CN108251418B

CN108251418B - 与肉鸡生长速度相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108251418B
Application number: CN201810150009.9A
Authority: CN
Inventors: 文杰; 刘冉冉; 赵桂苹; 郑麦青; 王杰; 李庆贺; 崔焕先
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-02-13
Also published as: CN108251418A

Abstract

本发明提供了一种与肉鸡生长速度相关的SNP分子标记及其应用。本发明的SNP分子标记包括两个SNP位点，在Ensemble数据中库分别对应鸡INSR基因rs16212279和rs314213038，可分别通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2和3‑4所示的引物对扩增得到。本发明提供了一种利用所述两个SNP位点鉴别生长速度快速、中速、慢速鸡种的方法，本发明还提供了利用两个SNP位点鉴别小型白羽肉鸡与地方优质鸡种或引进快速白羽肉鸡的方法，本发明方法操作简单，灵敏度高，准确性强，检测成本低，具有重要应用价值。

Description

与肉鸡生长速度相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与肉鸡生长速度相关的SNP分子标记及该SNP分子标记在鉴别生长速度快或慢肉鸡品种及产品中的应用。

背景技术

我国肉鸡年出栏量超过100亿只，居世界第一位。鸡肉是我国第二大肉类产品，占肉类产量百分比持续提高，已从1980年的占比7.9％上升到2016年的17.1％。我国鸡肉产品主要来源于白羽肉鸡和黄羽肉鸡。白羽肉鸡主要是引进的快大型白羽肉鸡；黄羽肉鸡是指肉用地方品种及其培育品种，其各占肉鸡出栏量的近50％。简单来讲分为快速、中速和慢速型三类。

随着育种技术的发展，利用分子标记进行辅助选择是理想方法之一，可以实现目标性状的早期选择，实现与形状相关等位基因的快速纯合，加快育种进展。SNP(SingleNucleotide Polymorphism)作为第三代遗传标记与其他分子标记相比具有较大的优越性：SNP数量多，分布广泛；SNP适于快速、规模化筛查；SNP等位基因频率的容易估计；易于基因分型。在当前家禽饲养成本(饲料、人工、环境控制等)急剧飙升的大背景下，利用分子标记辅助选择法对复杂性状进行选择提高，即可节省新品系选育的成本，又可以提高配套制种的成功率。

SNP标记的另一个重要应用就是客观的鉴别种群特征。由于疫病防控的需要，活禽交易会最终退出市场，因此相关的SNP标记也将为生鲜鸡产品追溯技术的建立提供支持。例如817肉鸡小型白羽肉鸡，其是利用快速型白羽肉鸡的父母代父系公鸡与商品代海兰蛋鸡母鸡(长速为慢速品种)杂交生产的。由于其配套制种模式的特殊性，具有节约制种成本、生产方式灵活、经济效益较高的特点。现阶段，市场上小规格817鸡为35-42日龄出栏，1.0kg左右；大规格为1.5kg左右斤，需要49-56日龄出栏。该鸡肉产品常常被用来仿冒慢速或偏中速型优质鸡产品，因此，特别需要开发有效的生鲜鸡品种追本溯源方法，来规范生鲜鸡产品市场，更好地保护消费者权益。

发明内容

本发明的目的是提供一种与肉鸡生长速度相关的SNP分子标记及其应用。

本发明的另一目的在于提供鉴别生长速度快肉鸡品系的方法。

本发明的再一目的在于提供鉴别生鲜鸡产品的方法。

本发明提供的一种与肉鸡生长速度相关的SNP分子标记，位于胰岛素受体基因(INSR或称CTK-1)上。该基因在Ensemble数据库(https://www.ensembl.org/)中ID号为ENSGALG00000003579。本发明两个SNP为INSR基因内部两个SNP位点，在Ensemble数据中库分别对应在Ensemble数据中库分别对应鸡INSR基因rs16212279和rs314213038，其中rs16212279位于Chr.28:4135939(Gallus_gallus5.0)，其多态性为A/G，rs314213038位于Chr.28:4137541(Gallus_gallus5.0)，其多态性为G/A。

进一步地，本发明提供的SNP分子标记，rs16212279和rs314213038分别通过SEQID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增得到。

本发明提供了用于检测所述SNP分子标记的特异性引物对组合，含有SEQ IDNO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的引物对。

表1引物信息

本发明提供了上述SNP分子标记或所述特异性引物对组合在鉴别不同生长速度肉鸡品种基因型中的应用。

在本发明的实施例中，是利用所述的特异性引物对组合，PCR方法对待测鸡INSR基因rs16212279和rs314213038位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型。

