用

技术领域

本发明涉及动物分子标记技术领域，是一种能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，所述分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用。

背景技术

随着国内外毛纺行业不断更新毛料、布艺的加工，对原材料的羊毛要求更加严格，产品趋势已经向轻薄、柔软的方向发展，世界羊毛品质方面也出现了新的里程碑，毛纺行业对羊毛的需求呈逐步递增趋势。而羊毛长度是衡量羊毛品质的关键物理指标之一。目前我国细毛羊生产面临的一个主要问题就是国内细毛羊品种老化，缺少适应当前市场变化需求的新品种。因此寻求一种有效、便捷，并且能够在短时间内加速绵羊育种进程的育种手段便显得尤为重要。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记作为目前最具发展潜力的分子标记，因其在基因组中数量多、分布广，已经广泛应用于动物遗传育种、疾病相关性分析、群体遗传学及药物研究等众多领域。

传统的动物遗传育种均是基于表型的选择，例如，在筛选具有优良羊毛长度性状的绵羊育种时，通过测量该绵羊的羊毛长度来决定其是否属于优质种羊，其期望通过表型的直接选择从而间接实现对有利基因型的选择。然而，羊毛重要经济性状为数量性状，是由微效多基因控制的，并受到环境因素的共同影响，鉴于其表型难以度量，遗传基础复杂，很难通过这种传统育种方式取得显著的成效。随着分子生物学、分子遗传学以及生物信息学的发展，以及最新生物技术在遗传育种的各个领域的应用，通过对与毛用性状密切相关的且与QTL(数量性状基因座)紧密连锁的分子标记的选择和主校基因的筛选，达到育种值得提高和早期选种的目的，从而获得较大的遗传进展。

然而，在羊毛长度性状优良绵羊品种的选育时，需要对成长数月以上的绵羊的羊毛长度进行测量时，通过长度测量结果对绵羊品种进行选育，由上述可知，该羊毛长度检测方法步骤繁琐，检测效率低，准确度有待提高，并且检测对象为成长数月以上的绵羊，由此提高了选育的成本，包括时间成本和其他的选育成本。

发明内容

本发明提供了一种能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，所述分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有选育具有优良羊毛长度性状的绵羊的过程中，其存在选育时间长的问题；本发明首次公开了将rs407032027SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛长度性状的选择中。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，其位于IFNAR2基因1号染色体的第1外显子处，第1外显子的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种用于扩增技术方案之一所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的特异性引物对，包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物以及一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种技术方案之二所述的特异性引物对作为制备体外检测能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用。

下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：

上述中国美利奴羊为新疆型中国美利奴羊。

上述能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用，包括如下步骤：第一步，取待检测新疆型中国美利奴羊的基因组DNA；第二步，以基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，获得新疆型中国美利奴羊的基于rs407032027SNP位点的目的片段，将PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基因分型，当基因型为CC型时，则待测绵羊属于羊毛长度长的新疆型中国美利奴羊品种，当基因型为TC型或TT型时，待测绵羊属于羊毛长度短于CC基因型绵羊羊毛长度的新疆型中国美利奴羊品种；

其中，特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

本发明首次公开了将rs407032027SNP位点作为能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，首次公开将rs407032027SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛长度性状的选择中；采用与能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛长度优质性状绵羊品种进行甄选时，具有操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测的优点。使用本发明的分子标记进行绵羊羊毛长度的选择育种将加快绵羊羊毛的长度性状的遗传选育进程，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速绵羊的育种进程。

附图说明

附图1为DNA混池测序结果图；基因型为CC型。

附图2为DNA混池测序结果图；基因型为TC型。

附图3为DNA混池测序结果图；基因型为TT型。

附图4为Fluidigm测序分型图结果图：分别为CC型、TC型和TT型；其中，横坐标为FAM的荧光信号，纵坐标为HEX的荧光信号。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，其位于IFNAR2基因1号染色体(120571805)的第1外显子处。

