CN109680075A - 一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法，所述纯化方法适用于肉兔、獭兔、长毛兔、观赏兔等各类比利时毛色家兔的纯化。本发明所述方法为：首先挑选出毛色表型为比利时毛色的家兔；随后使用第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的家兔。本发明所述纯化方法得到基因型AAEECC的家兔为比利时毛色纯合子，剔除了隐性白基因。利用本发明所述纯化方法培育的比利时毛色家兔专门化品系，在保证商品代兔毛色一致的基础上，能够很好地保护育种企业的种质材料。

Description

一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法
技术领域
本发明属于家畜育种技术领域，具体涉及一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法。
背景技术
比利时兔毛色属野生类型，被毛深红带黄褐色或红褐色，整根毛的两端深、中间较浅，质地坚韧，紧贴体表。其头、颈、背、体侧、四肢外侧毛纤维均与野兔毛纤维颜色相似，毛纤维的基部为浅灰色，中段色稍淡，毛尖颜色深，并夹杂有黑色枪毛。下颌、颈下、四肢内侧、腹部、尾之腹面毛色较浅。皮肤除腹部、四肢内侧、颌下为褐黄色外，其他部位为深灰色，毛色光亮。比利时兔毛色有天然光泽，被毛皮张大、皮板柔性和弹性好，备受毛皮市场青睐。
比利时毛色不仅可以作为容易识别的家兔品种特征，而且有特定的经济价值、社会需求和市场偏好。家兔毛色受多个基因控制，这些基因间呈现复杂的显隐性和上位互作关系，生产实践中比利时毛色家兔的遗传背景比较复杂，很少有毛色纯合的种群，利用常规育种方法进行毛色纯化不仅费时费力，而且往往不够彻底。大多数比利时毛色家兔种群中携带隐性白基因，后代常出现白色个体，在利用比利时毛色家兔品系与白兔品系杂交生产中，这一问题尤为突出。在家兔纯繁和杂交生产中，由于我们无法控制家兔繁殖过程中的毛色基因分离和重组，因此要获得毛色一致的后代，必须通过对毛色基因型的育种设计，事先选育出特定基因型的纯合子亲本种群。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法。本发明所述方法为：首先挑选出毛色表型为比利时毛色的家兔；随后使用第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的比利时毛色兔。
本发明所采用的技术方案为：
本发明中，使用到的基因包括ASIP基因、MC1R基因和TYR基因。
ASIP基因，即通常所说的Agouti基因，中文为“刺豚鼠毛色基因”或“鼠灰色基因”，其结构复杂，不是单一位点，而是一个含有许多等位基因的位点，由4个外显子和3个内含子组成。外显子2、3和4为编码序列，外显子1为非编码序列。ASIP基因编码一种旁分泌信号分子，即Agouti信号蛋白(ASIP)，使毛囊黑色素细胞合成棕黑素。此外ASIP基因还编码一种Agouti基因相关蛋白，与ASIP共同调节毛色。
黑素皮质素受体1(melanocortin 1-receptor，MC1R)基因在控制黑色素形成过程中起重要作用，MC1R为G蛋白耦合的受体黑色素皮质素受体家族之一，是其家族成员中最小的一个受体，编码蛋白主要作用于黑色素细胞，与a-MSH(alpha melnocyte stimulatinghormone receptor)结合提高环腺苷酸水平，形成真黑色素。家兔不同的MC1R基因型对应不同的毛色。
ASIP和MC1R是哺乳动物体内调控毛色的两个重要候选基因，ASIP的表达会引起褐黑素的产生，MC1R的表达会引起真黑素的产生，通过调节真黑素和褐黑素的比例来影响毛色。
酪氨酸酶(TYR)基因位于常染色体上，正常的TYR基因控制的性状是有色毛，当TYR基因中第1119位点的碱基由“C”突变为“A”时，为隐性白基因型。
根据本发明的用于纯合比利时毛色兔的引物组，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述第三引物组的正向引物为5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物为5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’。
一种基于分子辅助选择的比利时毛色兔纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)提取待鉴定家兔的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；
(2)根据步骤(1)得到的所述扩增产物，鉴别待鉴定家兔的基因型，筛选得到表型为比利时毛色的纯合型家兔。
进一步的，步骤(1)中，所述待鉴定家兔为肉兔、獭兔、长毛兔或观赏兔等类型中的任一种。
进一步的，步骤(1)中，所述待鉴定家兔毛色表型为比利时毛色。
进一步的，步骤(1)中，所述第一引物组的正向引物为5’-AAGAAAGCAGGAAGGCACA-3’，反向引物为5’-CAAGGCAGGATTGGCTCA-3’
进一步的，步骤(1)中，所述第二引物组的正向引物为5’-ACCTGCTGGTGAGCGTGA-3’，反向引物为5’-GTAGCGCAGTGCGTAGAAGA-3’。
进一步的，步骤(1)中，所述第三引物组的正向引物为5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物为5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’。
进一步的，步骤(1)中，使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
进一步的，步骤(1)中，使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5mM、TWEEN-20 0.05％、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0U和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
进一步的，步骤(1)中，使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
进一步的，步骤(1)中，使用苯酚-氯仿抽提法或CTAB法提取待鉴定家兔的基因组DNA。
进一步的，步骤(2)中，鉴别的方法为：对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测ASIP基因第二外显子的第5位点和第6位点间插入碱基“A”时，记为a基因型，未插入碱基“A”时，记为A基因型；
对使用所述第二引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第280-285位点的碱基无缺失且304-333位点的碱基缺失30bp，为E基因型；
对使用所述第三引物组得到的扩增产物进行测序，检测TYR基因第四外显子的第1119位点的碱基类型，当碱基为“C”时，未发生基因突变，记为C基因型，当碱基为“A”时，发生基因突变，记为c基因型。
进一步的，步骤(2)中，筛选得到基因型为AACCEE的纯合比利时兔毛色兔在育种中的应用。
使用上述引物组和鉴别方法，能够同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的纯合比利时毛色兔。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法，所述纯化方法适用于肉兔、獭兔、长毛兔、观赏兔等多品种比利时毛色的纯化。本发明所述方法为：首先挑选出毛色表型为比利时毛色的家兔；随后使用第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的家兔。本发明所述纯化方法所得家兔为纯合子，同时剔除了隐性白基因，同时实现显性比利时毛色基因纯合和隐性白基因净化的双保险。利用本发明所述纯化方法培育的比利时毛色家兔品系，与白色家兔品系配种时既可以保证子代不会出现白个体，又可以保证家兔表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的种质材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中ASIP基因扩增片段图谱；
图2是实施例1中MC1R基因序列检测图；
图3是实施例1中TYR基因扩增片段图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
一种基于分子辅助选择的比利时毛色兔纯化方法，包括以下步骤：
1、提取比利时毛色肉兔的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；
本实例的引物设计如表1所示；
表1.引物组序列图
使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5mM、TWEEN-20 0.05％、dNTPs0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
2、根据步骤(1)得到的扩增产物，鉴别比利时毛色肉兔的基因型，筛选得到纯合比利时毛色兔，具体筛选方式如下：
对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测ASIP基因第二外显子的第5位点和第6位点间插入碱基“A”时，为a基因型，未插入碱基“A”时，为A基因型；对使用所述第二引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第280-285位点的碱基无缺失，304-333位点的碱基缺失30bp，记为E基因型；对使用所述第三引物组得到的扩增产物进行测序，检测TYR基因第四外显子的第1119位点的碱基类型，当碱基为“C”时，说明未发生突变，记为C基因型，当碱基为“A”时，说明发生突变，记为c基因型。
3、筛选得到纯合比利时毛色肉兔后，建立纯合纯合比利时毛色肉兔基础群。
使用上述引物组和鉴别方法，能够同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的家兔。利用基因型为AAEECC的公兔和母兔配种即可建立纯合比利时毛色家兔种群。相应地淘汰基因型分别为Aa、Ee的比利时毛色杂合子和基因型为Cc、cc的携带隐性白基因个体，即可实现对比利时毛色家兔的纯化。本发明所述纯化方法所得家兔为纯合子，同时剔除了隐性白基因，与其他品系配种时既可以保证子代不会出现白色个体，又可以保证家兔表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的育种素材。
所述第一引物组用于扩增ASIP基因片段，如图1箭头所指的位点所示，能够明显看出标记处有波峰的交叠，说明此处的位点存在多种碱基，此处有基因突变，突变基因型为a。
所述第二引物组用于扩增MC1R基因片段，如图2所示，MC1R基因的第280-285位点的碱基无缺失，304-333位点的碱基缺失30bp，为E基因型。需要说明的是，测序是测的MC1R基因的序列，进而查看MC1R基因的第280-285位点的碱基和第304-333位点的碱基是否缺失，而不是扩增产物的第280-285位点的碱基和第304-333位点的碱基(扩增产物的长度为620bp)。
所述第三引物组用于检测TYR基因第1119位点的碱基类型，如图3箭头所指的位点所示，能够明显看出标记处有波峰的交叠，说明此处的位点存在多种碱基，此处有基因突变，突变基因型为c。
实施例2
实施例2与实施例1的差别仅在于选取的家兔品种不同，本实施例选取比利时色长毛兔作为实施对象，其他操作均相同。
实施例3
实施例3与实施例1的差别仅在于选取的家兔品种不同，本实施例选取比利时色獭兔作为实施对象，其他操作均相同。
实施例4
本实施例首先按照实施例1的相同操作获得纯合的比利时毛色肉兔种群，然后作为杂交亲本或者作为育种材料培育专门化品系，与白色肉兔亲本进行经济杂交或配套系杂交，可获得毛色一致的比利时毛色肉兔后代。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagacaaggt gaaagg 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taaatccaat aggcac 16