若待测鸡的INSR基因rs16212279突变型G，同时rs314213038突变型A，则为肉鸡生长快速型相关优势等位基因型；两个位点优势基因型频率高低与慢、中、快速鸡种关联。

本发明提供了上述SNP分子标记或所述的特异性引物对组合在不同长速肉鸡品种鉴别中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或所述的特异性引物对组合在培育快速生长型肉鸡品系中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或所述的特异性引物对组合在生鲜鸡产品鉴别中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或所述的特异性引物对组合在鉴别小型白羽肉鸡与地方优质鸡种或引进快速白羽肉鸡中的应用。

本发明还提供了一种鉴别生长速度快的肉鸡品系的方法，利用所述的特异性引物对组合，PCR方法对待测鸡INSR基因rs16212279和rs314213038位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型，当rs16212279基因型为G，并且rs314213038基因型为A时，且两个位点优势基因型等位基因频率接近100％，说明待测品种为快速型肉鸡。

本发明利用分子标记技术检测上述两个SNP位点突变频率，在地方鸡种及优质型的培育品种中，两个SNP位点rs 16212279和rs314213038的等位基因突变型频率均小于50％，即快速型相关优势基因型G和A发生率较低。与之相反，快速型培育品种及引进的快大型白羽肉鸡，rs 16212279和rs314213038SNP位点的快速型相关优势基因型G和A趋于100％纯合的状态。通过聚类分析(见图1)发现生长速度最快的肉鸡品种聚集到一起；生长速度最慢的聚集到一起；生长速度中等的中速青脚麻鸡A、隐性白羽肉鸡和快速青脚麻鸡B聚集到一起。因此可以根据两个位点的优势等位基因频率将生长速度将各类肉鸡品种准确区分开来。本发明的方法操作简单，费用低廉，准确度高，在生长速度快的肉鸡育种以及生鲜肌肉产品的鉴别中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为利用rs314213038和rs16212279突变型发生频率进行PCA聚类区分快、中和慢速鸡群。

图2为利用rs314213038和rs16212279突变型等位基因频率进行PCA聚类分类小型白羽肉鸡/817肉鸡及其快速型父本和慢速型母本。

图3为利用rs314213038和rs16212279突变型等位基因频率进行PCA聚类区分小型白羽肉鸡/817肉鸡及其地方慢速鸡种和快速型白羽肉鸡品种。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1与肉鸡生长速度相关的SNP标记的获得

本发明通过全基因组重测序(whole genome re-sequencing)获得INSR基因内部在快慢速品种间存在差异的SNP位点。

随机挑选中国农业科学院北京畜牧兽医研究所国家级保种场北京油鸡原种96只，新广农牧育种场科宝肉鸡父系公鸡96只。测定生长速度表明，北京油鸡12周龄体重达1.2kg；而科宝肉鸡父系5周龄即可超过1.2kg。

试验鸡翅静脉采血，用于基因组DNA提取。对每个品种构建测序文库，具体方法为每个品种选取16个个体作为一个混池，通过凝胶电泳检测混池质量，使用Nextera DNA文库制备试剂盒(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)标准流程构建DNA文库。所有DNA文库在Hiseq2500(illunina lnc)平台测序。

最终获得96只北京油鸡、科宝肉鸡父系的基因组DNA。利用全基因组重测序结果比较，发现有两个SNP位点(rs 16212279和rs314213038)在胰岛素受体INSR基因的mRNA剪切识别区，且其突变频率在两品种中明显分化(见表2)。显示rs 16212279突变型G为快速型相关优势等位基因；rs314213038突变型A为快速相关优势等位基因；推断SNP位点rs16212279和rs314213038与生长速度关联。

表2重测序SNP位点信息和突变频率统计

实施例2利用分子标记检测区分不同生长速度的品种/品系

待测群分为中国地方品种、地方培育特色品系和引进快大白羽肉鸡品系三类。其中中国地方品种4个：包括广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡；地方培育品系3个：包括京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A(佛山新广公司)、青脚麻鸡快速系B(佛山新广公司)；引进快大型鸡品种3个：包括科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡。每个品质采集20-30只血液备用。DNA提取方法同实施例1。