实施例2：该用于扩增上述实施例所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的特异性引物对，包括两个等位基因特异性引物(ASP1/ASP2)、一个基因座特异性引物(LSP)和一个特异性靶向扩增引物(STA)，一个等位基因特异性引物(ASP1)的序列如序列表SEQ ID No.2所示，另一个等位基因特异性引物(ASP2)的序列如序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

实施例3：实施例2所述的特异性引物对作为制备体外检测能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

实施例4：上述实施例所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用。

实施例5：作为实施例4的优化，中国美利奴羊为新疆型中国美利奴羊。新疆型中国美利奴羊即为中国美利奴羊(新疆型)。

实施例6：作为实施例5的优化，能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用，包括如下步骤：第一步，取待检测新疆型中国美利奴羊的基因组DNA；第二步，以基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，获得新疆型中国美利奴羊的基于rs407032027SNP位点的目的片段，将PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基因分型，当基因型为CC型时，则待测绵羊属于羊毛长度长的新疆型中国美利奴羊品种，当基因型为TC型或TT型时，待测绵羊属于羊毛长度短于CC基因型绵羊羊毛长度的新疆型中国美利奴羊品种；

其中，特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

本实施例所述的方法具有操作简单高效，并且由于其从分子标记检测层面着手，因此可实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，从而降低选育成本，加速高品质细毛羊的育种进程。

本发明中，所述序列(SEQ ID No.1至SEQ ID No.8)参考绵羊基因组3.1版本。

实施例7：于新疆巩乃斯种羊场(473只)和拜城种羊场(467只)采集940只周岁健康的细毛羊母羊，品种为中国美利奴羊(新疆型)。颈静脉采血3至5mL，采用含EDTA抗凝冻存，采用常规酚-氯仿抽提法提取血样中基因组DNA。

1 DNA的提取

1.1取800μL的绵羊(中国美利奴羊，新疆型)血样加入灭菌后的2mL离心管中，再加入1000μL的T₁₀E₁₀溶液，上下翻动约10分钟，使红细胞破碎，然后8000r/min低温离心6分钟，使得白细胞沉淀。

1.2弃去上清液，加入800μL的T₁₀E₁溶液上下翻动冲洗沉淀，然后放入低温离心机中8000r/min低温离心6分钟。

1.3弃去上清液，加入500μL的USSTE溶液裂解悬浮，在涡旋机上剧烈震荡5分钟(2000r/min)，再上下翻动10分钟使白细胞破裂。

1.4加入400μL(等体积)的Tris平衡酚，抽打混匀，上下翻动10分钟，然后放入低温离心机中10000r/min离心10分钟。

1.5吸取400μL的上清液加入新的离心管中，再加入400μL(等体积)的氯仿：异戊醇(24:1)，上下摇动5分钟，直到看不到白色的界面，然后放入低温离心机中10000r/min离心10分钟。

1.6吸取300μL的上清液加入新的离心管中，再加入600μL(2倍体积)的冷无水乙醇，上下摇动2分钟，然后放入低温离心机中12000r/min离心10分钟。

1.7弃去上清液，加入500μL的70％乙醇浸洗，上下轻翻动2分钟，然后放入低温离心机中12000r/min离心10分钟，弃去液体。

1.8重复第7步。

1.9弃去上清液，无菌台内室温干燥40-60分钟，待离心管中无任何液体后加入70μL的T₁₀E₁溶液，在涡旋仪上振荡两次后放入4℃冰箱中过夜使其充分溶于液体当中，然后放入-20℃的冰箱长期保存。

2基因组DNA浓度及纯度的检测

所提取的DNA溶液取2μL，使用NanoDrop 2000分光光度仪检测所提DNA的浓度及纯度，DNA的样本浓度需大于50ng/μL，纯度OD260/OD280值在1.6至1.8之间且OD260/OD230在1.8至2.1之间的DNA样本为合格的样本。为了确保DNA样本浓度的准确性，每个样本需要连续测定两次，若两次测定的值相差不大则表明样本合格可以留用，不合格的DNA样本则需要重新提取，直到样本的浓度以及纯度全部达到实验所需要的标准为止。

