CN111378765B

CN111378765B - 速生草鱼个体的snp标记及其应用

Info

Publication number: CN111378765B
Application number: CN202010324033.7A
Authority: CN
Inventors: 李胜杰; 孙雪; 杜金星; 姜鹏; 白俊杰
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN111378765A

Abstract

本发明公开了一种速生草鱼个体的分子标记及其检测方法。本发明公开了与草鱼快速生长调控有关的SNP标记。若该SNP标记位点是AA基因型，则为快速生长的草鱼；否则为缓慢生长的草鱼。应用该SNP标记及检测方法，在生产中筛选到AA基因型草鱼个体，用作草鱼亲本进行繁殖，可生产出具有生长优势的草鱼苗种。而且本发明中的方法操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

Description

速生草鱼个体的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及与一种速生草鱼个体的SNP标记及其应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodon idella)，隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，雅罗鱼亚科(Leuciscus)，草鱼属(Ctenopharyngodon)，是我国淡水养殖鱼类中养殖年产量最高的养殖品种。草鱼具有生长快、肉质鲜美、饲料来源广等特点，与“青、鲢、鳙”一起被称为我国淡水养殖的“四大家鱼”。目前在我国草鱼养殖产业中还未有经过人工选育且通过国家审定的良种，加之多数繁殖场不遵守科学的种苗生产规程，选择个体小、性成熟早、亲缘关系近的草鱼作为亲本，致使养殖草鱼出现一定程度的种质退化现象，主要表现为生长速度减慢、抗逆性能下降等，制约草鱼养殖产业的健康发展。草鱼的性成熟年龄为4-5年，育种周期较长。随着分子生物技术的快速发展，分子标记辅助育种技术有望是缩短草鱼育种周期和尽快培育出草鱼优良品种的一个重要途径。分子标记辅助育种技术是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记，对目的基因进行筛选，从而不受环境条件的影响，增加了选择的可靠性，提高育种效率。

单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism，SNP)指的是单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列多态性，具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将动植物群体中的目标性状以及SNP标记多态性进行关联分析，以鉴定动植物目标性状与SNP标记之间相关性。将这些遗传标记与生长性状相关联，从而实现在DNA水平上进行选择育种，有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，为分子标记辅助选育快长草鱼品种提供基础资料。

针对现有技术的不足，加强草鱼的种质资源挖掘利用，尽快培育出生长快速且经济性状优良的草鱼选育新品种成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种速生草鱼个体的SNP标记及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种草鱼生长调控相关的SNP标记，其序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第525位碱基为A或G。

