CN114908175A - 大口黑鲈食性驯化相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大口黑鲈食性驯化相关的SNP标记及其应用，所述SNP标记如SEQ IDNO.1所示，其中第448位R为碱基A或碱基G。并提供了检测该SNP标记的引物、试剂盒和检测方法；该分子标记可作为大口黑鲈驯食性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而提高选择驯食成功率，提高选育效率和准确性，用于快速筛选易驯食大口黑鲈，为培育大口黑鲈易驯食人工配合饲料新品种提供理论依据。

Description

大口黑鲈食性驯化相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及大口黑鲈驯食性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)属于凶猛肉食性鱼类，原产于北美洲，具有无肌间刺、肉质鲜美、生长迅速、养殖周期短等优点。经养殖推广，现已成为我国重要的淡水养殖经济鱼类。据渔业统计年鉴显示，2020年我国大口黑鲈养殖总产量为61.95万吨。作为一种肉食性鱼类，大口黑鲈传统养殖投喂方式以海洋捕捞的低质杂鱼为主，但这种生产方式不仅给我国海洋渔业资源带来巨大的压力，同时也存在劳动强度大、季节性冰鲜鱼供应不足、转化效率低、环境污染严重、病害和用药增多等诸多问题。随着大口黑鲈易摄食配合饲料新品种“优鲈3号”的培育以及配合饲料的逐渐成熟，大口黑鲈目前可全程摄食配合饲料。但在早期驯食(由桡足类等生物饵料向人工配合饲料的驯化)配合饲料过程中，部分个体拒食配合饲料，导致驯化成功率低。如何提高大口黑鲈驯食过程中的成功率是当前产业亟待解决的关键问题。

随着分子生物技术的快速发展，分子标记辅助育种技术有望是提高大口黑鲈驯食成功率和培育大口黑鲈优良品质的一种重要途径。分子标记辅助育种技术是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记，对目的基因进行筛选，从而不受环境条件的影响，增加了选择的可靠性，提高育种效率。单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism,SNP)指的是在基因组水平上单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列多态性，具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与驯食性状相关联，从而实现在DNA水平上进行选择育种，有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，提高驯食成功率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与大口黑鲈驯食性状相关的SNP标记及其应用，该分子标记可作为大口黑鲈驯食性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而提高选择驯食成功率，提高选育效率和准确性。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供与大口黑鲈食性驯化相关的SNP标记，所述SNP标记如SEQID NO.1所示，其中第448位R为碱基A或碱基G。

本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的SNP标记在鉴定或筛选易驯食的大口黑鲈中的应用。

本发明的第三方面，提供一种引物，所述引物用于检测本发明第一方面所述的SNP标记。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括SEQ ID NO.2序列和SEQ ID NO.3序列。

本发明的第四方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含检测本发明第一方面所述的SNP标记的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒包含本发明第三方面所述的引物。

本发明的第四方面，提供本发明第三方面所述引物或本发明第四方面所述试剂盒在鉴定或筛选易驯食的大口黑鲈中的应用。

本发明的第五方面，提供一种鉴定或筛选易驯食的大口黑鲈的方法，检测本发明第一方面所述的SNP标记，选择SEQ ID NO.1序列的第448位的SNP位点基因型为AA基因型的大口黑鲈作为易驯食的大口黑鲈。

在本发明的一些实施方式中，提取大口黑鲈DNA，采用SEQ ID NO.2序列和SEQNO.3序列的引物对大口黑鲈DNA进行扩增，得到PCR产物，将所述PCR产物测序分析，选择SEQID NO.1序列的第448位的SNP位点基因型为AA基因型的大口黑鲈作为易驯食的大口黑鲈。

在本发明的一些实施方式中，得到的PCR产物用延伸引物进一步延伸扩增；所述延伸引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果是：

本发明通过对测序得到的RDH12基因序列进行分析，筛选该基因SNP位点并对易驯食和不宜驯食大口黑鲈个体进行分型，并与大口黑鲈的驯食性状进行关联分析，从而得到与大口黑鲈食性驯化相关的SNP位点，所述SNP标记如SEQ ID NO.1所示，其中第448位R为碱基A或碱基G，并提供了检测该SNP标记的引物、试剂盒和检测方法；可用于快速筛选易驯食大口黑鲈，为培育大口黑鲈易驯食人工配合饲料新品种提供理论依据。

附图说明

图1为chr15-A+8322808G标记基因型检测图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1与大口黑鲈食性驯化相关的SNP标记的获得