3基因组DNA完整性的检测

所有提取的DNA样本各取3μL与2μL的6×Loading buffer混匀，加入含有核酸染料的1％的琼脂糖凝胶电泳，以D2000作为Marker标记产物片段大小进行检测，0.5×TBE电泳缓冲液，110V，25分钟，电泳结果在凝胶电泳成像仪中检测。

4 rs407032027SNP位点及基因分型

4.1 rs407032027SNP位点

针对绵羊IFNAR2基因的各个外显子、绵羊IFNAR2基因上游1000bp的调控区以及绵羊IFNAR2基因下游1000bp的调控区设计若干引物对，分别对各个绵羊群体中的每个个体进行PCR扩增并测序，发掘SNP位点并对SNP位点与细毛羊羊毛长度性状进行关联分析。

通过上述大量试验，得到特异引物对如下：

F(序列如序列表SEQ ID No.6所示)：5’-ttgctcccct actcgtaccc-3’；

R(序列如序列表SEQ ID No.7所示)：5’-ggcggattct tcaccacctg-3’。

在940只中国美利奴羊(新疆型)试验群体中，选取其中30个个体的血液DNA样本，以相同浓度组成混池DNA，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。对测序峰图进行分析，结合细毛羊毛用性状全基因组关联分析，找到一个与细毛羊羊毛长度性状显著相关SNP位点rs407032027，如图1至图3所示。

rs407032027SNP位点位于IFNAR2基因1号染色体(120571805)的第1外显子处。

中国美利奴羊(新疆型)基因组中rs407032027SNP位点周边的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.8所示，该SNP位点由T突变C，发生错义突变。

4.2基因分型

(1)Fluidigm的SNP检测技术步骤

将上述选择的SNP序列(rs407032027)提交给Fluidigm SNP Type Assay Design网站设计合成探针和引物，为SNP设计了四个引物，包括两个等位基因特异性引物和一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ IDNo.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

(2)基因分型检测:

步骤一：准备SNPtype Assay Mixes。将3μL SNPtype Assay ASP1/ASP2和8μLSNPtype Assay LSP预混合并用29μL DNA悬浮液稀释以制备40μL的SNPtype Assay Mixes。

步骤二：准备10X Assays(用于192*24芯片)。每个反应3μL，包含0.6μL的SNPtypeAssay Mixes，1.5μL的2X Assay Loading Reagent和0.9μL ddH2O水。

步骤三：准备Sample Mix(用于192*24芯片)。每个样品3μL，包含1.492μL的Biotium 2X Fast Probe Master Mix，0.149μL的20X SNPtype Sample Loading Reagent，0.05μL的60X SNPtype Reagent，0.018μL的ROX，0.032μL ddH2O水和1.26μL DNA。

步骤四：分装3μL Assay mix和3μL Sample mix到对应的孔中。

PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火45s，72℃延伸15s，共38个循环并收集荧光信号，冷却至20℃30s。

基因分型检测仪器采用Fluidigm BioMark HD基因分析系统，导出原始数据，用“Fluidigm SNP Genotyping Analysis”软件进行基因分型分析。试剂和耗材见表1，分型结果如图4所示，红色为CC型，蓝色为TC型，绿色为TT型。

(3)本发明中的940只中国美利奴羊均为新疆型周岁母羊，共检测到3种基因型，由表2可知，CC型为优势基因型，C等位基因为优势等位基因。χ²检验表明，该SNP位点在群体中处于处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P＜0.05)。

(3)对绵羊基于rs407032027SNP位点T/C单碱基突变的3种基因型与中国美利奴羊(新疆型)试验群体940个个体的羊毛长度进行最小二乘分析。

根据中国美利奴羊(新疆型)实验群体的特点，运用SAS 9.1软件的GLM过程进行基因型与羊毛长度之间的关联分析，关联分析结果见表3。模型如下：Y_ijl＝μ+g_i+c_j+q_l+e_ijl，