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列如下：

ATGCTGAACACCGTGGACTTCAGCGCTCTGGATCTGCTTTGCGCTCAAGCGTTTCCTCTGGAGGGACAATCAGAATCCCCTCAGAATCAACCTGATGCTGGTGAGTACATATTAACATTTAATATGATTTTTATAAAATCTGACTTCATAAAGATGCCATGCATTGCACAAAATATAAACACATATTCTGGAATTTAAGAATCAACCTTAGAAATAAAGGTTCTTTACTGGCATCGATGGTTCCAATGAAGAGCTTTGGAATCTTTCCATTCCACAAAAGGTTCTAAAATGATTATTTTAAGAACTGATCGGATTCTTTGGGGAACCAAAATGGTTCTTCTGTTGCATCACTGCAAAAACACCCTTTTGGAACCTTTATTTTTATTGTAAAATGACATGCAATGCACAAAATATAAACGGAATTGAAGAATCAATCATTGGAAATCATTAGTTTAGATGTGCTGCTGCAGTGAGTCAACATTATGTAACGCACCCTCTCCTCTTTCTCTTGCAGCTTTCGGTCTRTTGAAGCCCAAAGCGGAGCCGCTGGACGCTGGTTTTCCCGACTGCTCCAGCGACGGGTTCCCGCCGTCTCCGCTGAACTACACCGGCAGCTTCTACACGGAGTCCGGGCCGTGCAGCGCGGACGCGCTTCTCAACATCCTCACGGAGATCGTCGGCATCTCCGCGGCTCCCGACAACTTGTCTCGCGGAAACGCGCTGTCACGCCAGGAGTCGCTGTTATCCACCGGGAGCTCGCTGGGATCGCCGGAATCGCTCTGCAACGACTCGTCGGATGAGTTCATGGACGCGAGCGCGCAACAGTTCTCCTACCCTGCGATTAAGAGCGAGTTTGGCAGCAGCAGCTGCAACGGCGGTGATCTTTTCGATGGCTTCTGCACTACTTCTCACGAGCCTTCAGACTTGGATGACATCATTGACTTGCTCTCTCCACTTGGTCCAGAGACTGACTCAGTTTTGGACACGTGGATCAAGCAAGAGCCCTTGGAGCAAGCGAGCTTCCAGATTCCCGCTTCCCATGAAAACAGCCTCTACAGAAACATTGCGTTCCCTGGATTCCCCTGCGCAACGACCGCGCTTGCCGACGCGCTGGACTCCCTCCTCTCCACCAACAACACGCTCACTCAAAGAAGCAAACCGCGCGCCAGAAAGGGCGAGAAGCCCTTCTCCTGCCCGATTGAGAACTGCGAGCGCCGCTTCTCGCGTTCCGACGAGCTCAACCGCCACGTGCGCATCCACACCGGCCACAAGCCCTTCCAGTGCCGCGTGTGCCTGCGCTGCTTCAGCCGCAGCGACCATCTCACCACTCACATGCGCACGCACACCGGCGAGAAGCCGTTCTCCTGCGACGTGTGCGGGCGACGCTTCGCACGCAGCGACGAGAGGAAGCGGCACGGTCGCGTGCACCTCAAACAGCGTGAGAGGATGCAGCAGAAGACGGAGCTCCTCGCCGCGTGCGCGTTCGAGCTCCAGTGCGCG(SEQ ID NO：1)。

上述序列自5’端起第525位碱基R为A或G。

进一步地，上述SNP标记的AA基因型个体的生长速度显著高于AG和GG基因型个体。

进一步地，上述SNP标记的序列如SEQ ID NO：2所示，SEQ ID NO：2所示序列自5’端起第111位碱基为A或G。

SEQ ID NO：2所示核苷酸序列如下：

ATGCTGAACACCGTGGACTTCAGCGCTCTGGATCTGCTTTGCGCTCAAGCGTTTCCTCTGGAGGGACAATCAGAATCCCCTCAGAATCAACCTGATGCTGCTTTCGGTCTRTTGAAGCCCAAAGCGGAGCCGCTGGACGCTGGTTTTCCCGACTGCTCCAGCGACGGGTTCCCGCCGTCTCCGCTGAACTACACCGGCAGCTTCTACACGGAGTCCGGGCCGTGCAGCGCGGACGCGCTTCTCAACATCCTCACGGAGATCGTCGGCATCTCCGCGGCTCCCGACAACTTGTCTCGCGGAAACGCGCTGTCACGCCAGGAGTCGCTGTTATCCACCGGGAGCTCGCTGGGATCGCCGGAATCGCTCTGCAACGACTCGTCGGATGAGTTCATGGACGCGAGCGCGCAACAGTTCTCCTACCCTGCGATTAAGAGCGAGTTTGGCAGCAGCAGCTGCAACGGCGGTGATCTTTTCGATGGCTTCTGCACTACTTCTCACGAGCCTTCAGACTTGGATGACATCATTGACTTGCTCTCTCCACTTGGTCCAGAGACTGACTCAGTTTTGGACACGTGGATCAAGCAAGAGCCCTTGGAGCAAGCGAGCTTCCAGATTCCCGCTTCCCATGAAAACAGCCTCTACAGAAACATTGCGTTCCCTGGATTCCCCTGCGCAACGACCGCGCTTGCCGACGCGCTGGACTCCCTCCTCTCCACCAACAACACGCTCACTCAAAGAAGCAAACCGCGCGCCAGAAAGGGCGAGAAGCCCTTCTCCTGCCCGATTGAGAACTGCGAGCGCCGCTTCTCGCGTTCCGACGAGCTCAACCGCCACGTGCGCATCCACACCGGCCACAAGCCCTTCCAGTGCCGCGTGTGCCTGCGCTGCTTCAGCCGCAGCGACCATCTCACCACTCACATGCGCACGCACACCGGCGAGAAGCCGTTCTCCTGCGACGTGTGCGGGCGACGCTTCGCACGCAGCGACGAGAGGAAGCGGCACGGTCGCGTGCACCTCAAACAGCGTGAGAGGATGCAGCAGAAGACGGAGCTCCTCGCCGCGTGCGCGTTCGAGCTCCAGTGCGCGTGA(SEQ ID NO：2)。

