CN108250285B

CN108250285B - 一种与大口黑鲈快速生长相关的单倍型标记及其应用

Info

Publication number: CN108250285B
Application number: CN201810069432.6A
Authority: CN
Inventors: 李胜杰; 白俊杰; 赵荦; 樊佳佳; 姜鹏; 孙建国; 吴建开
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: CN108250285A

Abstract

本发明公开了一种与大口黑鲈快速生长相关的单倍型标记及其应用，所述单倍型标记由位于大口黑鲈热激蛋白HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位和2346位的SNP位点，以及第259位和2302碱基处的插入缺失突变位点组成，这4个位点完全连锁。利用本发明单倍型标记，在生产中保留第1313、259、2302、2346位的基因型分别为GA、T‑、Y‑、AT的大口黑鲈亲本(Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC)，去除其他基因型的个体，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种。

Description

一种与大口黑鲈快速生长相关的单倍型标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与大口黑鲈快速生长相关的单倍型标记及其应用。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides L.)，又称加州鲈，原产于北美洲，具有适应性强、生长快、病害少、耐低温、生长周期短以及味道鲜美等优点，是重要的淡水养殖鱼类之一。1983年从台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。但是，引种30多年来，由于生产单位不注重亲本留种须遵守的操作规程，也没能定期从原产地补充和引进亲本，导致养殖大口黑鲈遗传多样性降低，从而使生产性能降低，主要表现在生长速度下降、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降。其中，生长速度关系到大口黑鲈产量的高低，养殖效益的大小。大口黑鲈生长退化的趋势直接制约着大口黑鲈养殖业的发展。因此，改良大口黑鲈生长速度的工作非常重要。

传统提高养殖鱼类生长速度的主要方法是挑选优良性状的亲鱼，挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本，即根据表型来决定亲鱼是否留种。这种方法方便、快捷、简单，但受人为因素影响很大，加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大。如此可见，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。通过发现与大口黑鲈快速生长有关的基因，大大提高快长亲本的筛选效果。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种与大口黑鲈快速生长相关的单倍型标记及其应用，该分子标记可作为大口黑鲈生长性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选育效率和准确性。

本发明的另一个目的在于提供一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法。

本发明所采取的技术方案是：

大口黑鲈HSP70的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

大口黑鲈HSP70的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，其中第993位R为碱基G或A。

大口黑鲈HSP70的基因序列如SEQ ID NO：3所示，其中第1313位R为碱基G或A，第259位K为碱基T或者为碱基缺失，第2302位S为碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC或者为碱基片段缺失，第2346位W为碱基A或T。

大口黑鲈生长速度相关的SNP位点或插入缺失突变位点，所述SNP位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第1313位和第2346位，所述插入缺失突变位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第259位和第2302位。

上述所述SNP位点或插入缺失突变位点在判断大口黑鲈生长快慢中的应用。

上述所述SNP位点或插入缺失突变位点在筛选快速生长大口黑鲈中的应用。

一种筛选快速生长大口黑鲈的方法，

检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位碱基处的SNP位点是否为GA基因型，若是，则为快速生长的大口黑鲈；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第259位是否为T-基因型，其中“-”表示碱基缺失，若是，则为快速生长的大口黑鲈；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第2302位是否为Y-基因型，其中Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC，“-”表示碱基片段缺失，若是，则为快速生长的大口黑鲈；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第2346位碱基处的SNP位点是否为AT基因型，若是，则为快速生长的大口黑鲈。

进一步的，上述所述的方法，包括如下步骤：

1)提取大口黑鲈DNA；

2)以提取得到的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位、第259位、第2302位或/和第2346位的基因型是否分别为GA、T-、Y-、AT基因型其中“-”表示碱基缺失，Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC。

进一步的，在步骤2)中，当检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位碱基处的SNP位点是否为GA基因型时，所用到的PCR检测具体操作为：

用引物P1和P2对大口黑鲈DNA进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，

P1：5'-CGTCGACTTCTACACCTCCA-3'(SEQ ID NO：4)；

P2：5'-TCGTCTGGGTTGATGCTCTT-3'(SEQ ID NO：5)；

再将初次PCR产物用引物P3进行延伸扩增，将所得产物经测序分析，确定大口黑鲈HSP70基因序列第1313位碱基处的SNP位点是为GA基因型；

P3：5'-CCAGGACGACGTCGTGGATCTG-3'(SEQ ID NO：6)。

进一步的，所述初次PCR扩增的反应体系为：

初次PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火15s，60℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。

