CN111910009A - 一种影响鸡法氏囊指数的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种影响鸡法氏囊指数的分子标记及其应用，属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域。本发明所述的分子标记是通过对大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡组建的F2代资源群体741只试验鸡进行全基因组关联(GWAS)分析得到，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本3号染色体上的第33788344bp处有一个T>C的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.333788344T>C)，定位在其附近的基因为细胞运动介质1（mediator of cell motility 1，MEMO1）基因，突变显著影响了鸡的法氏囊指数。本发明公开了该分子标记的获得及应用。本发明还提供了一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法，利用该方法对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡免疫性能遗传改良中，从而提高鸡的免疫性能。

Description

一种影响鸡法氏囊指数的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域，特别涉及一种影响鸡法氏囊指数的分子标记及其应用。

背景技术

我国是世界上的养鸡大国，每年出栏家鸡超过80亿羽，因疾病而导致家鸡生产的经济损失约300亿元。家禽免疫性能直接影响家禽疾病的发生，研究家禽免疫性状的遗传机制可为抗病育种奠定基础。尤其是有效利用一些地方品种具有较强的抗病性状开展抗病育种，筛选和培育出抗病品种(系)，从根本上提高家鸡抗病能力对于全面提高养鸡业生产水平和效益尤为重要。随着高通量测序技术的发展，大量的研究探索了家禽抗病性状的遗传机制，筛选和鉴定了与抗病性和抗逆性相关的候选基因和分子标记，以及涉及到的信号通路。但免疫性状由于测定成本高、病原类型多变等原因，免疫性状的功能基因鉴定仍是难点。

免疫系统是动物机体实现免疫功能的主要方式，机体的免疫系统是动物机体在长期的进化过程中形成的相互作用的细胞网络，是机体形成的一个比较完备的重要防御体系，其中包括免疫分子、免疫细胞和免疫器官。其中，胸腺、法氏囊、脾脏作为禽类主要的免疫器官，是家禽执行免疫功能的重要结构。且免疫器官指数反映了机体主要免疫器官的生长发育程度，是衡量免疫功能的重要指标，免疫器官指数的提高意味着免疫系统成熟快。其中，法氏囊是禽类的中枢免疫器官，可产生B淋巴细胞，从而产生特异性抗体来完成特定的免疫应答。因此，法氏囊指数是家鸡免疫性能选育中重要的表型性状。

在当前畜牧业饲料端全面禁抗，养殖端也进入减抗、限抗时代，采用全基因组关联分析的方法，开展以抗病性为重点的相关遗传机理研究，找到与家鸡法氏囊指数相关的SNP分子标记，深入挖掘地方鸡抗病性状的功能基因和多态位点，可促进抗病性状选育进度，进而节省新品系选育的成本，支撑家禽产业持续健康发展。发明内容

鉴于以上研究背景，本发明的首要目的在于提供一个与鸡法氏囊指数相关的SNP分子标记及其应用。本发明基于云南地方鸡种与隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，运用全基因组关联分析的方法寻找与鸡法氏囊指数相关的SNP分子标记，以此作为鸡法氏囊指数相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述影响鸡法氏囊指数的分子标记在鉴定鸡免疫性能和遗传育种中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法。

本发明的第四个目的在于提供一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型在鉴定鸡免疫性能中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种影响鸡法氏囊指数的SNP分子标记的获得方法，其在于下列步骤：

1)组建大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，获得741只试验鸡，均于90日龄时测定法氏囊指数；

2)提取F2代群体鸡基因组DNA；

3)构建DNA文库，进行全基因组重测序；

4)对测序原始数据质控、过滤后，利用BWA、Samtools等软件进行SNP检测；

5)结合法氏囊指数表型数据，采用GEMMA软件进行表型和基因型以及协变量的关联分析，确定与鸡法氏囊指数相关联的SNP。利用ANNOVAR软件对目标区域内的基因进行功能注释；

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与鸡法氏囊指数相关联的SNP分子标记，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本3号染色体上的第33788344bp处有一个T>C的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.3 33788344T>C)，定位在其附近的基因为细胞运动介质1(mediator of cell motility 1，MEMO1)基因，突变显著影响了鸡的法氏囊指数。

所述的影响鸡法氏囊指数的分子标记在鉴定鸡法氏囊指数和遗传育种中应用。

一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；若Chr.3 33788344T>C为T碱基，则为TC基因型；若Chr.3 33788344T>C为C碱基，则为CC基因型。

采用的特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-TGTTTTGGGGAGGGGTTTGT-3’；

下游引物primer-R：5’-TCCTGCACCACTTCTTTGCT-3’。

一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型在鉴定鸡免疫性能中的应用：所述的基因分型是利用上述影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法获得。

一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用，其特征在于：所述的基因分型是利用上述影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法获得，淘汰CC基因型，保留TC基因型，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而提高后代鸡的免疫性能。

