CN111705146A - 一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记及其应用，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的分子标记来源于鸭21号染色体，该序列的上存在与鸭黄麻羽性状相关的SNP位点，该SNP位点位于该序列的428位，碱基为A>G。同时提供了扩增所述分子标记的引物，如SEQ ID NO.2～3所示。本发明分子标记和引物可用于鉴别纯合黄麻羽性状种鸭的基因型。从而为黄麻羽鸭个体基因型鉴定提供一种简单、快速、准确的方法。

Description

一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记及其应用。
背景技术
麻羽肉鸭具有肉质好、抗逆能力强等特点，具有广阔的市场前景。近些年，国内很多科研单位、企业利用麻羽肉鸭地方品种资源，开展优质麻羽肉鸭的育种研究和实践。禽类羽色类型丰富，且遗传机制非常复杂，不同羽色类型个体间杂交，后代羽色发生性状分离，且很难通过常规的表型选育将目标羽色性状固定下来。准确、高效的羽色选种方法，是麻羽肉鸭育种亟待解决的关键问题之一。
申请人分离到一种较为特别的羽色类型，其雏鸭全身被覆较多黄色绒羽，仅在头部、背部以及尾部有小部分着色明显的区域，成年后体表有较大面积着色较浅的区域，片羽为浅色麻羽，称之为“黄麻羽”性状。这种羽色素材在肉鸭育种中具有较高的应用价值。首先，与地方麻羽肉鸭品种相比，其体表黑色素沉积更少，胴体更加美观干净。其次，通过“黄麻羽”特征容易与其他类型麻羽肉鸭相区分开，可以作为品种的“特征标签”，方便消费者辨别。
在黄麻羽鸭纯繁后代中，会分离出“黄麻羽”、“四点花”和及少量“全黑”特征羽色类型。通过持续选择“黄麻羽”性状，后代黄麻羽个体比例逐渐升高，而“四点花”羽色个体比例逐渐下降，说明黄麻羽对四点花为显性。虽然可以通过羽色表型选择，在后代不断提升后代黄麻羽个体比例，但始终难以将纯合的黄麻羽个体筛选出来，来组建成新的品系，进而保证黄麻羽特征稳定遗传。此外，雏鸭到成年阶段，要经过四次换羽，羽色表型才能最终稳定下来。因此，在麻羽肉鸭育种中，育种技术人员需要在鸭成年羽色稳定后，才能对黄麻羽性状做出选择。在鸭成年后选种，虽然可以取得一定成效，但比较费时和费成本。因此，迫切的需要一种能从分子水平上鉴定黄麻羽鸭基因型的分子标记及方法，依据基因型信息，对黄麻鸭个体进行精准选留，增加选种效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与黄麻羽鸭羽色表型紧密关联的分子标记，并设计用于扩增该分子标记位点的PCR引物，利用常规PCR技术获得目标区域产物，经过核酸测序后，根据测序结果序列峰图判定待检测个体的基因型信息(纯合、杂合)，从而为黄麻羽鸭个体基因型鉴定提供一种简单、快速、准确的方法。
本发明技术目的具体通过以下技术方案实现：
一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的分子标记来源于鸭21号染色体，该序列的上存在与鸭黄麻羽性状相关的SNP位点，该SNP位点位于该序列的428位，碱基为A>G。
本发明还提供了用于扩增上述分子标记的引物，所述的引物为：
上游引物：CTTCAGTCCCTCTTTTCTGTCTA；
下游引物：GCTTTGGTTCAGGCTTGTGT。
在本发明的另一方面，提供了一种用于鉴定鸭黄麻羽基因型的方法，包括以下步骤：
1)提取待测个体生物检材中的基因组DNA；
2)以提取基因组DNA为模板，进行PCR反应并测序；
3)利用生物信息软件将测序峰图打开，根据峰图判定待测个体在该位点的基因型。
所述的生物检材为血样、皮肤样品或毛囊样品。
所述的PCR引物为：
上游引物：CTTCAGTCCCTCTTTTCTGTCTA；
下游引物：GCTTTGGTTCAGGCTTGTGT。
所述的PCR反应体系为20uL，包括上下游引物各0.5uL、模板DNA 2uL、dNTP 1.5uL、taqDNA聚合酶1uL、灭菌去离子水12.5uL、10×solution buffer 2uL。
所述的PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；12℃保存反应产物。
本发明纯合黄麻羽个体基因型为A/A；杂合黄麻羽个体基因型为A/G；纯合四点花个体基因型为G/G。
在本发明的另一方面，还提供了上述分子标记或引物在筛选黄麻羽性状种鸭选育中的应用。
本发明的有益效果为：
在黄麻羽肉鸭新品种或新品系的培育过程中，利用本发明的方法，仅需要一个世代的检测，就可以使育种群在目标羽色性状(黄麻羽)上达到100％纯合，避免后代再次产生羽色性状分离，提升育种效率。
禽类羽毛在成年前，要经过四次换羽，依据传统的表型选择方法，要等到鸭成年羽色特征稳定后才能开始选择，耗时又费成本。在黄麻羽选育中，利用本发明的方法，可以雏鸭阶段快速准确的鉴别基因型的方法，从而进行早期剔除，减少鸭群饲养数量，降低育种成本，缩短育种周期。
附图说明
图1是本发明鸭黄麻羽性状的基因组扫描；A，黄麻鸭和四点花鸭全基因组分化扫描结果；B，黄麻鸭和四点花鸭chr21染色体分化扫描结果；C，黄麻鸭和四点花鸭chr21染色体局部分化区域展示；
图2是本发明鸭黄麻羽及四点花个体基因型鉴定。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
从鸭翅下静脉采集血样，其中黄麻羽鸭和四点花鸭各20个体。获得的血样采用苯酚-氯仿法提取DNA。采用纳米粒电泳和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和数量。使用标准过程为每个合格DNA样本建成cDNA文库。所有文库均在
Figure BDA0002617861270000051
Hiseq X-Ten平台上进行测序，平均原始读取序列覆盖率为5×，采用双端测序，读长150bp(PE150)。