序列自5’端起第111位碱基R为A或G。

更进一步地，上述SNP标记SEQ ID NO：2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3所示氨基酸序列如下：

MLNTVDFSALDLLCAQAFPLEGQSESPQNQPDAAFGLLKPKAEPLDAGFPDCSSDGFPPSPLNYTGSFYTESGPCSADALLNILTEIVGISAAPDNLSRGNALSRQESLLSTGSSLGSPESLCNDSSDEFMDASAQQFSYPAIKSEFGSSSCNGGDLFDGFCTTSHEPSDLDDIIDLLSPLGPETDSVLDTWIKQEPLEQASFQIPASHENSLYRNIAFPGFPCATTALADALDSLLSTNNTLTQRSKPRARKGEKPFSCPIENCERRFSRSDELNRHVRIHTGHKPFQCRVCLRCFSRSDHLTTHMRTHTGEKPFSCDVCGRRFARSDERKRHGRVHLKQRERMQQKTELLAACAFELQ(SEQ ID NO：3)。

上述核苷酸序列皆为根据草鱼EGR-1(Early growth response protein 1)基因序列获得。

本发明的第二个方面，提供：

一组用于检测上述SNP标记的引物，其具有如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列。

上述SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列如下：

上游引物P1：5'-CATTATGTAACGCACCCTCTCC-3'(SEQ ID NO：4)；

下游引物P2：5'-CCGTGAGGATGTTGAGAAGC-3'(SEQ ID NO：5)。

利用本发明的引物对能够有效地对待测草鱼的上述与生长调控相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而能够有效实现对该SNP标记的检测，确定待测草鱼该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测草鱼的生长性状。

本发明的第三个方面，提供：

一种用于检测上述的SNP标记的试剂盒，包括：上述的引物。

该试剂盒包括：上述的用于检测本发明的SNP标记的引物。即本发明的试剂盒中包括具有SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列的引物。利用本发明的试剂盒中所包括的引物，能够有效实现对待测草鱼的上述与生长调控相关的SNP标记的多态性检测，确定待测草鱼该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测草鱼的生长性状。

本发明的第四个方面，提供：

上述的SNP标记、上述的引物或上述的试剂盒，在草鱼速生个体筛选中的用途。

通过能够用于检测本发明的与草鱼生长调控相关的SNP标记的试剂，例如上述的引物或包括该引物的试剂盒等，能够有效地检测确定待测草鱼的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测草鱼的生长速性状，从而能够有效辅助速生草鱼选育。

本发明的第五个方面，提供：

一种检测草鱼生长速度的方法，其通过对待测草鱼进行上述的SNP标记的检测，确定上述待测草鱼的生长性状。若是，则为生长缓慢；否则，为快速生长。

该方法通过对待测草鱼进行上述的SNP标记的检测，确定上述待测草鱼的生长性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与草鱼生长速度相关的SNP标记的试剂，例如上述的引物或包括该引物的试剂盒等，对待测草鱼进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测草鱼的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测草鱼的生长性状。

进一步地，上述对待测草鱼进行上述的SNP标记的检测的具体操作步骤包括：

提取待测草鱼的基因组DNA；

利用SEQ ID NO：4-5所示的引物，将上述待测草鱼的基因组DNA进行第一PCR扩增，以便获得第一PCR扩增产物；

利用延伸引物对上述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物，其中上述延伸引物具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

对上述第二PCR扩增产物进行检测，以便确定上述待测草鱼的上述SNP标记的基因型；以及

基于上述待测草鱼的上述SNP标记的基因型，确定上述待测草鱼的生长性状。

上述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。其可以采用选自第一代基因测序、第二代高通量基因测序或第三代高通量基因测序或其他任何可行的用于确定其基因型的至少一种对上述PCR扩增产物进行检测。由此，能够快速、高效、准确地获得其基因型结果。