所述的种鸡优选为大围山微型鸡。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明研究并确定影响法氏囊指数相关的分子标记，验证其对法氏囊指数的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡免疫性能的遗传改良中，从而提高选择强度，降低育种周期，进而提高育种效率，降低育种成本。

附图说明

图1为在鸡3号染色体上关于法氏囊指数的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2为有关鸡法氏囊指数主效突变位点Chr.3 33788344T>C不同基因型的测序结果峰图；

其中(a)表示基因型为TC型的测序结果峰图，(b)表示基因型为CC型的测序结果峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实验例1实验鸡群饲养与法氏囊指数测定

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群体是由大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡杂交而来的F2代资源群体。

F0代是从大围山微型鸡(来源于云南农业大学实习鸡场)和隐性白洛克肉鸡(来源于昆明云岭广大种禽饲料有限公司)分别选取种鸡，所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正。大围山微型鸡一个未经选育的小型鸡种，其个体小(平均体重0.7-1.2kg)、耗料少、基础代谢低等优点，是培育优质、节粮型家鸡新品种(系)的优良素材。隐性白洛克肉鸡属于快大白羽肉鸡，是从白洛克中选育而成，其羽毛的白色为隐性性状。

大围山微型鸡-隐性白洛克肉鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建正交系和反交系各4个，正交系：大围山微型鸡♂×隐性白洛克肉鸡♀；反交系：隐性白洛克肉鸡♂×大围山微型鸡♀。正交系和反交系均按照公母鸡1：3比例配组而成。F0代采用人工授精共产生F1后代数为正交80只，反交146只。正交系挑选公母鸡各20只(1:1配对)进行F1代的横交，反交系挑选公母鸡各30只(1:1配对)进行F1代的横交，得到F2代资源群741只鸡，其中正交259只，反交482只。

(2)饲养实验

试验鸡于云南农业大学实习鸡场进行饲养，饲养至12周龄。日粮饲喂分为两个阶段：0-4周龄为雏鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.00MJ/Kg，粗蛋白为19.80％；5-12周龄为生长鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.10MJ/Kg，粗蛋白为18.00％。

(3)法氏囊指数测定

试验鸡于12周龄早晨进行屠宰，活重及法氏囊称重，计算法氏囊指数，测定前12小时停止提供日粮和饮水。

实验例2影响鸡法氏囊指数的分子标记的获得

(1)血液样品采集

采用含有EDTA-二钾的真空采血管进行试验鸡翅静脉采血。

(2)基因组DNA的提取及鉴定

采用Gentra Puregene Blood Kit(Qiagen)柱式离心法试剂盒提取血液基因组DNA，待DNA完全溶解后用NannoDrop核酸分析仪检测其浓度，并在1％琼脂糖凝胶电泳条件下检测DNA条带的完整性。

(3)DNA文库构建与测序

文库的构建利用NEBNext DNA library kit(NewEnglandBiolabs)完成，具体操作步骤为：首先将基因组DNA随机打断成小片段，然后在长度为500bp左右的片段上连接上Illumina双末端接头，经过PCR扩增和纯化后得到DNA文库，使用Illumina Hiseq 2500高通量测序仪对试验样本进行测序。

(4)基因组内变异检测

1)数据质控

对测序得到的原始reads，我们首先利用FastQC软件对数据的质量进行质量分析。根据数据的质量，我们接下来利用NGSQC Toolkit对原始reads进行质控，主要剔除在建库和测序中残留的引物和接头和质量较低的reads。

2)测序reads比对和变异检测

采用Ensembl数据库中原鸡基因组Gallus_gallus.GRCg6a，利用BWA软件对参考基因组构建索引。将质控之后的高质量reads利用BWA-MEM比对到鸡的参考基因组上，利用Picard软件将比对后的SAM文件转换成二进制的BAM文件，再利用Samtools软件按照参考基因组的物理位置信息对比对好的BAM文件进行排序，并进行SNP分析，得到SNP数据集。

3)全基因组关联分析

GEMMA(http://www.xzlab.org/software.html)是一款专门用于GWAS分析的软件，利用该软件采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)同时对群体结构和个体亲缘关系进行校正，性别作为固定效应，同时减少计算时间。使用GEMMA对群体的法氏囊指数进行关联分析，筛选出潜在的符合哈迪-温伯格平衡检验P＜1×10-6(卡方检验)和最小等位基因频率(MAF)≤0.05的SNP。

