CN110951890B - 一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法，其特征在于，提取待鉴定中华鳖皮肤组织RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，扩增前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示，若能扩增得到374bp的扩增产物，则为日本品系，若不能得到374bp的扩增产物，则为清溪乌鳖品系。可以作为一种鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系与日本品系的方法。可用于中华鳖的遗传育种中，特别是乌质性状的选育。

Description

一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法。
背景技术
中华鳖(Pelodiscus sinensis)是我国重要的名特优水产养殖品种，具有高蛋白、低脂肪的营养特点，富含多种维生素和微量元素，营养价值高。中华鳖种质资源是其产业发展的源头，中华鳖日本品系(品种登记号:GS03-001-2007)和清溪乌鳖(品种登记号:GS01-003-2008)是经全国水产原种和良种审定委员会认定并经农业部公告的国家水产新品种。这2个中华鳖新品种具有各自独特的外部形态与生产性能特征，既是养殖生产的优良品种，也是中华鳖种质持续改良的宝贵种质资源。其中中华鳖日本品系背甲似青苔，底板似白玉，生长特别快，是目前全国广泛饲养的品种；清溪乌鳖最大特征是独特的乌黑腹部体色，口味、品质和营养价值远胜于普通鳖，富含具有食用价值和药用价值的黑色素，是中华鳖遗传育种研究的优良材料，已成为中华鳖各品系中珍贵的种苗品种，其乌质性状对提升中华鳖养殖效益、促进中华鳖品质改良具有重要的意义。
对于含乌质性状的物种来说，其食用价值主要在于体内丰富的黑色素，乌质性状表型更是市场经济价值提高的关键，也是种质资源改良的目标。目前，对乌鳖黑色素合成的调控研究尚未见报道，乌鳖乌质性状的分子机理有待深入研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法，从而为改善乌质性状育种提供依据。
本发明的技术方案为：一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法，提取待鉴定中华鳖皮肤组织RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，扩增前向引物序列为5′-GGAATTCATGCTCAGACTGATCACA-3′，后向引物序列为5′-GGGATCCCAGCACGGGGGAGAGGGTGG-3′，若能扩增得到374bp的扩增产物，则为日本品系，若不能得到374bp的扩增产物，则为清溪乌鳖品系。
进一步地，PCR扩增的条件为：
扩增体系：5μL含Mg2+的10×HiFi PCR Buffer II、1μL cDNA模板、2μL引物、4μL2.5mM的dNTP、35.5μL ddH2O和0.5μL HiFi Taq DNA Polymerase；
扩增参数为：95℃2min预变性，95℃30s变性、56.5℃30s退火、72℃30s延伸，执行30个循环，75℃5min终延伸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
发明人研究发现，中华鳖中清溪乌鳖品系与日本品系的ASP基因存在差异，提取的RNA经反转录得到cDNA后，采用特异的引物对进行扩增，在日本品系中能扩增得到特异的374bp的片段，而在清溪乌鳖品系中不能得到该片段。因此可以作为一种鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系与日本品系的方法。可用于中华鳖的遗传育种中，特别是乌质性状的选育。
附图说明
图1是本发明制备的中华鳖日本品系和清溪乌鳖ASP-390基因克隆分析结果图；
图2是本发明制备的中华鳖日本品系ASP-374基因克隆分析结果图。
具体实施方式
实施例1
取冻存提取的中华鳖两品系腹部皮肤组织RNA样本进行反转录，取2μg的RNA按TAKARA PrimescriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis Kit说明书进行cDNA反转录。取反转录cDNA作为模板进行ASP基因克隆，使用北京全式金HiFi Taq DNA Polymerase进行PCR扩增。以10倍稀释的cDNA作为模板进行基因克隆，配制50μL反应混合物，依次加入5μL10×HiFi PCR Buffer II(含Mg2+)、1μL cDNA模板、2μL各引物、4μL 2.5mM的dNTP、35.5μL ddH2O和0.5μL HiFi Taq DNA Polymerase。混合均匀后在PCR仪上进行扩增，扩增条件为95℃2min预变性，95℃30s变性、55℃30s(390bp)/56.5℃30s(374bp)退火、72℃30s延伸，执行30个循环，75℃5min终延伸获得扩增产物并进行琼脂糖电泳鉴定。
各基因检测的引物序列如下：
390-F,5′-CGAATTCATGGAAGATAAGAGCCTC-3′(SEQ ID No.3)，
390-R，5′-GGGATCCGCAGTTTCGGTTTCCTACTC-3′(SEQ ID No.4)；
374-F,5′-GGAATTCATGCTCAGACTGATCACA-3′(SEQ ID No.1)，
374-R，5′-GGGATCCCAGCACGGGGGAGAGGGTGG-3′(SEQ ID No.2)(下划线为酶切位点)。基因克隆结果在两品系中均获得片段长度为390bp的全长ASP编码序列(图1)，此外，还在中华鳖日本品系腹部组织cDNA中扩增获得区别于390bp的片段长度为374bp的非全长ASP编码序列(图2)。根据NCBI报道的中华鳖ASP mRNA序列和克隆检测结果，对各序列进行比对分析，日本品系中至少存在两种ASP mRNA表达结构，这与在日本品系腹部皮肤中ASP表达量高于清溪乌鳖(只检测到一种mRNA结构)呈一定的相关性。
由于日本品系相比于清溪乌鳖品系具有上述特异的扩增片段，因此，可以单独SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的引物进行扩增，若能扩增得到374bp的扩增产物，则为日本品系，若不能得到374bp的扩增产物，则为清溪乌鳖品系。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 浙江万里学院
<120> 一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaattcatg ctcagactga tcaca 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggatcccag cacgggggag agggtgg 27
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaattcatg gaagataaga gcctc 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggatccgca gtttcggttt cctactc 27

Claims (2)

1.一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法，其特征在于，提取待鉴定中华鳖皮肤组织RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，扩增前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示，若能扩增得到374bp的扩增产物，则为日本品系，若不能得到374bp的扩增产物，则为清溪乌鳖品系。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定中华鳖中清溪乌鳖品系和日本品系的方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：
扩增体系：5μL含Mg2+的10×HiFi PCR Buffer II、1μL cDNA模板、2μL引物、4μL 2.5mM的dNTP、35.5μL ddH2O和0.5μL HiFi Taq DNA Polymerase；
扩增参数为：95℃2min预变性，95℃30s变性、56.5℃30s退火、72℃30s延伸，执行30个循环，75℃5min终延伸。
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Differentiation of four strains of Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) based on high-resolution melting analysis of single nucleotide polymorphism sites in mitochondrial DNA.;ZHANG, H.Q.等;《Genetics and Molecular Research》;20151031;第14卷(第4期);第13144-13150页 *

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