上述SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列如下：

延伸引物P3：5'-CTGACTGACTTCTTTCTCTTGCAGCTTTCGGTCT-3'(SEQ ID NO：6)。

更进一步地，上述第一次PCR扩增的反应体系为：

DNA	1μl
		10×buffer	1.5μl
MgCl<sub>2</sub>(25mmol)	1.5μl
		dNTP	0.3μl
引物(SEQ ID NO：4)	0.15μl
		引物(SEQ ID NO：5)	0.15μl
Taq酶	0.3μl
		H<sub>2</sub>O	补至15μl；

上述第一次PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火15s，60℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。

上述第二PCR扩增包括对第一次PCR产物进行单碱基延伸。

上述第二PCR扩增(延伸)的反应体系为：

纯化的第一次PCR产物	2μl
		Snapshot Mix试剂	1μl
延伸引物P3	2μl
		水补至	6μl

上述延伸的反应条件为：

96℃1min；96℃10s、52℃5s、60℃30s，循环30次。

本发明的有益效果是：

(1)本发明大大降低草鱼新品种选育的盲目性，加快草鱼新品种的选育进程；

(2)本发明筛选快速生长草鱼亲本的方法既保证了检测结果的可靠性，又无需繁琐操作进行测序分析，提高了处理效率和精确性，建立了有效地鉴定具有优良生长性状的个体。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1草鱼生长调控相关的SNP标记的获得。

本申请研究发现，根据草鱼EGR-1(Early growth response protein 1)基因序列，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列，其中SNP位点在所测草鱼个体中存在三种基因型，分别为AA、AG和GG基因型。

本发明的草鱼生长调控相关的SNP标记如下所示，其序列自5’端起第525位碱基R为A或G。

其核苷酸序列如下：

同时，本发明在SEQ ID NO：1的基础上，还发现了另一草鱼生长调控相关的SNP标记SEQ ID NO：2，其序列如下所示，该序列自5’端起第111位碱基为A或G

SEQ ID NO：2所示核苷酸序列如下：

SNP标记SEQ ID NO：2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：

SEQ ID NO：3所示氨基酸序列如下：

本实验用于关联分析的草鱼，样本数为300尾的随机群体为同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异，草鱼EGR-1基因第525位处不同基因型在随机群体中频率分布见表1。

表1草鱼EGR-1基因第525位处不同基因型在随机群体中频率分布

利用SPSS 19.0软件一般线性分析，分析SNP位点的不同基因型与草鱼随机群体中主要生长性状(体质量、体长)之间的关联性。草鱼SNP标记个体间生长性状的多重比较结果如表2所示。

表2不同基因型个体间生长性状的多重比较

注：表中数值为平均值±标准误差，同一行上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

从以上数据可知，基因型AA在体质量及体长的均值上高于其他两种基因型，且AA基因型在体质量及体长方面显著高于GG基因型，故本发明发现若找到AA基因型个体，便可快速获得生长速度快的草鱼个体，与预期一致，即可快速、准确地筛选出所需要的快速生长的草鱼亲本。

实施例2筛选快速生长草鱼的方法

利用实施例1选取的SNP位点对快速生长草鱼亲本进行筛选，包括如下步骤：

(一)引物序列：

根据SEQ ID NO：1设计引物对SNP位点所在基因片段进行PCR扩增，设计并合成的引物如下：

上游引物P1：5'-CATTATGTAACGCACCCTCTCC-3'(SEQ ID NO：4)；

下游引物P2：5'-CCGTGAGGATGTTGAGAAGC-3'(SEQ ID NO：5)。

引物预期扩增1条DNA带，大小192bp。

(二)样品处理：

(1)剪取待检测草鱼鳍条15mg，装入干净的EP管中；

(2)加入180μL的50mmol/L NaOH溶液，水浴20min(常温)，期间震荡数次；

(3)加入20μL的1mol/L Tris-HCL溶液(PH＝8.0)，充分涡旋震荡；

(4)将样品管放入离心机12000rpm离心10min，吸取上清液，备用。

(三)引物P1和P2第一次扩增的PCR体系：

第一次PCR扩增的反应体系和扩增条件为：

DNA	1μl
		10×buffer	1.5μl
25mmol的MgCl<sub>2</sub>	1.5μl
		dNTP	0.3μl
上游引物(P1)	0.15μl
		下游引物(P2)	0.15μl
Taq酶	0.3μl
		H<sub>2</sub>O	补至15μl

