CN103243167A - 与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及其应用。本发明的绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记是SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段。本发明的与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及鉴别羊毛超细型绵羊的方法和相关产品不受待鉴别绵羊的年龄、性别等的限制，可用于绵羊特别是中国美利奴羊的早期选育，甚至在绵羊刚出生时就可以筛选，提高羊毛超细型绵羊育种的选择效率，加快育种进程。

Description

与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及其应用。

背景技术

中国美利奴羊包括以下5个品系：1、军垦型A品系，含澳血75％，特点是体格较大，产毛量高，系毛肉兼用较理想的细毛羊（刘守仁.中国美利奴羊（新疆军垦型）的育成：中国工程院院士刘守仁绵羊育种文集.新疆科学技术出版社，2005）。2、军垦型B品系：合澳血60．25％，波尔华斯13．5％。突出特点是毛长，细度理想，羊毛品质优，胸宽且深，四肢较短，善行走，适合放牧（刘守仁.中国美利奴羊（新疆军垦型）的育成：中国工程院院士刘守仁绵羊育种文集.新疆科学技术出版社，2005）。3、多胎品系：采用军垦型A品系多胎公、母羊本种累代选育和导入湖羊血液，通过严格选择，大量淘汰手段，用系祖建系的方法，育成了中国美利奴羊（新疆军垦型）多胎品系（刘守仁.中国美利奴羊（新疆军垦型）的育成：中国工程院院士刘守仁绵羊育种文集.新疆科学技术出版社，2005）。4、超细品系，中国美利奴超细品系是采用系祖法建系，该品系细度明显优于其他品系（杨永林.中国美利奴超细型细毛羊的特征特性.畜牧兽医技术，2005，（5）:28-29）。5、肉用多胎品系，中国美利奴（新疆军垦型）多胎肉用细毛羊培育是由中国工程院院士刘守仁主持的国家重点科研项目，项目以培育生长发育快、产肉多、肉用品质好、繁殖力强的肉用细毛羊为目标，这对于我国细毛羊业的发展意义深远。在多胎肉用细毛羊的培育过程中，除了重点突出其肉用生产性能外，羊毛品质也是项目研究的一项重要内容，使多胎肉用细毛羊不仅肉用性能好而且羊毛品质也好，更符合市场的要求，提高了养羊生产的经济效益（何其宏,魏荣安,马春萍,等.中国美利奴多胎肉用细毛羊羊毛品质分析.中国草食动物,2004，24(5):52-53.）。哈萨克羊产于新疆，是中国三大粗毛羊品种之一，肉脂兼用,具有较高的肉脂生产性能，被毛比较粗糙，不适合作毛纺原料（刘守仁著.绵羊学,新疆科技卫生出版社，1996，乌鲁木齐）。

角蛋白关联蛋白（KAPs）作为填充物与羊毛中间丝构成骨架交叉连接，是毛主要的组成，约占毛干90%以上。由于在不同的物种和不同的羊毛结构中，特异的表达不同的KAP蛋白，所以羊毛的主要性状是与不同的KAP组成有非常紧密的关系。毛纤维基质主要组成部分的角蛋白关联蛋白，根据氨基酸组成和分子大小通常分为3个主要类群。（1）高甘氨酸-酪氨酸蛋白（KAPs6、7、8）蛋白，甘氨酸和酪氨酸含量为35～60mol%；（2）高硫蛋白（KAPs1.n、2.n、3.n），蛋白中富含含硫蛋白（富含半胱氨酸），半胱氨酸含量低于30mol%；（3）超高硫蛋白（KAPs4、5），半胱氨酸含量高于30mol%。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一个与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及其应用。

本发明所提供的与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记是SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段。

本发明根据上述与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记开发出以下技术方案：

本发明根据上述与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记开发的一种技术方案是鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的方法，包括如下步骤：以待鉴别绵羊的基因组DNA为模板，采用与SEQ ID No.1的第211位上游特异结合的单链DNA为正向引物、与SEQ ID No.1的第246位下游特异结合的单链DNA为反向引物，进行扩增，根据得到的扩增产物按照下述方法确定所述待鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊：