本发明的有益效果是：

(1)本发明大大降低了大口黑鲈亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈个体。

(2)本发明快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法既保证了检测结果的可靠性，无需繁琐操作进行测序分析，提高了处理效率和精确性，建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

具体实施方式

大口黑鲈HSP70的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

大口黑鲈HSP70的基因序列如SEQ ID NO：3所示，其中第1313位R为碱基G或A，第259位K为碱基T或者为碱基缺失，第2302位S为碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC(SEQ IDNO：7)或者为碱基片段缺失，第2346位W为碱基A或T。

大口黑鲈生长速度相关的单倍型标记，所述单倍型标记包括SNP位点、插入缺失突变位点，所述SNP位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第1313位第2346位，所述插入缺失突变位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第259位和第2302位。

一种筛选快速生长大口黑鲈的方法，

优选的，上述所述的方法，包括如下步骤：

1)提取大口黑鲈DNA；

优选的，在步骤2)中，当检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位碱基处的SNP位点是否为GA基因型时，所用到的PCR检测具体操作为：

P1：5'-CGTCGACTTCTACACCTCCA-3'(SEQ ID NO：4)；

P2：5'-TCGTCTGGGTTGATGCTCTT-3'(SEQ ID NO：5)；

P3：5'-CCAGGACGACGTCGTGGATCTG-3'(SEQ ID NO：6)。

优选的，初次PCR扩增的反应体系为：

优选的，延伸扩增的反应体系为：

延伸扩增反应程序为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30个循环。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1与大口黑鲈生长性状相关的SNP标记的获得

本申请研究发现，在大口黑鲈HSP70基因(heat shock protein 70)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，其中第993位为碱基G或A；其基因序列如SEQ ID NO：3所示，由编码区和非编码区组成，其中第1313位R为碱基G或A，存在2种基因型GA和AA；第259位K为碱基T或者为碱基缺失，存在2种基因型T-和--(其中“-”表示碱基缺失)；第2302位S为碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC(简称为Y片段)或者为碱基片段缺失，即存在2种基因型Y-和--(其中“-”表示碱基缺失)；第2346位W为碱基A或T，存在2种基因型AT和AA。

本实验用于关联分析的样本数为430尾的随机群体为同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。大口黑鲈HSP70基因第1313位处不同基因型在随机群体中频率分布见表1。

本研究还发现大口黑鲈HSP70基因组序列的2346位碱基处的SNP、第259和第2302位碱基处的插入缺失突变位点与第1313位的SNP完全连锁，即当第1313个碱基处的基因型为GA时，第259位、第2302位、第2346位的基因型分别为T-、Y-、AT(“-”表示碱基缺失，Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC)；当第1313个碱基处的基因型为AA时，第259位、第2302位、第2346位的基因型分别为--、--、AA(“-”表示碱基缺失)。

表1 大口黑鲈HSP70基因第1313位SNP不同基因型在随机群体中频率分布

单倍型标记与性状的关联分析

大口黑鲈HSP70基因第1313位(或第259位、或第2302位、或第2346位)处不同基因型个体间生长性状的多重比较结果见表2。第1313位的GA基因型个体测量的5个生长性状(体质量、全长、头长、体高、尾柄长)的平均表型值高于AA型个体的均值，其中GA基因型个体与AA基因型个体在体质量和全长上存在显著差异(P＜0.05)。第1313位的GA基因型个体测量的5个生长性状(体质量、全长、头长、体高、尾柄长)的平均表型值均高于AA型个体的均值。

上述关联分析结果表明，本发明大口黑鲈HSP70基因组SEQ ID NO：3的第1313位的SNP位点(或第259位插入缺失突变位点、或第2302位插入缺失突变位点、或第2346位SNP位点)所构成的基因型对体质量和全长性状有显著影响(P<0.05)，基因型为GA的个体的生长性状明显优于其他基因型的个体。

表2 不同基因型个体间生长性状的多重比较

注：表中数值为平均值±标准误差，同一行上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

从以上数据可知，HSP70基因序列(SEQ ID NO：3)的第1313位碱基和第2346位碱基的SNP位点，以及第259位和第2302位插入缺失突变位点与大口黑鲈生长性状密切相关。通过检测大口黑鲈HSP70基因序列(SEQ ID NO：3)的第1313位、第259位、第2346位、第2302位是否为GA、T-、AT、Y-基因型的单倍型标记(Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC，“-”表示碱基缺失)，即可快速、准确地筛选出所需要的快速生长的大口黑鲈亲本。