PCR反应及序列测定方法：利用上下游引物，PCR扩增在BioThermocycler热循环仪中进行。PCR反应程序为：95℃10min,95℃30s，60℃30s，72℃50s，共32个循环；72℃10min。PCR反应体系以20μl计为：模板DNA 0.5μl，10pmol/μl上游引物、下游引物各0.5μl，2×Master mix 10μl，ddH2O 8.5μl。

采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序。检测rs314213038和rs16212279。结果见表3。

表3待测品种/品系SNP位点信息和突变频率统计

注备注：“--“表示纯系为慢速型，个体成年(120日龄)体重达不到2Kg；表中频率为突变型频率。

结果表明，(1)茶花鸡体型较小，生长缓慢，成年后(120日龄)体重在1kg左右；广西三黄鸡属于我国著名地方鸡种，120日龄体重在1kg左右，成年公鸡可以达到2kg；京星黄鸡矮脚系为优质型培育品系，体型较小，90日龄体重可达到1.5kg；仙居鸡体型较小，成年体重在1.5kg左右；溧阳鸡属于肉用型鸡种，90日龄成年体重在2.0kg以上；以上慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50％；

(2)青脚麻鸡为培育品系，有中速型A系，可在70日龄达到2kg；偏快速型B系，可在50日龄达到2kg；隐性白羽肉鸡属于中速型白羽肉鸡，在70日龄左右体重可达到2kg以上；以上中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50％并＜80％；

(3)科宝肉鸡和哈伯德肉鸡均为快速型白羽肉鸡，42日龄体重在2kg以上。两个SNP突变型频率均接近100％。

根据表3中所示的两个SNP位点突变频率，进行多品种PCA聚类分析明显可见，生长速度最快的肉鸡品种聚集到一起；生长速度最慢的聚集到一起；生长速度中等的中速青脚麻鸡A、隐性白羽肉鸡和快速青脚麻鸡B聚集到一起。由于快速青脚麻鸡B系和快速型科宝肉鸡非常相近，其在距离上也较近(见图1快速型、中速型和慢速型三类)。

地方鸡种及优质型的培育品种，两个SNP位点rs16212279和rs314213038的等位基因突变型频率均小于50％，即快速型相关优势基因型G和A发生率较低。与之相反，快速型培育品种及引进的快大型白羽肉鸡，rs16212279和rs314213038SNP位点的快速型相关优势基因型G和A趋于100％纯合的状态。通过聚类分析(见图1)可以根据生长速度将各类肉鸡品种准确区分开来。

实施例3利用分子标记鉴别817肉鸡

817肉鸡是利用快速型白羽肉鸡的父母代父系公鸡与商品代海兰蛋鸡母鸡(长速为慢速品种)杂交，生产的小型白羽肉鸡。本实施例的试验材料为海兰蛋鸡商品母鸡、快大型科宝肉鸡父母代父系公鸡和其后代817肉鸡血液样本，各30-40份，ACD抗凝，-20℃保存备用。DNA提取、PCR反应及序列测定分别参见实施例1和2。将三类鸡进行PCA聚类分析，发现三个鸡群呈现快大型白羽肉鸡和商品蛋鸡处在两端(见图2)，商品代817肉鸡处在中间的结果，与生长速度快慢相呼应。可能是本发明的两个SNP位点在快大型白羽肉鸡中，由于其生长速度受到高强度定向选择，两个位点的突变型等位基因频率均接近100％突变型，而在蛋鸡中未受到选择，两个位点突变型等位基因频率处于接近50％的状态，因此其杂交后代在rs16212279和rs314213038两个位点频率分别为58.3％和76.7％，突变频率属于中上水平。因此其与父母亲本聚类时可呈现明显的分化状态。同理，将817肉鸡与地方慢速鸡种或快大型白羽肉鸡进行聚类时，由于慢速地方鸡种在两个位点突变型均呈现低频的(<30％)突变，而快大白鸡呈现接近100％的突变型，所以也可以将817肉鸡其与其他慢速优质鸡和快大鸡明显区分(见图3)。因此，该标记位点由于在817父母亲本品系及不同长速鸡种中的突变频率均相对固定，所以可以作为817肉鸡与其他优质鸡或快大型白羽肉鸡区分的分子标记之一。

本发明各实施例鉴别需要的鸡参考品系位点信息可参考下表4。

表4不同鸡种及817肉鸡鉴别参考品种位点突变型等位基因频率

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与肉鸡生长速度相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP181110559.1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgtttccct ctggctctgt c 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggacgac cagcgttatt cta 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttggaatgt tatggcacag aagg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctggcaaa gtgcttacgg 20