如果所述待鉴别绵羊的扩增产物含有SEQ ID No.1的第211-246位，所述待鉴别绵羊为羊毛超细型绵羊或为候选羊毛超细型绵羊；如果所述待鉴别绵羊的扩增产物不含有SEQ ID No.1的第211-246位，所述待鉴别绵羊为非羊毛超细型绵羊或为候选非羊毛超细型绵羊。

其中，所述SEQ ID No.1的第211位上游不包括所述SEQ ID No.1第211位，所述SEQ ID No.1的第246位下游不包括所述SEQ ID No.1的第246位。

上述方法中，所述扩增为PCR扩增。

上述方法中，所述正向引物只要与SEQ ID No.1的第211位上游特异结合即可，在本发明的实施例中，所述正向引物的序列是5’-CAAGTGACACCTATACTCTC-3’，是SEQ ID No.1的第1-21位；所述反向引物只要与SEQ ID No.1的第246位下游特异结合即可，在本发明的实施例中，所述反向引物为与SEQ ID No.1的第388-407位反向互补的单链DNA，其序列是5′-CATATCAGAAGTCTGTAGTG-3′。

本发明根据上述与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记开发的另一种技术方案是鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的方法，包括如下步骤：以待鉴别绵羊的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1的第1-21位所示的单链DNA为正向引物，以与SEQID No.1的第388-407位反向互补的单链DNA为反向引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，按照下述方法确定所述待鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊：

如果所述待鉴别绵羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中显示为300-500bp之间的两条带，所述待鉴别绵羊为羊毛超细型绵羊或为候选羊毛超细型绵羊,如果所述待鉴别绵羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中显示为300-500bp之间的一条带，所述待鉴别绵羊为非羊毛超细型绵羊或为候选非羊毛超细型绵羊。

上述两种方法中，所述PCR扩增采用的引物退火温度均可为60℃。

在本发明的实施例中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。

在本发明的一个实施例中，所述待鉴别绵羊为中国美利奴羊和/或哈萨克羊。

其中，所述羊毛超细型绵羊是指周岁全身羊毛纤维平均直径为17.5μm以下（包括17.5μm）的绵羊，如周岁全身羊毛纤维平均直径为14μm-17.5μm的绵羊。所述非羊毛超细型绵羊是指周岁全身羊毛纤维平均直径大于17.5μm的绵羊。

本发明根据上述与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记开发的再一种技术方案是用于鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的引物对，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为与SEQ ID No.1的第211位上游特异结合的单链DNA，所述反向引物为与SEQ ID No.1的第246位下游特异结合的单链DNA。

上述引物对中，所述正向引物的序列是SEQ ID No.1的第1-21位，所述反向引物为与SEQ ID No.1的第388-407位反向互补的单链DNA。

本发明根据上述与绵羊羊毛纤维平均直径相关的分子标记开发的再一种技术方案是鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有上述鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的引物对。

本发明根据上述与绵羊羊毛纤维平均直径相关的分子标记开发的再一种技术方案是1）和/或2）用途：

1）上述鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的引物对、试剂或试剂盒在鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊中的应用。

2）上述鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的引物对、试剂或试剂盒在选育羊毛超细型绵羊中的应用。

本发明的与绵羊羊毛纤维平均直径相关的分子标记及鉴别羊毛超细型绵羊的方法和相关产品不受待鉴别绵羊的年龄、性别等的限制，可用于绵羊特别是中国美利奴羊的早期选育，甚至在绵羊刚出生时就可以筛选，提高羊毛超细型绵羊育种的选择效率，加快育种进程。

附图说明

图1为PCR引物对FR对绵羊的PCR产物电泳图谱。

从左至右的泳道依次为100bp DNA分子量标准(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：MD109)、EF基因型的中国美利奴羊、EF基因型的中国美利奴羊、EF基因型的中国美利奴羊、EF基因型的中国美利奴羊、EE基因型的中国美利奴羊、EE基因型的中国美利奴羊、EE基因型的哈萨克羊、EE基因型的哈萨克羊。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

哈萨克羊、中国美利奴羊超细品系、中国美利奴羊A品系（军垦型A品系）、中国美利奴羊B品系（军垦型B品系）、中国美利奴羊多胎品系和中国美利奴羊肉用多胎品系样品可从商业途径获得，也可从新疆农垦科学院种羊场获得，以重复本发明实验。