实施例2一种筛选快速生长大口黑鲈的方法

利用上述的SNP位点对快速生长大口黑鲈亲本进行筛选，包括如下步骤：

(一)引物序列：

根据大口黑鲈热激蛋白HSP70基因序列设计了一对引物进行PCR扩增，设计并合成的引物如下：

P1：5'-CGTCGACTTCTACACCTCCA-3'(SEQ ID NO:4)

P2：5'-TCGTCTGGGTTGATGCTCTT-3'(SEQ ID NO:5)

引物预期扩增1条DNA带，大小231bp。

(二)样品处理(碱裂解法)：

1、剪取待检测鳍条10-20mg，装入干净的EP管中；

2、加入180μL的50mmol/L NaOH溶液，水浴20min(常温)，期间震荡数次；

3、加入20μL的1mol/L Tris-HCL溶液(PH＝8.0)，充分涡旋震荡；

4、将样品管放入离心机12000rpm离心10min，吸取上清液，备用。

(三)引物P1、P2初次扩增的PCR体系：

初次PCR扩增的反应体系和扩增条件为：

(四)引物P1、P2初次扩增的PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火15s，60℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。

(五)对纯化的PCR产物进行单碱基延伸，反应体系为：

延伸引物序列为：

P3：5'-CCAGGACGACGTCGTGGATCTG-3'(SEQ ID NO:6)。

延伸反应条件为：

(六)取1μl延伸产物，加8μl上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴。

在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测，确定待测亲本的HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位碱基处的SNP位点是否为GA杂合体，若是，则为快速生长的大口黑鲈；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第259位插入缺失突变位点是否为T-基因型，其中“-”表示碱基缺失，若是，则为快速生长的大口黑鲈；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第2302位插入缺失突变位点是否为Y-基因型，其中Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC，“-”表示碱基片段缺失，若是，则为快速生长的大口黑鲈；

本检测方法大约可以在10个小时内操作完成，并且可以同时对多个样本进行检测，能为接下来要进行的大口黑鲈优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对优势等位基因的鉴定，是在DNA水平上对大口黑鲈种质质量的评估，目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为3元，成本较低，适合推广使用。

综上所述，申请人研究发现，在大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第1313位碱基、第2346位碱基处分别发现一个SNP，在第259位碱基和第2302位分别发现一个插入缺失突变位点，经过Snapshot方法分型发现在第1313位置存在等位基因A和等位基因G，组成2种基因型AA和GA；在第259位置存在等位基因T和碱基缺失“-”，组成2种基因型T-和--；在第2302位置存在碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC(简称为Y片段)或者为碱基片段缺失，即存在2种基因型Y-和--(其中“-”表示碱基缺失)；在第2346位置存在等位基因A和等位基因T，组成2种基因型AT和AA。并且发现大口黑鲈HSP70基因序列的第259、2302、2346位基因型与第1313位的SNP完全连锁，即当第1313个碱基处的基因型为GA时，第259位、第2302位、第2346位的基因型分别为T-、Y-、AT(“-”表示碱基缺失，Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC)；当第1313个碱基处的基因型为AA时，第259位、第2302位、第2346位的基因型分别为--、--、AA(“-”表示碱基缺失)。

在检测的随机群体实验中发现，本发明SNP位点对体质量和全长性状有显著影响，其在1313碱基位置的基因型为GA的个体的生长性状明显优于基因型AA的个体。因此，根据大口黑鲈热激蛋白HSP70基因序列设计引物，建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。利用本方法在生产中保留第1313、259、2302、2346位的基因型分别为GA、T-、Y-、AT的大口黑鲈亲本(Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC)，去除其他基因型的个体，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种与大口黑鲈快速生长相关的单倍型标记及其应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 639

<212> PRT

<213> 大口黑鲈

<400> 1

Met Ser Ala Ala Lys Gly Val Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala

20 25 30

Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp

35 40 45

Ser Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn

50 55 60

Pro Ser Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Met

65 70 75 80

Asp Asp Pro Val Val Gln Ala Asp Met Lys His Trp Ser Phe Lys Val

85 90 95

Val Gly Asp Gly Gly Lys Pro Lys Ile Gln Val Glu Tyr Lys Gly Glu

100 105 110

Asp Lys Thr Phe Asn Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Val Lys

115 120 125

Met Lys Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly His Lys Val Ser Asn Ala