Claims

1.用于检测SNP分子标记的试剂在制备鉴别快速生长型纯品系肉鸡基因型产品中的应用；所述SNP分子标记在Ensemble数据库中ID号为 ENSGALG00000003579分别对应鸡INSR基因中的rs16212279和rs314213038，其中rs16212279位于Chr.28:4135939，其多态性为A/G，rs314213038位于Chr.28:4137541，其多态性为G/A；所述肉鸡为广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡、京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A、青脚麻鸡快速系B、科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡；慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50%；中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50%并＜80%；快速型白羽肉鸡中两个SNP突变型频率＞80%并＜100%。

2.用于检测SNP分子标记的特异性引物对组合在鉴别纯品系快速生长型肉鸡基因型中的应用；所述SNP分子标记在Ensemble数据库中ID号为 ENSGALG00000003579分别对应鸡INSR 基因中的rs16212279和rs314213038，其中rs16212279位于Chr.28:4135939，其多态性为A/G，rs314213038位于Chr.28:4137541，其多态性为G/A；所述肉鸡为广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡、京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A、青脚麻鸡快速系B、科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡；慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50%；中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50%并＜80%；快速型白羽肉鸡中两个SNP突变型频率＞80%并＜100%。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对组合含有SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的引物对。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，利用所述的特异性引物对组合，PCR方法对待测鸡INSR 基因rs16212279和rs314213038位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，若待测鸡的INSR 基因rs16212279为突变型G，同时rs314213038为突变型A，则为肉鸡生长快速型相关优势等位基因型，两个位点优势基因型突变频率高低与慢、中、快速鸡种关联。

6.一种用于检测SNP分子标记的试剂在制备鉴别不同生长速度纯品系肉鸡品种产品中的应用；所述SNP分子标记在Ensemble数据库中ID号为 ENSGALG00000003579分别对应鸡INSR 基因中的rs16212279和rs314213038，其中rs16212279位于Chr.28:4135939，其多态性为A/G，rs314213038位于Chr.28:4137541，其多态性为G/A；所述肉鸡为广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡、京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A、青脚麻鸡快速系B、科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡；慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50%；中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50%并＜80%；快速型白羽肉鸡中两个SNP突变型频率＞80%并＜100%。

7.用于检测SNP分子标记的特异性引物对组合在不同生长速度纯品系肉鸡品种鉴别中的应用；所述SNP分子标记在Ensemble数据库中ID号为 ENSGALG00000003579分别对应鸡INSR 基因中的rs16212279和rs314213038，其中rs16212279位于Chr.28:4135939，其多态性为A/G，rs314213038位于Chr.28:4137541，其多态性为G/A；所述肉鸡为广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡、京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A、青脚麻鸡快速系B、科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡；慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50%；中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50%并＜80%；快速型白羽肉鸡中两个SNP突变型频率＞80%并＜100%。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对组合含有SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的引物对。

9.用于检测该SNP分子标记的特异性引物对组合在生鲜鸡产品鉴别中的应用；所述SNP分子标记在Ensemble数据库中ID号为 ENSGALG00000003579分别对应鸡INSR 基因中的rs16212279和rs314213038，其中rs16212279位于Chr.28:4135939，其多态性为A/G，rs314213038位于Chr.28:4137541，其多态性为G/A；

所述用于检测该SNP分子标记的特异性引物对组合含有SEQ ID NO.1-2和SEQ IDNO.3-4所示的引物对；

所述生鲜鸡为广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡、京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A、青脚麻鸡快速系B、科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡；慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50%；中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50%并＜80%；快速型白羽肉鸡中两个SNP突变型频率＞80%并＜100%。

10.一种鉴别生长速度快的肉鸡品系的方法，其特征在于，利用特异性引物对组合，PCR方法对待测鸡Ensemble数据库中ID号为 ENSGALG00000003579的INSR 基因rs16212279和rs314213038位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型， rs16212279基因型为G，并且rs314213038基因型为A；所述特异性引物对组合含有SEQID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的引物对；

所述肉鸡为广西三黄鸡、溧阳鸡、仙居鸡、茶花鸡、京星黄鸡矮脚系、青脚麻鸡中速系A、青脚麻鸡快速系B、科宝母系、哈伯德肉鸡、隐性白羽肉鸡；慢速型鸡种中两个SNP突变型频率均≤50%；中速型鸡种中两个SNP突变型频率均＞50%并＜80%；快速型白羽肉鸡中两个SNP突变型频率＞80%并＜100%。