(四)引物P1和P2第一次扩增的PCR扩增条件：

94℃3min；94℃15s、54℃15s、60℃30s，循环24次；72℃3min。

(五)对纯化的第一次PCR产物进行单碱基延伸，反应体系为：

其延伸引物序列为：

延伸引物P3：5'-CTGACTGACTTCTTTCTCTTGCAGCTTTCGGTCT-3'(SEQ ID NO：6)。

延伸反应条件为：

96℃1min；96℃10s、52℃5s、60℃30s，循环30次。

(六)确定待测样品基因型

取1μl延伸产物，加8μl上样缓冲液loading buffer，95℃变性3min，立即冰水浴。

在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测，检测SEQ ID NO：1的SNP位点是否为AA基因型，若是，则为快速生长的草鱼；若否，则为缓慢生长的草鱼。

(七)成本评估

本实施例检测方法大约可以在10个小时内操作完成，并且可以同时对多个样本进行检测，能为接下来要进行的草鱼优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对草鱼进行基因型检测，从而获得快速生长的草鱼个体，是在DNA水平上对草鱼种质质量的评估，目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为3元，成本较低，适合推广使用。

实施例3SNP标记实用性验证

选择一个草鱼群体(共382尾)，该草鱼群体，为同一批繁殖、同池养殖，在采样时间一致的条件下，对本发明SNP标记进行检测，并进行基因分型，采用SPSS 19.0软件一般线性分析，分析SNP位点的不同基因型与草鱼随机群体中主要生长性状(体质量)之间的关联性，如表3所示。

表3不同基因型个体间生长性状的多重比较

从以上数据可知，基因型AA在体质量的均值上高于其他两种基因型，且AA基因型体质量均值显著高于GG基因型，与本研究上个群体验证结果相一致，说明该SNP标记在草鱼盲选中具有很高的实用性，通过筛选AA基因型个体，可得到快生长的草鱼个体。本筛选方法在日常实践中能极大的提高筛选出生长速度快的草鱼个体的准确性，进而加快草鱼新品种选育进程。

综上所述，申请人研究发现，基因型AA与其他两种基因型在体质量及体长上存在差异，基因型AA在体质量和体长上均高于AG和GG两种基因型，故若筛选到AA基因型个体，便可筛选出所需要的快速生长的草鱼亲本。因此，根据本发明序列设计引物，建立了有效地鉴定具有优良生长性状的亲本。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 速生草鱼个体的SNP标记及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgaaca ccgtggactt cagcgctctg gatctgcttt gcgctcaagc gtttcctctg 60