130 135 140

Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr

145 150 155 160

Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn

165 170 175

Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Lys Ser

180 185 190

Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp

195 200 205

Val Ser Val Leu Thr Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr

210 215 220

Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Met Val

225 230 235 240

Asn His Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser

245 250 255

Gln Asn Lys Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala

260 265 270

Lys Arg Thr Leu Ser Ser Ser Ser Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Ser

275 280 285

Leu Phe Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe

290 295 300

Glu Glu Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Glu Pro Val Glu

305 310 315 320

Lys Ala Leu Lys Asp Ala Lys Met Asp Lys Gly Gln Ile His Asp Val

325 330 335

Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu

340 345 350

Gln Asp Phe Phe Asn Gly Arg Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp

355 360 365

Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Thr Gly

370 375 380

Asp Thr Ser Gly Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro

385 390 395 400

Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Ser Leu Ile

405 410 415

Lys Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Ile Phe Ser Thr

420 425 430

Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu

435 440 445

Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Thr

450 455 460

Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe

465 470 475 480

Asp Val Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser

485 490 495

Thr Gly Lys Glu Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu

500 505 510

Ser Lys Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Gln Asp Ala Asp Lys Tyr Lys

515 520 525

Ala Glu Asp Asp Leu Gln Arg Glu Lys Val Ser Ala Lys Asn Ser Leu

530 535 540

Glu Ser Tyr Ala Phe Asn Thr Lys Ser Ala Val Gln Asp Glu Lys Val

545 550 555 560

Lys Gly Gln Ile Ser Glu Glu Asp Arg Lys Lys Leu Ile Glu Lys Cys

565 570 575

Asp Glu Thr Ile Ser Trp Leu Glu Asn Asn Gln Leu Ala Asp Lys Glu

580 585 590

Lys Tyr Gln His Gln Gln Lys Glu Leu Glu Lys Val Cys Asn Pro Ile

595 600 605

Ile Ser Lys Leu Tyr Gln Gly Gly Met Pro Ala Gly Ser Cys Gly Glu

610 615 620

Gln Ala Arg Ala Gly Ser Gln Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp

625 630 635

<210> 2

<211> 1920

<212> DNA

<213> 大口黑鲈

<400> 2

atgtctgcag ctaaaggtgt ggcgatcggc atcgacctgg gcaccaccta ctcctgtgtg 60

ggggttttcc agcacgggaa agtagaaatc atcgccaacg accagggcaa caggaccacc 120

cccagctatg tggcgttcac cgactccgag aggctgatcg gggacgcggc caagaaccag 180

gtggctctga accccagcaa caccgtgttc gatgccaaga gactgattgg gagaaagatg 240

gacgatccag tggtgcaggc tgacatgaag cactggtcct tcaaggtggt cggagacgga 300

gggaagccca aaatccaggt ggagtacaaa ggggaggaca aaaccttcaa ccccgaggag 360

atctcctcca tggtcctggt gaagatgaag gagatcgctg aggcctacct cggccacaag 420

gtgtccaacg cggtcatcac ggtcccggcg tacttcaacg actcccagcg gcaggcgact 480

aaagacgcgg gcgtcatcgc aggactgaac gtcctgagga tcatcaacga gccgacggca 540

gccgccatcg cctacggtct ggacaaaggc aagtcgggag agcgcaacgt cctgatcttc 600

gacctgggcg gaggcacctt cgacgtgtcc gtcctcacca tcgaagacgg gatcttcgag 660

gtcaaagcca cggccggaga cactcacctg ggcggagaag actttgacaa ccgcatggtc 720

aaccactttg tggaggagtt caagaggaaa cacaagaagg acatcagcca gaacaagagg 780

gccttgagga ggctgcgcac agcttgcgag agggccaaga gaaccctgtc ctccagctcc 840

caggccagcc tcgagatcga ttctctgttt gagggcgtcg acttctacac ctccatcacc 900

agggctcgct ttgaggagct gtgctccgac ctgttcaggg gaacgttgga gcccgtggag 960

aaagccctga aggacgccaa aatggacaag ggrcagatcc acgacgtcgt cctggtggga 1020

ggctccaccc gaatccccaa agtccagaag ctcctgcagg atttcttcaa cggcagggag 1080

ctgaacaaga gcatcaaccc agacgaggcg gtggcttacg gcgccgccgt ccaggccgcc 1140

atcctcacgg gtgatacctc gggcaacgtc caggacctgc tgctgctgga cgtggcgcct 1200

ctgtccctgg gtatcgagac ggccggagga gtcatgacgt ccctgattaa gcgcaacacc 1260

accatcccca ctaaacagac ccagatcttc agcacctact ccgacaacca gcccggggtc 1320

ctgatccagg tctacgaagg ggaaagagcc atgaccaagg acaacaacct gctgggcagg 1380

tttgagctga cgggaatccc gcccgctccg cgaggggtcc cgcagatcga ggtcaccttc 1440

gacgtggacg ccaacggcat tttgaacgtg tctgcggtgg acaaaagcac cggcaaagag 1500

aacaagatca ccatcaccaa cgataagggc cggctgagca aggaagagat cgagaggatg 1560

gtgcaggacg ccgacaaata caaagctgag gacgaccttc agagggagaa agtctccgcc 1620

aagaactccc tggagtccta cgccttcaac acgaagagcg ccgtgcagga cgagaaggtg 1680

aagggccaaa ttagcgagga ggaccggaag aagctgattg agaagtgtga cgagaccatc 1740

agctggctgg agaacaacca gctggctgat aaagagaagt accagcacca gcagaaggag 1800

ctggagaaag tgtgtaaccc catcatcagc aagttgtatc agggaggaat gcccgctgga 1860

agctgtggag agcaggcacg agccggctcc caggggccca ccattgagga ggtggactaa 1920

<210> 3

<211> 2650

<212> DNA

<213> 大口黑鲈

<400> 3

aatacacaaa agggcaacaa ttaccatttc atattttaaa taataagtta taatttcagg 60

aatacagaca tatttttatt cacatgacca aacttctaca aataacaaac caaggaaaat 120

taatatatca tttgggatct gcaaggtttt attgattcat tgatcatttt atttcattag 180

tctacccagt tgctccaggc ttcatattga tatgactctt tagaccacac ttgcccttgc 240

agaagcacaa atagttttkg taaattttct ttccaatttt tgtctctgct tctttaggac 300

acaaattcaa aagcaccaag atgtctgcag ctaaaggtgt ggcgatcggc atcgacctgg 360

gcaccaccta ctcctgtgtg ggggttttcc agcacgggaa agtagaaatc atcgccaacg 420

accagggcaa caggaccacc cccagctatg tggcgttcac cgactccgag aggctgatcg 480

gggacgcggc caagaaccag gtggctctga accccagcaa caccgtgttc gatgccaaga 540

gactgattgg gagaaagatg gacgatccag tggtgcaggc tgacatgaag cactggtcct 600

tcaaggtggt cggagacgga gggaagccca aaatccaggt ggagtacaaa ggggaggaca 660

aaaccttcaa ccccgaggag atctcctcca tggtcctggt gaagatgaag gagatcgctg 720

aggcctacct cggccacaag gtgtccaacg cggtcatcac ggtcccggcg tacttcaacg 780

actcccagcg gcaggcgact aaagacgcgg gcgtcatcgc aggactgaac gtcctgagga 840

tcatcaacga gccgacggca gccgccatcg cctacggtct ggacaaaggc aagtcgggag 900

agcgcaacgt cctgatcttc gacctgggcg gaggcacctt cgacgtgtcc gtcctcacca 960

tcgaagacgg gatcttcgag gtcaaagcca cggccggaga cactcacctg ggcggagaag 1020

actttgacaa ccgcatggtc aaccactttg tggaggagtt caagaggaaa cacaagaagg 1080

acatcagcca gaacaagagg gccttgagga ggctgcgcac agcttgcgag agggccaaga 1140