Claims (10)

1.一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)提取待鉴定家兔的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；
(2)根据步骤(1)得到的所述扩增产物，鉴别待鉴定家兔的基因型，筛选得到表型为比利时毛色的纯合型家兔。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待鉴定家兔为肉兔、獭兔、长毛兔或观赏兔等类型中的任一种。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待鉴定家兔毛色表型为比利时毛色。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一引物组的正向引物为5’-AAGAAAGCAGGAAGGCACA-3’，反向引物为5’-CAAGGCAGGATTGGCTCA-3’；
所述第二引物组的正向引物为5’-ACCTGCTGGTGAGCGTGA-3’，反向引物为5’-GTAGCGCAGTGCGTAGAAGA-3’；
所述第三引物组的正向引物为5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物为5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5mM、TWEEN-20 0.05％、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0U和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，鉴别的方法为：对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测ASIP基因第二外显子的第5位点和第6位点间插入碱基“A”时，记为a基因型，未插入碱基“A”时，记为A基因型；
对使用所述第二引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第280-285位点的碱基无缺失且304-333位点的碱基缺失30bp，记为E基因型；
对使用所述第三引物组得到的扩增产物进行测序，检测TYR基因第四外显子的第1119位点的碱基类型，当碱基为“C”时，未发生基因突变，记为C基因型，当碱基为“A”时，发生基因突变，记为c基因型。
9.根据权利要求1-9所述的纯化方法，其特征在于，筛选得到的纯合比利时毛色家兔基因型为AAEECC。
10.根据权利要求1-9所述的纯化方法，其特征在于，筛选得到的纯合比利时毛色家兔在育种中的应用。
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