gagggacaat cagaatcccc tcagaatcaa cctgatgctg gtgagtacat attaacattt 120

aatatgattt ttataaaatc tgacttcata aagatgccat gcattgcaca aaatataaac 180

acatattctg gaatttaaga atcaacctta gaaataaagg ttctttactg gcatcgatgg 240

ttccaatgaa gagctttgga atctttccat tccacaaaag gttctaaaat gattatttta 300

agaactgatc ggattctttg gggaaccaaa atggttcttc tgttgcatca ctgcaaaaac 360

acccttttgg aacctttatt tttattgtaa aatgacatgc aatgcacaaa atataaacgg 420

aattgaagaa tcaatcattg gaaatcatta gtttagatgt gctgctgcag tgagtcaaca 480

ttatgtaacg caccctctcc tctttctctt gcagctttcg gtctrttgaa gcccaaagcg 540

gagccgctgg acgctggttt tcccgactgc tccagcgacg ggttcccgcc gtctccgctg 600

aactacaccg gcagcttcta cacggagtcc gggccgtgca gcgcggacgc gcttctcaac 660

atcctcacgg agatcgtcgg catctccgcg gctcccgaca acttgtctcg cggaaacgcg 720

ctgtcacgcc aggagtcgct gttatccacc gggagctcgc tgggatcgcc ggaatcgctc 780

tgcaacgact cgtcggatga gttcatggac gcgagcgcgc aacagttctc ctaccctgcg 840

attaagagcg agtttggcag cagcagctgc aacggcggtg atcttttcga tggcttctgc 900

actacttctc acgagccttc agacttggat gacatcattg acttgctctc tccacttggt 960

ccagagactg actcagtttt ggacacgtgg atcaagcaag agcccttgga gcaagcgagc 1020

ttccagattc ccgcttccca tgaaaacagc ctctacagaa acattgcgtt ccctggattc 1080

ccctgcgcaa cgaccgcgct tgccgacgcg ctggactccc tcctctccac caacaacacg 1140

ctcactcaaa gaagcaaacc gcgcgccaga aagggcgaga agcccttctc ctgcccgatt 1200

gagaactgcg agcgccgctt ctcgcgttcc gacgagctca accgccacgt gcgcatccac 1260

accggccaca agcccttcca gtgccgcgtg tgcctgcgct gcttcagccg cagcgaccat 1320

ctcaccactc acatgcgcac gcacaccggc gagaagccgt tctcctgcga cgtgtgcggg 1380

cgacgcttcg cacgcagcga cgagaggaag cggcacggtc gcgtgcacct caaacagcgt 1440

gagaggatgc agcagaagac ggagctcctc gccgcgtgcg cgttcgagct ccagtgcgcg 1500

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgctgaaca ccgtggactt cagcgctctg gatctgcttt gcgctcaagc gtttcctctg 60

gagggacaat cagaatcccc tcagaatcaa cctgatgctg ctttcggtct rttgaagccc 120

aaagcggagc cgctggacgc tggttttccc gactgctcca gcgacgggtt cccgccgtct 180

ccgctgaact acaccggcag cttctacacg gagtccgggc cgtgcagcgc ggacgcgctt 240

ctcaacatcc tcacggagat cgtcggcatc tccgcggctc ccgacaactt gtctcgcgga 300

aacgcgctgt cacgccagga gtcgctgtta tccaccggga gctcgctggg atcgccggaa 360

tcgctctgca acgactcgtc ggatgagttc atggacgcga gcgcgcaaca gttctcctac 420

cctgcgatta agagcgagtt tggcagcagc agctgcaacg gcggtgatct tttcgatggc 480

ttctgcacta cttctcacga gccttcagac ttggatgaca tcattgactt gctctctcca 540

cttggtccag agactgactc agttttggac acgtggatca agcaagagcc cttggagcaa 600

gcgagcttcc agattcccgc ttcccatgaa aacagcctct acagaaacat tgcgttccct 660

ggattcccct gcgcaacgac cgcgcttgcc gacgcgctgg actccctcct ctccaccaac 720

aacacgctca ctcaaagaag caaaccgcgc gccagaaagg gcgagaagcc cttctcctgc 780

ccgattgaga actgcgagcg ccgcttctcg cgttccgacg agctcaaccg ccacgtgcgc 840

atccacaccg gccacaagcc cttccagtgc cgcgtgtgcc tgcgctgctt cagccgcagc 900

gaccatctca ccactcacat gcgcacgcac accggcgaga agccgttctc ctgcgacgtg 960

tgcgggcgac gcttcgcacg cagcgacgag aggaagcggc acggtcgcgt gcacctcaaa 1020

cagcgtgaga ggatgcagca gaagacggag ctcctcgccg cgtgcgcgtt cgagctccag 1080

tgcgcgtga 1089

<210> 3

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Leu Asn Thr Val Asp Phe Ser Ala Leu Asp Leu Leu Cys Ala Gln