gaaccctgtc ctccagctcc caggccagcc tcgagatcga ttctctgttt gagggcgtcg 1200

acttctacac ctccatcacc agggctcgct ttgaggagct gtgctccgac ctgttcaggg 1260

gaacgttgga gcccgtggag aaagccctga aggacgccaa aatggacaag ggrcagatcc 1320

acgacgtcgt cctggtggga ggctccaccc gaatccccaa agtccagaag ctcctgcagg 1380

atttcttcaa cggcagggag ctgaacaaga gcatcaaccc agacgaggcg gtggcttacg 1440

gcgccgccgt ccaggccgcc atcctcacgg gtgatacctc gggcaacgtc caggacctgc 1500

tgctgctgga cgtggcgcct ctgtccctgg gtatcgagac ggccggagga gtcatgacgt 1560

ccctgattaa gcgcaacacc accatcccca ctaaacagac ccagatcttc agcacctact 1620

ccgacaacca gcccggggtc ctgatccagg tctacgaagg ggaaagagcc atgaccaagg 1680

acaacaacct gctgggcagg tttgagctga cgggaatccc gcccgctccg cgaggggtcc 1740

cgcagatcga ggtcaccttc gacgtggacg ccaacggcat tttgaacgtg tctgcggtgg 1800

acaaaagcac cggcaaagag aacaagatca ccatcaccaa cgataagggc cggctgagca 1860

aggaagagat cgagaggatg gtgcaggacg ccgacaaata caaagctgag gacgaccttc 1920

agagggagaa agtctccgcc aagaactccc tggagtccta cgccttcaac acgaagagcg 1980

ccgtgcagga cgagaaggtg aagggccaaa ttagcgagga ggaccggaag aagctgattg 2040

agaagtgtga cgagaccatc agctggctgg agaacaacca gctggctgat aaagagaagt 2100

accagcacca gcagaaggag ctggagaaag tgtgtaaccc catcatcagc aagttgtatc 2160

agggaggaat gcccgctgga agctgtggag agcaggcacg agccggctcc caggggccca 2220

ccattgagga ggtggactaa agtggccctt cacatggact ctatgatcac cgggactgtt 2280

tgaaataccc ctgtaacctc tsttttttaa gatgtggtga tgaataagtt tttccatgta 2340

aatatwgttt actgcagatg tttaacatac agctgaaact atatgtctca cggtaaaatg 2400

tcctttttcc ttattgtata ttatgttaaa tcctaaaatg ttaatatatt ttttatcttt 2460

ttgatttgtc tttctggttt tcatgttttc gaaatgaaat gtattaaagg tttttaactc 2520

aaatttatat aaagtgtaca tcgacgtgag taataaacac gacagagaaa caaaaaagta 2580

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagtactct gcgttgatac cactgcttgc cctatagtga 2640

gtcgtattag 2650

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtcgacttc tacacctcca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgtctgggt tgatgctctt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaggacgac gtcgtggatc tg 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgtcttctg ttcataagtg tc 22

Claims

1.一种大口黑鲈HSP70蛋白，其特征在于，所述大口黑鲈HSP70蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述大口黑鲈HSP70蛋白的基因，其特征在于，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，其中第993位R为碱基G或A。

3.SNP位点或插入缺失突变位点在判断大口黑鲈生长快慢中的应用；所述SNP位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第1313位和第2346位，所述插入缺失突变位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第259位和第2302位。

4.SNP位点或插入缺失突变位点在筛选快速生长大口黑鲈中的应用；所述SNP位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第1313位和第2346位，所述插入缺失突变位点位于HSP70基因组序列SEQ ID NO：3所示的第259位和第2302位。

5.一种检测大口黑鲈HSP70基因型的方法，其特征在于：

检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位碱基处的SNP位点是否为GA基因型；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第259位是否为T-基因型，其中“-” 表示碱基缺失；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第2302位是否为Y-基因型，其中Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC，“-”表示碱基片段缺失；

或者/和，检测HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第2346位碱基处的SNP位点是否为AT基因型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取大口黑鲈DNA；

2）以提取得到的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位、第259位、第2302位或/和第2346位的基因型是否分别为GA、T-、Y-、AT基因型其中“-”表示碱基缺失，Y表示碱基片段CTGTCTTCTGTTCATAAGTGTC。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，当检测大口黑鲈HSP70基因组序列SEQ ID NO：3的第1313位碱基处的SNP位点是否为GA基因型时，所用到的PCR检测具体操作为：

P1：5'- CGTCGACTTCTACACCTCCA -3'（SEQ ID NO：4）；

P2：5'- TCGTCTGGGTTGATGCTCTT -3'（SEQ ID NO：5）；

再将初次PCR产物用引物P3进行延伸扩增，将所得产物经测序分析，确定大口黑鲈HSP70基因序列第1313位碱基处的SNP位点是否为GA基因型；

P3：5'- CCAGGACGACGTCGTGGATCTG -3'（SEQ ID NO：6）。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述初次PCR扩增的反应体系为：

DNA 1μl

10×buffer 1.5μl

25mmol 的MgCl₂ 1.5μl

dNTP 0.3μl

P1引物 0.15μl

P2引物 0.15μl

Taq酶 0.3μl

H₂O 补至15μl；