实施例1、利用SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段鉴别或辅助鉴别羊毛超细型绵羊

1、鉴别或辅助鉴别羊毛超细型绵羊的PCR试剂

本实施例的鉴别或辅助鉴别羊毛超细型绵羊的PCR试剂由PCR引物对FR、10×Taq缓冲液，dNTP mix，Taq DNA聚合酶和ddH₂O组成。

其中，PCR引物对FR由F和R这两条单链DNA组成，其序列如下：

F:5’-CAAGTGACACCTATACTCTC-3’（SEQ ID No.1的第1-21位）；

R:5’-CATATCAGAAGTCTGTAGTG-3’（与SEQ ID No.1的第388-407位反向互补）。

10×Taq缓冲液，dNTP mix和Taq DNA聚合酶均购自天根生化科技(北京)有限公司(货号分别为：CD117与ET109)。

2、鉴别或辅助鉴别羊毛超细型绵羊

取237只中国美利奴羊样本，其中，中国美利奴羊超细品系50只，中国美利奴羊A品系50只，中国美利奴羊B品系49只，中国美利奴羊多胎品系40只，中国美利奴羊肉用多胎品系样品48只。108只哈萨克羊。每只绵羊采用颈静脉采血，ACD抗凝，-20℃冻存。

每只绵羊均采用如下PCR体系和如下PCR条件，分别以每只绵羊因组DNA为模板，利用步骤1的鉴别或辅助鉴别羊毛超细型绵羊的PCR试剂进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示：

表1、20μL的PCR反应体系

PCR反应温度程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

将每只绵羊的PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像，结果表明所检测的237只中国美利奴羊中有216只的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中均显示为300-500bp之间的一条带，将该条带对应的基因型定义为EE型；所检测的237只中国美利奴羊中其余21只的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中均显示为300-500bp之间的两条带，将该条带对应的基因型定义为EF型；所检测的108只哈萨克羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中均显示为300-500bp之间的一条带，所检测的108只哈萨克羊均为EE型。图1显示了部分绵羊的EE基因型和EF基因型的PCR扩增产物电泳结果。中国美利奴羊和哈萨克羊中的基因频率和基因型频率如表2所示，PCR产物出现两种带型（EE、EF），但两品种均未出现FF型。且出现杂合型均出现在中国美利奴超细型羊（EE=216，EF=21，FF=0），经卡方检测p>0.05，所检测群体符合哈珀温伯格定律。

表2.中国美利奴羊和哈萨克羊中的基因频率和基因型频率

分别回收每只绵羊的PCR产物，进行测序，结果表明所有的21只EF型中国美利奴羊的PCR产物中均含有SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的分子标记，所有的216只EE型中国美利奴羊的PCR扩增产物中均不含有SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的分子标记，108只EE型哈萨克羊的PCR产物中均不含有SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的分子标记。

说明EF型为插入SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的杂合子，EE型为完全不插入SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp纯合子，没有发现FF型完全插入SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的纯合基因型。

根据PCR产物按照下述方法确定上述每只绵羊是否为羊毛超细型绵羊：如果待鉴别绵羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中显示为300-500bp之间的两条带，该待鉴别绵羊为候选羊毛超细型绵羊,如果所鉴别绵羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中显示为300-500bp之间的一条带，该待鉴别绵羊为候选非羊毛超细型绵羊。

按照上述方法确定所有的21只EF型中国美利奴羊为候选羊毛超细型绵羊，216只EE型中国美利奴羊为候选非羊毛超细型绵羊，108只EE型哈萨克羊为候选非羊毛超细型绵羊。