本申请研究发现，大口黑鲈RDH12基因序列如SEQ ID NO：1所示，其中448bp处有一个A/G型SNP位点，存在3种基因型AA、GG、AG。

CCCCTGCCTTTGTAGCCCCACAGGGCAGAAGTGAGGAGACAGCAAAGAGACTGTGGGACGTCAGCTGTGAGCTTCTTGGTATTGAGTGGGACTGATTCAACTTTTAACCACCATCTATCACTTCTCCAAGGAGTCCTTATTCTTTCCGTTGTCATTCATTTCATTATGGTTTTTGATGTTCTGTACGTTGAACGTTTCCTACCTAATAAGCAGTCAGGTAATACTGTAAGGGGTACTATAATGTGAAGTTGCTTTTTTTCTGTAATAATGCAGTAATTCCATTATATTAACTTGAGTATTTTGGTGCTCTACAACAGCTCCTCAAACCAAAACCACTCAACTGTATTATCATCTAACCACAAATAACTTTTTGACTCTATATTTTTGTGACACAATGTGAATACAGTGTAGGCAAAAAAGCAACTTGATGTATTTTAATGCTGTAGGRTACTGTGAAGGGTCAAGCCAGGGTAAATGACCAGCATCATTATCAAATATTCTGTTTTTTGATTTCTCTAGAATTTGCAGCTAGATTGCTTGAATTTTGTGCCAGCATTTCTAAACAATTGCAGGGGTTCTTACGGTGTTTCCAGGTTGATAAAAATGCTAGCAAACTATCTACTACTAGTCAGTCTGAGCCATGATTACCGCTTGAATTGCATAAATGTATTTTGTGATAATTGTAGTTGATATAGATTATAAGAAGGTTTTTCTATTTTAACCAAATCAAAGAAAGAGTCATGTCATTGCAATATTTGCAAAGAATTTTCTTTACATCTGCATTACCAAAACTGCACATTCCTGGAGGAACTGCAGTTTTGAATTTATTAGGATCTCCCTACTTATGTTTCCTTCTCAGCATTCACATGCAAGGTTGCCAAGAGTTTACATTCTGTGTTTTATACAAGTGAAACATGCCTTTTACTACACTTATATTCATGTTAAGAGTTGAATGTTTACATTTGATGTAAATAAACAGAAATATTACTATAAGGATGGATGTTTGTTTCAGTCCTTTGAAATTCTAGTTTGAGATCATCAAAATGCCATCAGCAAAGTACGAAGTGGGTTAGTGCACAA(SEQ ID NO.1)。

基于转录组测序数据，从RDH12基因中筛选到位于448位的A/G型SNP位点。重新选取一个驯食群体，剪取30尾大口黑鲈尾鳍用于验证该SNP位点。

1、将试验鱼剪取尾部鳍条提取基因组DNA

利用酒精消毒后的剪刀剪取大口黑鲈尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇中常温保存。通过海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)对鳍条基因组DNA进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，利用紫外分光光度计(Eppendorf，AG2231型)检测浓度，-20℃保存备用。

2、所述PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

F1：ACTGTATTATCATCTAACCACAA(SEQ ID NO.2)；

R1：GCAATTCAAGCGGTAATCA(SEQ ID NO.3)。

ACTGTATTATCATCTAACCACAA(SEQ ID NO.2)和GCAATTCAAGCGGTAATCA(SEQ IDNO.3)是扩增SNP位点的上下游引物。

3、结果

将PCR产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至广州艾基生物有限公司进行测序，对测序结果的SNP位点及其峰图进行统计，在测序序列中发现一个A/G型SNP位点，存在3种基因型AA、GG、AG。

实施例2SNP标记与大口黑鲈驯食性状的关联分析

1、引物序列

根据大口黑鲈RDH12基因的部分基因组序列SEQ ID NO:1所示，设计SNaPshot延伸引物：5'-CTGACTGACTTGATGTATTTTAATGCTGTAGG-3'(SEQ ID NO.4)。

2、将试验鱼剪取尾部鳍条提取基因组DNA

利用酒精消毒后的剪刀剪取大口黑鲈部分尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇中常温保存。通过海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)对鳍条基因组DNA进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，利用紫外分光光度计(Eppendorf，AG2231型)检测浓度，-20℃保存备用。

3、多重PCR扩增

1)将合成好的引物用1×TE溶解到10pmol，将一组中的引物加到引起，混匀，离心。

初次PCR体系如下：

其中F1与R1为1：1。

将上述配置的PCR总管分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2μl DNA样品，离心。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。

2)PCR产物纯化

PCR扩增后取3μlPCR产物用ExoI和FastAP纯化，ExoI主要作用为去除反应产物中的剩余引物，FastAP主要作用为去除反应产物中剩余的dNTP。体系如下：