其中，Y_ijl为性状的观测值；μ为群体均值；g_i为基因型效应；c_j为场效应；q_l为群别效应；e_ijl为随机残差。

表3中，均值比较时，同行不同大写字母表示差异极显著，即P＜0.01；同行不同小写字母表示差异极显著，即P＜0.05。

羊毛长度(被毛长度)鉴定依据中华人民共和国农业行业标准NY-1-2004《细毛羊鉴定项目、符号、术语》执行。

被毛长度：实测体侧毛长指在羊体左侧横中线偏上，肩胛骨后缘10cm一掌处，打开毛丛，顺毛丛方向测量毛丛自然状态的长度，以cm表示，精确到0.5cm。羊毛生成时间超过或不足12个月的毛长折算为12个月的毛长。可根据各地羊毛长度生长规律校正。

表3结果显示，基于rs407032027SNP位点不同基因型多态性对中国美利奴羊(新疆型)试验群体的羊毛长度有极显著影响，P值为0.010；再对3种基因型间的最小二乘均值进行多重比较，结果表明具有CC基因型群体的羊毛长度极显著高于TC和TT基因型群体(P＜0.01)，CC基因型可以作为绵羊早期分子育种的分子标记。

综上所述，本发明首次公开了将rs407032027SNP位点作为能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，首次公开将rs407032027SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛长度性状的选择中；采用与能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛长度优质性状绵羊品种甄选时，具有操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测的优点。使用本发明的分子标记进行绵羊羊毛长度的选择育种将加快绵羊羊毛的长度性状的遗传选育进程，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速绵羊的育种进程。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

表1试剂和耗材

表2 SNP基因型在所研究群体中的基因频率及等位基因频率

表3基于rs407032027SNP位点不同基因型与羊毛长度的关联分析

序列表

<110>新疆畜牧科学院畜牧研究院 新疆农业大学

<120>能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和应用

<130>

<160>8

<170>

<210> 1

<211>97

<212> DNA

<213> 绵羊

<400> 1

caggcacaac atacgaaata ccaaatacga ggctgatatg cactggaaag aagagaaaca 60

tgttagaaaa gcaaacaata ctttctccag gctcaat 97

<210> 2

<211>31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agaagagaaa catgttagaa aagcaaacaa t 31

<210> 3

<211>30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagagaaac atgttagaaa agcaaacaac 30

<210> 4

<211>27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaacaatca taaattgagc ctggaga 27

<210> 5

<211>21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggctgata tgcactggaa a 21

<210> 6

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgctcccct actcgtaccc 20

<210> 7

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcggattct tcaccacctg 20

<210> 8

<211>97

<212> DNA

<213> 绵羊

<400> 1

aaaagattca aacaaaatgg caacagattt ggagtcagaa atcccatttt ttgacttcta 60

aatggttgct cccctactcg tacccttaca caaaattttg ttaagtcaag aaaatctctt 120

accaggcaca acatacgaaa taccaaatac gaggctgata tgcactggaa agaagagaaa 180

catgttagaa aagcaaacaa taytttctcc aggctcaatt tatgattgtt gctctgagtc 240

tggcattctt ccacatacat gttttaatat tgcactaaga gtttcttgtg ctaaagataa 300

aaggtcaagt aaatggttct gggcttccca ggtggtgaag aatccgcctg ccaatgcagg 360

agacatagga gactcgggtt tg 382

Claims (6)

1.一种能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记，其特征在于其位于IFNAR2基因1号染色体的第1外显子处，第1外显子的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种用于扩增根据权利要求1所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的特异性引物对，其特征在于包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物以及一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

3.一种根据权利要求2所述的特异性引物对作为制备体外检测能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

4.一种根据权利要求1所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用。

5.根据权利要求4所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用，其特征在于中国美利奴羊为新疆型中国美利奴羊。

6.根据权利要求5所述的能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记在预示和鉴定中国美利奴羊羊毛长度性状中的应用，其特征在于包括如下步骤：第一步，取待检测新疆型中国美利奴羊的基因组DNA；第二步，以基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，获得新疆型中国美利奴羊的基于rs407032027SNP位点的目的片段，将PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基因分型，当基因型为CC型时，则待测绵羊属于羊毛长度长的新疆型中国美利奴羊品种，当基因型为TC型或TT型时，待测绵羊属于羊毛长度短于CC基因型绵羊羊毛长度的新疆型中国美利奴羊品种；

其中，特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。