2、利用SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段鉴别或辅助鉴别羊毛超细型绵羊的准确性

测定所检测的237只中国美利奴和108只哈萨克羊的周岁全身羊毛平均纤维直径，结果表明216只EE型的中国美利奴羊周岁全身羊毛平均纤维直径均在16.00μm-23.65μm之间。其中A品系50只，周岁全身羊毛平均纤维直径均在18.13-19.88μm之间，其平均值±标准差为19.42±1.29μm，均属于非羊毛超细型绵羊。B品系47只，周岁全身羊毛平均纤维直径均在18.07-19.79μm之间，其平均值±标准差为19.39±1.07μm，均属于非羊毛超细型绵羊。多胎品系40只，周岁全身羊毛平均纤维直径均在20.72-23.65μm之间，其平均值±标准差为21.98±4.57μm，均属于非羊毛超细型绵羊。肉用多胎品系47只，周岁全身羊毛平均纤维直径均在18.30-19.85μm之间，其平均值±标准差为19.69±1.25μm，均属于非羊毛超细型绵羊。超细品系32只，周岁全身羊毛平均纤维直径均在16.00μm-18.00μm之间，其平均值±标准差为17.35±0.34μm，其中，27只的周岁全身羊毛平均纤维直径均在17.60μm-18.00μm之间，该27只均属于非羊毛超细型绵羊；其余5只的周岁全身羊毛平均纤维直径均在16.00μm-17.50μm之间，该5只属于超细型绵羊。

21只EF型中国美利奴羊中有18只周岁全身羊毛平均纤维直径均在14μm-17.5μm之间，其平均值±标准差为16.59±0.17μm，属于超细型绵羊，均来自超细绵羊品系；21只EF型中国美利奴羊中有3只的周岁全身羊毛平均纤维直径分别为18.38μm（来自肉用多胎品系）、18.36μm（来自B品系）和18.47μm（来自B品系），均属于非羊毛超细型绵羊。

哈萨克羊的周岁有髓毛羊毛纤维直径均在24-26μm之间（无髓毛更粗），均属于非羊毛超细型绵羊。

21只EF型中国美利奴羊中虽然有3只来自于非超细型群体，但其周岁全身羊毛平均纤维直径也较本群体平均值高出约5%。由此确定SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp和羊毛纤维直径密切相关，粗毛羊完全不含EF型，中国美利奴羊品系较多，超细品系约占被检EF型的80%，其他3个EF虽不属超细群体，但其细度级别也很接近超系品系，说明SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp和绵羊羊毛细度高度相关。

Claims (10)

1.鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的方法，包括如下步骤：以待鉴别绵羊的基因组DNA为模板，采用与SEQ ID No.1的第211位上游特异结合的单链DNA为正向引物、与SEQ ID No.1的第246位下游特异结合的单链DNA为反向引物，进行扩增，根据得到的扩增产物按照下述方法确定所述待鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊：

如果所述待鉴别绵羊的扩增产物含有SEQ ID No.1的第211-246位，所述待鉴别绵羊为羊毛超细型绵羊或为候选羊毛超细型绵羊；如果所述待鉴别绵羊的扩增产物不含有SEQ ID No.1的第211-246位，所述待鉴别绵羊为非羊毛超细型绵羊或为候选非羊毛超细型绵羊。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增为PCR扩增，和/或

所述正向引物的序列是SEQ ID No.1的第1-21位，所述反向引物为与SEQ ID No.1的第388-407位反向互补的单链DNA。

3.鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的方法，包括如下步骤：以待鉴别绵羊的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1的第1-21位所示的单链DNA为正向引物，以与SEQ ID No.1的第388-407位反向互补的单链DNA为反向引物进行PCR扩增，2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊：

如果所述待鉴别绵羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中显示为300-500bp之间的两条带，所述待鉴别绵羊为羊毛超细型绵羊或为候选羊毛超细型绵羊,如果所述待鉴别绵羊的PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳中显示为300-500bp之间的一条带，所述待鉴别绵羊为非羊毛超细型绵羊或为候选非羊毛超细型绵羊。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的引物退火温度为60℃。

5.用于鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的引物对，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为与SEQ ID No.1的第211位上游特异结合的单链DNA，所述反向引物为与SEQ ID No.1的第246位下游特异结合的单链DNA。

6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述正向引物的序列是SEQ ID No.1的第1-21位，所述反向引物为与SEQ ID No.1的第388-407位反向互补的单链DNA。

7.含有权利要求5或6所述引物对的鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊的试剂或试剂盒。

8.权利要求5或6所述引物对、权利要求7所述的试剂盒的用途，所述用途为1）和/或2）：

1）在鉴别或辅助鉴别绵羊是否为羊毛超细型绵羊中的应用。

2）在选育羊毛超细型绵羊中的应用。

9.SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段。

10.SEQ ID No.1的第211-246位所示的36bp的DNA片段作为绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记中的应用。

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