反应条件为：37℃15min，80℃15min，纯化好后进行延伸反应，预先混合延伸引物。

3)延伸反应

延伸反应体系如下：

反应条件为：

4)取1μl延伸引物，加入10μl上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪。

在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测(图1)，确定待测样本的RDH12基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第448位碱基处的SNP位点为AA、GG或AG。

检测SNP位点在240尾大口黑鲈的等位基因和基因型频率，检测结果见表1所示。

表1大口黑鲈RDH12中SNP位点在随机群体中频率分布

用SPSS 22.0卡方检验分析，分析SNP位点的不同基因型与大口黑鲈驯食性状之间的关联性。按照鱼苗对配合饲料的接受程度来判定是否驯化成功，在投喂饲料半个小时后，将腹部饱满的鱼苗定义为易驯食组(易驯食个体的腹部内容物/体重在18％～24％)，反之则认为是不易驯食组(不易驯食个体的腹部内容物/体重在8％～12％)。该位点与大口黑鲈驯食性状的关联分析结果见表2所示。

表2大口黑鲈RDH12中SNP位点与驯食性状关联分析

以上数据可知，大口黑鲈RDH12基因SNP位点与驯食性状显著相关。其中，AA基因型为易驯食大口黑鲈的优势基因型。

综上所述，RDH12基因A-G型SNP位点与大口黑鲈食性驯化密切关联。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 大口黑鲈食性驯化相关的SNP标记及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 大口黑鲈

<400> 1

cccctgcctt tgtagcccca cagggcagaa gtgaggagac agcaaagaga ctgtgggacg 60

tcagctgtga gcttcttggt attgagtggg actgattcaa cttttaacca ccatctatca 120

cttctccaag gagtccttat tctttccgtt gtcattcatt tcattatggt ttttgatgtt 180

ctgtacgttg aacgtttcct acctaataag cagtcaggta atactgtaag gggtactata 240

atgtgaagtt gctttttttc tgtaataatg cagtaattcc attatattaa cttgagtatt 300

ttggtgctct acaacagctc ctcaaaccaa aaccactcaa ctgtattatc atctaaccac 360

aaataacttt ttgactctat atttttgtga cacaatgtga atacagtgta ggcaaaaaag 420

caacttgatg tattttaatg ctgtaggrta ctgtgaaggg tcaagccagg gtaaatgacc 480

agcatcatta tcaaatattc tgttttttga tttctctaga atttgcagct agattgcttg 540

aattttgtgc cagcatttct aaacaattgc aggggttctt acggtgtttc caggttgata 600

aaaatgctag caaactatct actactagtc agtctgagcc atgattaccg cttgaattgc 660

ataaatgtat tttgtgataa ttgtagttga tatagattat aagaaggttt ttctatttta 720

accaaatcaa agaaagagtc atgtcattgc aatatttgca aagaattttc tttacatctg 780

cattaccaaa actgcacatt cctggaggaa ctgcagtttt gaatttatta ggatctccct 840

acttatgttt ccttctcagc attcacatgc aaggttgcca agagtttaca ttctgtgttt 900

tatacaagtg aaacatgcct tttactacac ttatattcat gttaagagtt gaatgtttac 960

atttgatgta aataaacaga aatattacta taaggatgga tgtttgtttc agtcctttga 1020

aattctagtt tgagatcatc aaaatgccat cagcaaagta cgaagtgggt tagtgcacaa 1080

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actgtattat catctaacca caa 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaattcaag cggtaatca 19

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgactgact tgatgtattt taatgctgta gg 32

Claims (10)

1.与大口黑鲈食性驯化相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记如SEQ ID NO.1所示，其中第448位R为碱基A或碱基G。

2.权利要求1所述的SNP标记在鉴定或筛选易驯食的大口黑鲈中的应用。

3.一种引物，所述引物用于检测权利要求1所述的SNP标记。

4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物包括SEQ ID NO.2序列和SEQ IDNO.3序列。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1所述的SNP标记的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3或4所述的引物。

7.权利要求3～4任一项所述引物或权利要求5～6任一项所述试剂盒在鉴定或筛选易驯食的大口黑鲈中的应用。

8.一种鉴定或筛选易驯食的大口黑鲈的方法，其特征在于，检测权利要求1所述的SNP标记，选择SEQ ID NO.1序列的第448位的SNP位点基因型为AA基因型的大口黑鲈作为易驯食的大口黑鲈。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，提取大口黑鲈DNA，采用SEQ ID NO.2序列和SEQ NO.3序列的引物对大口黑鲈DNA进行扩增，得到PCR产物，将所述PCR产物测序分析，选择SEQ ID NO.1序列的第448位的SNP位点基因型为AA基因型的大口黑鲈作为易驯食的大口黑鲈。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，得到的PCR产物用延伸引物进一步延伸扩增；所述延伸引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

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