使用带有默认参数的NGS QC(v2.3.3)工具包过滤原始读取数据。使用默认参数，使用Burrows-Wheeler alignment(BWA aln)将clean reads分别mapping到鸭参考基因组(IASCAAS_PekingDuck_PBH1.5，GCF_003850225.1)。使用GATK(版本3.5)收集全基因组范围的单核苷酸突变位点(SNP)信息，输出的SNP使用VCFtools(版本0.1.15)进一步过滤，设置参数为最小等位基因频率(MAF)>0.05、最大等位基因频率<0.99、最大缺失率<0.1。所有筛选的SNP均匀分布在鸭29条常染色体、Chr Z、Chr W和Chr U(未贴壁支架)上。
基于上述方法，发现在鸭21号染色体上存在一个约300kb分化区间(Chr21:2,130,001-2,430,000)。该范围内包含11个基因(图1)
对候选区域一段长度约为1300bp区域(Chr21：2,304,272-2,305,596)有多个在“黄麻”与“四点花”群体中显著分化的突变。针对这一区间设计一对引物进行扩增与基因型检测(引物信息与序列见发明内容部分)。结果发现该段序列的428bp有一个A>G的突变与四点花表型极显著关联(图2)。
实施例2
本研究分别分离了黄麻羽鸭、四点花鸭83个体和41个体血样。通过提取了待测个体生物检材中的基因组DNA；并以提取基因组DNA为模板，进行PCR反应并测序；PCR反应体系为20uL，包括上下游引物各0.5uL、模板DNA 2uL、dNTP 1.5uL、taqDNA聚合酶1uL、灭菌去离子水12.5uL、10×solution buffer 2uL。PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；12℃保存反应产物。
利用生物信息软件将测序峰图打开，根据峰图判定待测个体在该位点的基因型(表1)。通过分析发现，该位点可以将黄麻鸭和四点花较好的分开(P＝3.7×10-19)，同时该位点也能将黄麻羽鸭中杂合基因型和纯合基因型个体分开。
表1利用本发明专利测鸭黄麻羽个体基因型信息
Figure BDA0002617861270000061
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaatcagca cagtgcaaaa ctgcatctag ctttaactgg tgtgagccca aggagaggtg 60
ctgcaaggac ttttctgtga ggaggaacca tcccttcttc tgccccatcc cactgagcaa 120
ctcacccttt gtaggcgtat cagaagtctg caatgagtca ggaagctgtc ttccacactc 180
tgcaggaacc tcctaggctg cttcctcagg gctgtgttgc atttccagca cacgtctggg 240
aagttgaagt cccccatgag aacaagcact ggcgattgag cgacttccac caggtgctta 300
cagaacgcct cttctgcctc ttcattgtag tttggcagtc tattacagac ccccaccagg 360
atgtctgcct tgttggccaa cccctgatcc ttaaccacag ggactctacc ttgtcattcc 420
caaccccaag ctcaacaaca tcaaaacact ctctaatata gaaccatgtc acctccctcc 480
taagttgcct gtcccttctg aggagcttgt aaccatccat cgcagcacac cagttgtggg 540
agcggtccca ccgcatttca ttgatggtga ctaggtcata gtttaactac cacacaacag 600
cttccagctt ctcccgtttg ttgcccatac ggtgtgcatt ggtgtagatg catttcagtt 660
gcaccattgc cctcaccccc aaaccctgtg aatgctcccc cagtctaacc tctcttgagc 720
ctcatttcat ccctttcccc cttcctactt gatttaaagc cctctcagtg ggtcttgaca 780
gcacctgggc tgggatctgt tttccccttt gagaca 816
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaatcagca cagtgcaaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtctcaaag gggaaaacag a 21

Claims (8)

1.一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，所述的引物如SEQ IDNO.2～3所示。
3.一种用于鉴定鸭黄麻羽基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测个体生物检材中的基因组DNA；
2)以提取基因组DNA为模板，进行PCR反应并测序；
3)利用生物信息软件将测序峰图打开，根据峰图判定待测个体在该位点的基因型。
4.根据权利要求3所述的一种用于鉴定鸭黄麻羽基因型的方法，其特征在于，所述的PCR引物如SEQ ID NO.2～3所示。
5.根据权利要求3所述的一种用于鉴定鸭黄麻羽基因型的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为20uL，包括上下游引物各0.5uL、模板DNA2 uL、dNTP 1.5uL、taqDNA聚合酶1uL、灭菌去离子水12.5uL、10×solutionbuffer 2uL。
6.根据权利要求3所述的一种用于鉴定鸭黄麻羽基因型的方法，其特征在于，所述的PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；12℃保存反应产物。
7.根据权利要求3所述的一种用于鉴定鸭黄麻羽基因型的方法，其特征在于，纯合黄麻羽个体基因型为A/A；杂合黄麻羽个体基因型为A/G；纯合四点花个体基因型为G/G。
8.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物在筛选黄麻羽性状种鸭选育中的应用。
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