4)基因组变异的功能注释

基于Ensembl数据库中的鸡基因组注释信息，利用ANNOVAR软件对所检测到的所有SNP变异进行注释。

(5)不同基因型与法氏囊指数的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点Chr.3 33788344T>C与法氏囊指数极显著相关(P<0.001)，在其附近区域的基因是细胞运动介质1(mediator of cell motility 1，MEMO1)基因，说明此分子标记显著影响鸡的免疫性能，可通过对此SNP位点的辅助选择，提高鸡的免疫性能，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，TC型比CC型的平均法氏囊指数高(未发现TT基因型)，说明纯合子CC对平均法氏囊指数是最不利的。通过表2进一步得知，杂合子TC与纯合子CC基因型法氏囊指数显著差异，这进一步说明杂合子TC对法氏囊指数最有利，可提高鸡的免疫性能。因此，CC基因型的鸡的免疫性能是最差的，在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种鸡，保留TC型的种鸡，以逐代提高该杂合基因型的频率。

表1 分子标记的SNP位点Chr.3 33788344T>C与法氏囊指数的相关性

表2 分子标记的SNP位点Chr.3 33788344T>C不同基因型组间差异性

实验例3一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群群体为云南农业大学的90日龄大围山微型鸡种鸡200只(公母各100只)，为种鸡核心群。进行屠宰实验，取法氏囊称重，计算法氏囊指数。

(2)目的DNA序列扩增及测序

1)引物设计

通过NCBI网站下载鸡的3号染色体的DNA序列，并利用引物设计软件primerpremier 6.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-TGTTTTGGGGAGGGGTTTGT-3’；

下游引物primer-R：5’-TCCTGCACCACTTCTTTGCT-3’。

2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1.0μL，双蒸水10.5uL，2×TSINGKE^TM Master Mix12.5μL，引物primer-F和primer-R各0.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50-68℃退火30s，72℃延伸30s，经35个循环，72℃延伸7min，4℃保温。

3)DNA序列测定

最后对PCR扩增后的产物进行测序，基因片段测序要求为双向测通。

测序结果如SEQ ID NO:1所示。

注：序列表中N为突变位点。

(3)分子标记的SNP位点g.463T>C基因型分析

根据表3可知，大围山微型鸡种鸡中分子标记的SNP位点g.463T>C基因型TC型比CC的平均法氏囊指数高，说明杂合子TC对平均法氏囊指数是最有利的。这进一步说明杂合子TC可提高鸡的免疫性能。

表3 分子标记的SNP位点g.463T>C不同基因型法氏囊指数差异

实施例4分子标记的SNP位点g.463T>C效应分析

本发明提供一个能显著提高鸡生长发育SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快鸡免疫性能育种进程。若本发明将影响鸡免疫性能的分子标记的CC型个体全部选育成TC型个体，则大围山微型鸡种鸡群体平均法氏囊指数可以提高0.0187％，可显著提高种鸡的免疫性能。

本SNP分子标记个体中，通过优选云南地方鸡该SNP的优势等位基因(T)，可最终实现提高商品鸡的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种影响鸡法氏囊指数的分子标记

<130> 2020-7-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<220>

<221> misc_feature

<222> (463)..(463)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

tgttttgggg aggggtttgt attctgaaac tgaagtggtt tcaggtttta aaacagctta 60

ggagtatgat cttatcaagt gaactatagc tcgaaaacat ccttttaaaa cattctgcaa 120

attgttagca agtcctaaga cactttaaga tgtcagttca attacagcct tttttctttt 180

gcttataagc cataaggatg agtttactat tattcctgtg ttggtcggag cactgagtga 240

ggcaaaagag caggaatttg gaaaactctt cagtaaatac ctagcagatc ctagtaacct 300

ctttgtggtt tcttctgact tttgccactg gggtaagttt cacatctctt catgacagca 360

gtgtgattaa tgtttttgta tttacttttt taaaatgtat ttcattgaac acattttgac 420

attttaactt ttggtaaatg tatatttgag acttaaatat gtntgtaaag caaaaaaaaa 480

aagttggagc aatagacaaa aacagaatga taatatattt ttcagtgtag caaagaagtg 540

gtgcagga 548

Claims (6)

1.一种影响鸡法氏囊指数的SNP分子标记，其特征在于：所述分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本3号染色体上的第33788344 bp 处有一个T>C 的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.3 33788344T>C)，定位在其附近的基因为细胞运动介质1（mediatorof cell motility 1，MEMO1）基因，突变显著影响了鸡的法氏囊指数。

2.权利要求1所述的分子标记的在鉴定鸡免疫性能和遗传育种中的应用。

3.一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法，其特征在于：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；若Chr.333788344T>C为T碱基，则为TC基因型；若Chr.3 33788344T>C为C碱基，则为CC基因型。

4.根据权利要求3所述的一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型检测方法，其特征在于：特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-TGTTTTGGGGAGGGGTTTGT-3’；

下游引物primer-R：5’-TCCTGCACCACTTCTTTGCT-3’。

5.一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型在鉴定鸡免疫性能中的应用，其特征在于：所述的基因分型是利用权利要求3或4的方法获得的。

6.一种影响鸡法氏囊指数的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用，其特征在于：所述的基因分型是利用权利要求3或4的方法获得的，淘汰CC基因型，保留TC基因型。

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