1 5 10 15

Ala Phe Pro Leu Glu Gly Gln Ser Glu Ser Pro Gln Asn Gln Pro Asp

20 25 30

Ala Ala Phe Gly Leu Leu Lys Pro Lys Ala Glu Pro Leu Asp Ala Gly

35 40 45

Phe Pro Asp Cys Ser Ser Asp Gly Phe Pro Pro Ser Pro Leu Asn Tyr

50 55 60

Thr Gly Ser Phe Tyr Thr Glu Ser Gly Pro Cys Ser Ala Asp Ala Leu

65 70 75 80

Leu Asn Ile Leu Thr Glu Ile Val Gly Ile Ser Ala Ala Pro Asp Asn

85 90 95

Leu Ser Arg Gly Asn Ala Leu Ser Arg Gln Glu Ser Leu Leu Ser Thr

100 105 110

Gly Ser Ser Leu Gly Ser Pro Glu Ser Leu Cys Asn Asp Ser Ser Asp

115 120 125

Glu Phe Met Asp Ala Ser Ala Gln Gln Phe Ser Tyr Pro Ala Ile Lys

130 135 140

Ser Glu Phe Gly Ser Ser Ser Cys Asn Gly Gly Asp Leu Phe Asp Gly

145 150 155 160

Phe Cys Thr Thr Ser His Glu Pro Ser Asp Leu Asp Asp Ile Ile Asp

165 170 175

Leu Leu Ser Pro Leu Gly Pro Glu Thr Asp Ser Val Leu Asp Thr Trp

180 185 190

Ile Lys Gln Glu Pro Leu Glu Gln Ala Ser Phe Gln Ile Pro Ala Ser

195 200 205

His Glu Asn Ser Leu Tyr Arg Asn Ile Ala Phe Pro Gly Phe Pro Cys

210 215 220

Ala Thr Thr Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Ser Leu Leu Ser Thr Asn

225 230 235 240

Asn Thr Leu Thr Gln Arg Ser Lys Pro Arg Ala Arg Lys Gly Glu Lys

245 250 255

Pro Phe Ser Cys Pro Ile Glu Asn Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser

260 265 270

Asp Glu Leu Asn Arg His Val Arg Ile His Thr Gly His Lys Pro Phe

275 280 285

Gln Cys Arg Val Cys Leu Arg Cys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr

290 295 300

Thr His Met Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Asp Val

305 310 315 320

Cys Gly Arg Arg Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His Gly Arg

325 330 335

Val His Leu Lys Gln Arg Glu Arg Met Gln Gln Lys Thr Glu Leu Leu

340 345 350

Ala Ala Cys Ala Phe Glu Leu Gln

355 360

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cattatgtaa cgcaccctct cc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgtgaggat gttgagaagc 20

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgactgact tctttctctt gcagctttcg gtct 34

Claims

1.一种草鱼生长速度相关的SNP标记，其特征在于，SNP标记所在的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第525位碱基R为A或G；所述SNP标记的AA基因型个体的生长速度显著高于AG和GG基因型个体。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记所在的序列如SEQ ID NO：2所示，所述SEQ ID NO：2所示序列自5’端起第111位碱基R为A或G。

3.根据权利要求2所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

4.用于检测权利要求1中所述SNP标记的引物在草鱼速生个体筛选中的用途；所述引物如SEQ ID NO：4-6所示；若为AA基因型，则是草鱼速生个体，若为AG和GG两种基因型，则不是草鱼速生个体。

5.一种检测草鱼生长速度的方法，其特征在于，通过对待测草鱼进行权利要求1所述的SNP标记的检测，确定所述待测草鱼的生长性状；若为AA基因型，则是个体快速生长的草鱼，若为AG和GG两种基因型，则不是个体快速生长的草鱼。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对待测草鱼进行权利要求1所述的SNP标记的检测的具体操作步骤包括：

提取待测草鱼的基因组DNA；

利用如SEQ ID NO：4-5所示的引物，将所述待测草鱼的基因组DNA进行第一PCR扩增，以便获得第一PCR扩增产物；

利用延伸引物对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产

物，其中所述延伸引物如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

对所述第二PCR扩增产物进行检测，以便确定所述待测草鱼的所述SNP标记的基因型；以及，

基于所述待测草鱼的所述SNP标记的基因型，确定所述待测草鱼的生长性状。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应体系为：

所述第一次PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火15s，60℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min；

所述第二次PCR扩增的反应体系为：

所述第二次PCR扩增反应条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30个循环。